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Methodenartikel

Wachrattenmodell eines ischämischen Schlaganfalls mit neuropsychiatrischen Komplikationen während einer siebentägigen Beobachtung

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DOI:

10.3791/69194

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19. Dezember 2025

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1Branch of the Shemyakin-Ovchinnikov Institute of Bioorganic Chemistry of the Russian Academy of Sciences, Russian Federation, 2Pushchino Branch of the Federal State Budgetary Educational Institution of Higher Education, Russian Biotechnological University (BIOTECH University), 3Shemyakin-Ovchinnikov Institute of Bioorganic Chemistry, Russian Academy of Sciences

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Das neue Modell des fokalen ischämischen Schlaganfalls bei wachen Ratten wird vorgeschlagen. Dies wurde erreicht, indem eine Luftembolie in die innere Halsschlagader der Ratten injiziert wurde. Die Entwicklung eines fokalen ischämischen Schlaganfalls wurde durch Hirnfärbung mit Triphenyltetrazoliumchlorid, Funktionstests und Bewertung physiologischer Parameter bestätigt.

Zusammenfassung

Das translationale Modell des experimentellen Schlaganfalls bei Ratten, induziert durch eine Gasembolie, wurde entwickelt, um die Entwicklung von Schlaganfällen zu klären und die neuroprotektiven Wirkung neuartiger Heilmittel und bewährter Medikamente zu bewerten. Das mäßig zeit- und arbeitsintensive Protokoll ermöglicht es, die Dynamik des schnellen Neuronentodes bei wachen Tieren zu beobachten, was eine einzigartige Gelegenheit bietet, die akute Schlaganfallphase, einschließlich Delirium, zu beurteilen sowie autonome Störungen wie Veränderungen des Blutdrucks, der Körpertemperatur und des atemtiefen Volumens zu überwachen. Atmosphärische Luft (100 μL) wurde durch eine Infusion durch einen Gefäßkatheter verabreicht, der retrograd über die äußere Halsschlagader über die äußere Halsschlagader mit einer Infusionspumpe eingesetzt wurde. Vierundzwanzig Stunden nach der Embolisation zeigen die Tiere stereotype Verhaltens-, motorische Defizite und histopathologische Unterschiede. Am siebten Tag des Experiments wurde eine signifikante Verbesserung des neurologischen Status beobachtet, und die Ergebnisse der Verhaltenstests näherten sich denen der Kontrollwerte. Gleichzeitig wird in der ischämischen Läsion ein Übergang von neutrophiler zu makrophagem Infiltration beobachtet. Das vorgeschlagene Modell kann in präklinischen Studien verwendet werden, da es die neuropsychiatrischen Komplikationen der Nachschlaganfallperiode sowie die entsprechenden physiologischen, funktionellen und histopathologischen Veränderungen reproduziert.

Einleitung

Ziel dieser Forschung war es, ein Modell des fokalen zereblämischen Schlaganfalls bei wachen Ratten zu entwickeln und die klinischen Aspekte des ischämischen Schlaganfalls beim Menschen so nahe wie möglich an das klinische Aspekt des ischämischen Schlaganfalls zu gelangen. Wie die Forschung von Söyland et al. zeigt, zeigten 62,6 % der Patienten signifikante Symptome eines ischämischen Schlaganfalls im Wachzustand, während nur 19 % einen Aufwachungsschlaganfall1 erlitten. Daher ist das Auftreten eines Wachzustands während der Hirnarterienembolisierung bei Tieren von größtem Interesse. Die klassischen Modelle, die für die Untersuchung des fokalen zerebralen ischämischen Schlaganfalls verwendet werden, umfassen folgende: transkranielle Okklusion, endovaskuläre Fäden-Okklusion der mittleren Gehirnarterie, embolische Okklusion, Endothelin-1-Okklusion und Photothrombose-Modell2. Klassische Modellierungsmethoden setzen Tiere den Auswirkungen von Anästhetika aus, was zu einer Verzerrung der Endpunkte im ischämischen Schlaganfallmodell führen kann. Isofluran wird in der Okklusionschirurgie umfangreich eingesetzt und gilt als die effizienteste Methode der Gasanästhesie 3,4,5. Das Ausmaß der zerebralen Beeinträchtigung nach der Okklusion der mittleren Gehirnarterie (MCAO) nach 24 Stunden wurde jedoch als umgekehrt proportional zur Dauer der Isofluran-Anästhesie bei Tieren festgestellt. Es wurde nachgewiesen, dass Isofluran auf über 1.000 isämiebezogene, differenziell exprimierte Gene (Expression6) wirkt, ein Faktor, der zu einem ischämischen Schlaganfallmodell führen kann, das nicht vollständig zuverlässig ist.

Eine Methodik der ischämischen Schlaganfallmodellierung bei Ratten ist die Injektion des Blutgerinnsels in die innere Halsschlagader7. Dennoch wurde die Induktion des ischämischen Schlaganfalls in diesem Modell eine Stunde nach der Katheterisierung mit Isofluran durchgeführt. Es ist denkbar, dass diese Vorkonditionierung die Entwicklung der neurologischen und physiologischen Folgen der Thrombusverabreichung gestört haben könnte.

Die alternative Methode zur Modellierung eines ischämischen Schlaganfalls durch Embolisierung der inneren Halsschlagader bei wachen Ratten, gefolgt von fokaler Hirnschädigung im mittleren Becken der Gehirnarterie, wird vorgeschlagen. Die Katheterisierung erfolgte 24 Stunden vor der Modellierung des ischämischen Schlaganfalls. Dies stellte sicher, dass die Wirkung der Embolusverabreichung nicht durch die Anästhesie beeinträchtigt wurde.

Das vorgeschlagene Modell verwendet weder Endothelin-18, Filament 9 noch geronnbares Pigment10 für Ischämie. Die Auswahl des Wirkstoffs, das den Ratten über einen Katheter verabreicht werden sollte, basierte auf der Annahme, dass diese Methode machbar sei, wodurch die Notwendigkeit entfiel, das Tier in einem stereotaxischen Rahmen zu fixierenund es zu betäuben.

Darüber hinaus ermöglicht das Modell die Beobachtung physiologischer und neurologischer Parameter bei Tieren unmittelbar nach der Embolisation; Alternative Methoden der ischämischen Schlaganfallmodellierung scheinen damit unvereinbar zu sein. In der Literatur werden die Endpunkte von Hirnschäden und neurologischen Beeinträchtigungen nach ischämischer Schlaganfallmodellierung meist 24 Stunden nach der Okklusion 11,12,13,14 bewertet.

Der Einsatz wacher Ratten in der ischämischen Schlaganfallmodellierung hat das Potenzial, als Ergänzung oder Alternative zum vorherrschenden klassischen Modell des fokalen ischämischen Schlaganfalls zu dienen. Dieser Ansatz ermöglicht eine umfassendere Untersuchung des neuroprotektiven Potenzials registrierter oder sich entwickelnder pharmazeutischer Wirkstoffe zur Behandlung des ischämischen Schlaganfalls.

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Protokoll

Die Studie wurde gemäß den Standardarbeitsverfahren des Labors durchgeführt und von der Bioethischen Kommission des Institutionellen Ausschusses für Tierpflege und -nutzung der Zweigstelle des Shemyakin-Ovchinnikov-Instituts für Bioorganische Chemie der Russischen Akademie der Wissenschaften genehmigt (Protokoll Nr. 1016/25, vom 17. Januar 2025). In dieser Studie wurden 28 männliche Sprague-Dawley (SD) Ratten im Alter von 10 bis 12 Wochen verwendet, mit einem durchschnittlichen Körpergewicht von 301 g und dem mikrobiologischen Status "Specific Pathogen Free" (SPF). Die Reagenzien und die verwendeten Geräte sind in der Materialtabelle aufgeführt.

1. Tiervorbereitung

  1. Verwenden Sie 28 männliche SD-Ratten, 10-12 Wochen alt, mit SPF-Status. Verwenden Sie 12 Tiere für die Scheingruppe und 16 Tiere, um einen ischämischen Schlaganfall mit zerebraler arterieller Gasembolie (CAE) zu modellieren.
  2. Sterilisieren Sie alle Instrumente 24 Stunden lang in der Desinfektionslösung (0,5 % Chlorhexidin-Biglukonat in 70 % Ethanol).
  3. Betäuben die Ratten durch eine intramuskuläre Injektion mit einer Mischung aus Tiletamin 15 mg/kg und Zolazepam 15 mg/kg + Xylazinhydrochlorid 10 mg/kg (nach institutionell genehmigten Protokollen).
  4. Stellen Sie sicher, dass das chirurgische Stadium der Anästhesie erreicht wurde: Berühren Sie den Augenwinkel des Tieres, kneifen Sie die Schwanzspitze des Tieres.
    HINWEIS: Das Tier gilt als betäubt, wenn nach diesen Manipulationen keine Reflexe beobachtet werden.
  5. Ziehe das Operationsfeld im ventralen Halsbereich ab.
  6. Fixieren Sie das Tier auf dem Operationsstand, indem Sie die Gliedmaßen und oberen Schneidezähne mit weichen Tourniquets fixieren.
  7. Schneiden Sie Polyethylenrohre mit 0,8 mm Durchmesser in 10 cm lange Röhren und drehen Sie dann eine etwa 5 mm breite Stabilisierungsspirale an der Spitze, indem Sie die Spitze des Polyethylenrohrs auf ein Metallrohr einfädeln und es in heißes Wasser (90 °C) tauchen. Füllen Sie den Schlauch mit Heparin (50 ME). Dichte das gegenüberliegende Ende der Spirale mit einem Stopfen aus einem Stück Angelschnur ab.
    HINWEIS: Der Katheter besteht aus medizinischen Polyethylenröhren. Vermeiden Sie das Knicken oder Einklemmen des Katheters.

2. Karotisarteriekatheterisation

  1. Machen Sie einen etwa 5 mm langen Schnitt an der Bauchseite des Halses des Tieres.
  2. Seziere den Nackenmuskel mit einer Pinzette. Öffnen Sie den Bereich, in dem die Halsschlagader in die äußere und innere Halsschlagader verzweigt.
  3. Finde die Arterie, die entlang der Luftröhre verläuft. Lösen Sie ihn vorsichtig mit einer Pinzette aus der Bindegewebescheide, ohne den Vagusnerv entlang der Arterie zu berühren.
  4. Verwenden Sie eine Pinzette, um einen Abschnitt der äußeren Halsschlagader zu isolieren.
  5. Setzen Sie eine temporäre Ligatur 3–5 mm caudal zur Bifurkation an der Arteria Halsschlagader gemeinsam.
  6. Legen Sie zwei Ligaturen an der äußeren Halsschlagader an, eine unmittelbar nach der Bifurkation und eine distale 4 mm von der Bifurkation entfernt.
    HINWEIS: Die Kathetereinführung erfolgt zwischen diesen beiden Ligaturen. Die unmittelbar nach der Bifurkation eingesetzte Ligatur fixiert den Katheter im Gefäß.
  7. An der inneren Halsschlagader wird eine temporäre Ligatur am Schädel zur Bifurkation der Arteria Halsschlagader gewöhnlich angebracht.
  8. Legen Sie nach der Bifurkation eine Ligatur auf die Arteria pterigopalatina.
    HINWEIS: Beim Anlegen der Ligaturen in den Schritten 2.7 und 2.8 kann eine Blutung aufgrund von Kollateralen auftreten, die hinter dem Hauptstamm der Halsschlagader verborgen sind. In diesem Fall sollten sie ligiert werden.
  9. Machen Sie mit einer Schere einen Schnitt in der äußeren Halsschlagader zwischen den Ligaturen. Führen Sie den vorbereiteten Katheter (Schritt 1.7) in das im Gefäß entstandene Loch ein und führen sie zur gemeinsamen Halsschlagader.
  10. Lösen Sie die distale Ligatur und schieben Sie den Katheter weiter nach unten im Gefäß, bis er in die Arteria halsschlagader gelangt. Binden Sie vorsichtig zwei Ligaturen an dem Abschnitt der äußeren Halsschlagader mit dem Katheter im Inneren. Setzen Sie die dritte Ligatur vor den Katheter und binden Sie sie ebenfalls zu.
    1. Befestigen Sie den Katheter mit Ligaturen am Polsterring. Entfernen Sie die Ligaturen aus der Halsschlagader und der äußeren Halsschlagader.
      HINWEIS: Beim Drücken des Katheters kann Blut aus dem Gefäß austreten.
  11. Im Falle von Blutaustritt aus dem Gefäß werden doppelte Ligaturen zwischen das Loch im Gefäß und die dritte Ligatur gelegt.
  12. Führen Sie den festen Katheter mit einem gerillten Nadelleiter zum Widerrist.
  13. Nähen Sie die ventrale Wunde mit 4.0-Nahtmaterial. Verwenden Sie eine durchgehende Naht.
  14. Nähen Sie die dorsale Seite der Haut mit 4,0-Nähmaterial fest um den Katheter herum. Verwenden Sie eine durchgehende Naht. Befestigen Sie ein Stück Klebegips außen am Katheter und befestigen Sie es an der Naht für eine sicherere Fixierung.
  15. Verabreichen Sie das Antibiotikum Ciprofloxacin in einer Dosis von 5 mg/kg intramuskulär.

3. Fokale zerebrale Ischämie-Modellierung bei Tieren der CAE-Gruppe

  1. Vierundzwanzig Stunden nach der Katheterisation der Ratten wird das Tier in einen wachen Zustand in den Labor-Immobilisator gelegt, damit der auf dem Widerrist angebrachte Katheter zugänglich ist.
  2. Setzen Sie eine Spritze mit 0,5 ml Kochsalzlösung (0,9 % NaCl) und einer 30-G-Nadel in die Infusionspumpe.
  3. Schließen Sie die Spritzennadel an einen leeren Polyethylenkatheter (100 μL Kapazität). Verbinden Sie das andere Ende des Polyethylenkatheters mit einem Adapter an den implantierten Katheter.
    HINWEIS: Die korrekte Katheterimplantation und das Fehlen eines Thrombuss werden nachgewiesen, wenn Heparin aus dem implantierten Katheter in den Luftkatheter übertragen wird, wodurch die Luft leicht komprimiert wird. Der Grund dafür ist, dass der Blutdruck der Ratte den Luftdruck im angeschlossenen Katheter übersteigt.
  4. Stellen Sie die Einspritzrate der Infusionspumpe auf 10 μL/min ein. Stellen Sie das Einspritzvolumen der Infusionspumpe auf 120 μL ein.
  5. Starte die Infusionspumpe. Injizieren Sie 100 μL Luft aus dem Polyethylenkatheter und 20 μL Kochsalzlösung (0,9 % NaCl).
    HINWEIS: Die Injektion dauert 10 Minuten. Beobachten Sie in diesem Moment das Tier. Während der Injektion kann das Tier Laute abgeben, nagen oder den Immobilisator graben.
  6. Nehmen Sie das Tier aus der Startsperre.
  7. Beurteilen Sie sofort den neurologischen Zustand des Tieres anhand einer 0-5-Skala: 0 = kein neurologisches Defizit, 1 = Unfähigkeit, das Vordergliedmaß vollständig zu bestrecken, 2 = Rotation, 3 = Verlust der Gliedmaßenstütze, 4 = kein spontanes Gehen bei niedrigem Bewusstsein und 5 = Tod.
    HINWEIS: Für eine ausführlichere Beschreibung siehe Quelle15. Es ist möglich, dass ein Tier unmittelbar nach der Luftverabreichung keine neurologische Beeinträchtigung zeigt. Dies deutet darauf hin, dass die Verstopfung nicht aufgrund der anatomischen Merkmale des Tieres oder erhöhtem Blutdruck aufgetreten ist.
  8. Das Tier wird vom Versuch ausgeschlossen, sofern keine neurologischen Symptome vorliegen.
    HINWEIS: Ratten mit CAE zeigen 1–4 Punkte auf der neurologischen Defizit-Skala. Meistens handelt es sich um den Verlust der Gliedmaßenstütze oder um kein spontanes Gehen mit einem depressiven Bewusstseinsniveau.
  9. Verabreichen Sie das Antibiotikum Ciprofloxacin in einer Dosis von 5 mg/kg intramuskulär.

4. Bewertung physiologischer Parameter

  1. Eine Stunde nach der CAE wird der neurologische Zustand des Tieres anhand einer 0-5-Punkte-Skala bewertet: 0 = kein neurologisches Defizit, 1 = Unfähigkeit, das Vordergliedmaß vollständig zu strecken, 2 = Rotation, 3 = Verlust der Gliedmaßenstütze, 4 = kein spontanes Gehen bei niedrigem Bewusstseinsniveau und 5 = Tod15.
    HINWEIS: Nach 1 Stunde zeigt das Tier möglicherweise keine Symptome mehr, da die Luftblase schnell wieder aufgenommen wird, was darauf hindeutet, dass die arterielle Embolisation unzureichend war.
  2. Schließen Sie das Tier aus dem Experiment aus, wenn neurologische Symptome 1 Stunde nach CAE auftreten (Ratten mit 0 Punkten auf der neurologischen Defizitskala15).
  3. Geben Sie das Antibiotikum Ciprofloxacin intramuskulär in einer Dosis von 5 mg/kg intramuskulär 24 und 48 Stunden nach CAE.
  4. Tiere aus der Scheingruppe und der CAE-Gruppe randomisieren, um physiologische Parameter zu bewerten.
  5. Wiege Tiere unmittelbar vor CAE und 3 Stunden, 24 Stunden, 4 Tage und 7 Tage nach CAE auf einer Sartorius-Waage mit Gramgenauigkeit.
  6. Missen Sie die rektale Körpertemperatur von Ratten unmittelbar vor CAE sowie 3 Stunden, 24 Stunden, 4 Tage und 7 Tage nach CAE mit einem digitalen Thermometer mit einem Betriebsbereich von 32 °C bis 42 °C.
  7. Missen Sie den systolischen Blutdruck und die Herzfrequenz unmittelbar vor CAE nicht-invasiv sowie 3 Stunden, 24 Stunden, 4 Tage und 7 Tage nach CAE mit einer Tail Cuff auf einem computergestützten System zur Erfassung von Blutdruck- und Atemwerten.
    1. Schalten Sie das Heizkissen ein und erhitzen Sie es auf 40 °C.
    2. Lege das Tier in den Immobilisator und positioniere ihn auf das Heizkissen. Lass das Tier 3-5 Minuten ruhig werden.
    3. Anschließend wird eine Manschette mit einem Sensor zur Messung der kardiovaskulären Parameter am Schwanz des Tieres 2–3 cm von der Schwanzbasis angebracht.
    4. Stellen Sie die Positionierung des Transducers direkt unter der ventralen Schwanzarterie ein.
    5. Stellen Sie sicher, dass das Signal stabil ist und die Herzfrequenz im Programm angezeigt wird. Fang an, das Signal aufzunehmen.
    6. Schalte den Manschettendruck ein.
    7. Zeichnen Sie den Puls und den systolischen Blutdruck auf, bis der Manschettendruck vollständig entweicht ist.
    8. Stellen Sie sicher, dass das Signal zur Wiederherstellung der Herzfrequenz des Tieres klar angezeigt wird.
    9. Wiederhole die Schritte 4.4.3-4.4.5. Noch zweimal und lasse das Tier aus dem Immobilisator.
    10. Berechnen Sie den durchschnittlichen Puls und den systolischen Blutdruck anhand von drei Messungen.
  8. Misse die Atemfrequenz und das Atemvolumen unmittelbar vor CAE sowie 3 Stunden, 24 Stunden, 4 Tage und 7 Tage nach CAE mit einem computergestützten System zur Erfassung von Blutdruck und Atemwerten.
    1. Sichern Sie das Tier in einer Hand in einer natürlichen Position für das Tier.
    2. Setzen Sie eine Maske mit einem Schlauch, der an der Nase des Tieres befestigt ist.
      HINWEIS: Es dauert eine Weile, bis das Tier sich daran gewöhnt hat, in die Maske zu atmen.
    3. Stellen Sie sicher, dass das Tier beruhigt ist.
    4. Atemfrequenz und Atemfrequenz für 10 Sekunden aufzeichnen.
    5. Stellen Sie sicher, dass das Tier während der Aufnahme weder seufzt noch geschluckt hat.
    6. Wiederhole die Schritte 4.5.2-4.5.3 noch zweimal.
    7. Berechnen Sie das durchschnittliche Atemfrequenzvolumen und die Atemfrequenz anhand von drei Messungen.
    8. Berechnen Sie das Atemminutenvolumen mit folgender Formel:
      Kleines Atemvolumen = Atemfrequenz × Atemvolumen.

5. Bewertung funktioneller und verhaltensbezogener Parameter

  1. Beurteilen Sie den neurologischen Zustand des Tieres anhand einer 0-5-Skala: 0 = kein neurologisches Defizit, 1 = Unfähigkeit, das Vordergliedmaß vollständig zu begradigen, 2 = Rotation, 3 = Verlust der Gliedmaßenstütze, 4 = kein spontanes Gehen mit niedrigem Bewusstsein, und 5 = Tod15.
  2. Beurteilen Sie die motorische Funktion und Koordination auf einem Rota-Stab unmittelbar vor CAE sowie 3 Stunden, 24 Stunden, 4 Tage und 7 Tage nach CAE.
    1. Trainiere die Tiere für Tests mit dem Rota-Stab-Gerät.
      1. Legen Sie das Tier für 5-30 Sekunden auf eine stationäre Rute.
      2. Tiere, die in der Lage sind, eine stationäre Stange mindestens 10 Sekunden festzuhalten, lassen sie etwa 30 Sekunden auf einer rotierenden Stange mit minimaler Beschleunigung laufen.
      3. Trainieren Sie die Tiere weiter, bis sie frei auf einer Stange stehen können, die sich mit angemessener Beschleunigung dreht.
    2. Setzen Sie die Tiere auf eine 7 cm große, rotierende horizontale Stange mit einer Mindestgeschwindigkeit von 1 U/min.
    3. Starte die Beschleunigung von 1 U/min alle 10 Sekunden bis zu einer Höchstgeschwindigkeit von 60 U/min.
    4. Notieren Sie die Zeit, in der die Ratte auf der rotierenden Stange war.
  3. Beurteile die Lokomotoraktivität der Ratten unmittelbar vor CAE sowie 3 Stunden, 24 Stunden, 4 Tage und 7 Tage nach CAE mit einem computergestützten System.
    1. Stellen Sie das Tier in die Mitte eines offenen Feldes und zeichnen Sie sich für 5 Minuten die zurückgelegte Strecke und die Aktivitätszeit der Ratte auf.
  4. Bewerten Sie die Griffkraft der Vordergliedmaßen 3 Stunden, 24 Stunden, 4 Tage und 7 Tage nach CAE mit dem Griffkraftmessgerät.
    1. Halten Sie das Tier am Schwanz fest und lassen Sie es die Stangen mit den Vordergliedmaßen greifen.
    2. Ziehen Sie das Tier parallel zum Gitter, bis die Ratte das Gitter loslässt.
    3. Mach drei Versuche und wähle das höchste Ergebnis aus.

6. Bewertung des S100-Calcium-bindenden Proteins B (S100b)-Niveaus

  1. Misse die Serum-S100b-Spiegel bei Ratten vor der CAE-Modellierung, 24 Stunden und 7 Tage nach CAE.
    1. Leg das Tier in den Labor-Tier-Immobilisator.
    2. Schalten Sie das Heizkissen ein und erhitzen Sie es auf 40 °C.
    3. Positionieren Sie das Tier in der Labor-Tiersperre auf dem Heizkissen. Warte 5 Minuten, damit das Tier sich beruhigen kann.
    4. Leg das Tier auf die Seite.
      HINWEIS: Die Schwanzvene sollte am Schwanz sichtbar sein.
    5. Führe einen intravenösen Katheter in die Kaudalvene.
    6. Nehmen Sie 1 ml Blut in ein 1,5 ml Rohr.
    7. Lass das Blut 40 Minuten bei Zimmertemperatur stehen.
    8. Zentrifugieren Sie die Blutprobe bei 4 °C für 15 Minuten bei 1500 x g.
    9. Sammeln Sie das Serum mit einer automatischen Pipette in ein separates 1,5-ml-Rohr.
      HINWEIS: Das Serum muss klar und transparent sein, ohne rote Vermischung von Erythrozyten.
    10. Analysieren Sie das Serum mit einem enzymgekoppelten Immunsorbent-Test (ELISA) mit einem geeigneten ELISA-Kit.

7. Katheterentfernung

  1. Die Katheterentfernung wird 24 Stunden nach der CAE durchgeführt, nach den Tests in Schritt 5.
    1. Platzieren Sie die Tiere für 1–2 Minuten in die Inhalationskammer mit einem angeschlossenen Gasanästhesiesystem und einem Sauerstoffkonzentrator, wobei Isofluran in der Kammer mit einem Volumen von 2,5–3,5 % und einer Sauerstoffzufuhr von 3 L/min zugeführt wird.
    2. Das Tier wird auf ein Heizkissen (37,5 °C) mit Maskengaszufuhr und Isofluran-Dosierungsmodus 2%–3 % mit einer Sauerstoffdurchflussrate von 1,0–2,0 L/min.
    3. Schneiden Sie die Fahne, ohne die Wundnaht zu durchtrennen oder den Katheter zu beschädigen.
    4. Reinigen Sie das äußere Ende des Katheters und behandeln Sie sie mit einer Desinfektionslösung (0,5 % Chlorhexidin-Biglukonat in 70 % Ethanol).
    5. Entfernen Sie die Naht der vorherigen Operation an der ventralen Seite des Halses. Durch den Schnitt verwenden Sie eine Pinzette, um die Katheterhelix vorsichtig zu isolieren.
    6. Ziehen Sie das lange Ende des Katheters durch den ventralen Schnitt heraus.
    7. Legen Sie eine Ligatur mit einem Knoten, ohne festzuziehen, an der äußeren Halsschlagader zwischen der Bifurkation und der Kathetereinführungsstelle an.
    8. Schneiden Sie vorsichtig die Knoten, die den Katheter verbinden, ziehen Sie den Katheter mit einer Pinzette heraus, ziehen Sie den Knoten am Gefäß fest und binden Sie ihn wieder fest.
    9. Schneiden Sie die Ligaturenden ab und nähen Sie die Wunde. Verwenden Sie eine durchgehende Naht.

8. Beurteilung der Färbung von Triphenyltetrazoliumchlorid

  1. Terminalanästhesie für 6 Tiere der Scheingruppe und 6 Tiere der CAE-Gruppe 24 Stunden nach der Okklusion sowie 6 Tiere aus der Scheingruppe und 10 Tiere der CAE-Gruppe am 7. Tag nach CAE mit intramuskulärer Injektion von Tiletamin 15 mg/kg und Zolazepam 15 mg/kg + Xylazinhydrochlorid 10 mg/kg.
  2. Überprüfen Sie, dass das chirurgische Stadium der Anästhesie wie in Schritt 1.3 beschrieben erreicht wurde.
  3. Führen Sie eine vollständige Blutprobe aus der Kaudalvena cava mit einer 2-ml-Spritze und einer 24-G-Nadel durch.
  4. Öffnen Sie das dorsale Gewölbe des Schädels, ohne das Gehirngewebe zu beschädigen.
  5. Untersuchen Sie die Dura Mater.
  6. Schneiden Sie das Gehirn mit einer Mikrotom-Klinge in 2 mm dicke Frontalschnitte, beginnend im Frontallappen.
  7. Legen Sie die Schnitte auf einen Objektträger.
  8. Legen Sie die Scheiben in eine 1%ige Triphenyltetrazoliumchlorid (TTC)-Lösung und setzen Sie sie 10–12 Minuten in einen Thermostat bei 37 °C.
  9. Untersuchen Sie alle Gehirnabschnitte. Beobachten Sie die Farbveränderung der TTC-Färbung.
    HINWEIS: Unbeschädigtes Gewebe färbt leuchtend rosa, während Gewebe mit Läsionen blassrosa färbt.
  10. Fotografiere die Scheiben von beiden Seiten.
  11. Fixiere die Scheiben in einer 10% neutralen Formalinlösung.
  12. Schätzen Sie die Fläche der fokalen Läsion in der Software für die wissenschaftliche Bildanalyse.

9. Beurteilung der Hämatoxylin- und Eosin-Färbung

  1. Dehydriere fixierte Gehirnschnitte in einer aufsteigenden Batterie von Ethanol (70 %, 80 %, 100 %).
  2. Weichen Sie getrocknete Scheiben in Paraffin ein und machen Sie Scheiben von 7 mm Dicke.
  3. Färben Sie die Schnitte mit Hämatoxylin und Eosin.
  4. Führen Sie mikroskopische Analyse von Schnitten mit einem Durchgangslichtmikroskop durch.

10. Statistische Analyse

  1. Führen Sie statistische Analysen im Statistikprogramm durch.
  2. Wenden Sie deskriptive Statistiken an (berechnen Sie den Mittelwert ± Standardfehler des Mittelwerts) und erstellen Sie Diagramme, um die Ergebnisse zu visualisieren.
  3. Nachdem Sie die Normalität jeder Gruppe überprüft haben, führen Sie mehrere Vergleiche mit Duncans Rangkriterium durch.
  4. Bestimmen Sie Unterschiede auf dem 5%-Signifikanzniveau.

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Ergebnisse

Überleben und Gesamtzustand
Unmittelbar nach der Verabreichung der Luftblase zeigten alle Ratten einen gestörten Zustand und ein ausgeprägtes Zittern für mehrere Sekunden, gefolgt von einer Einstellung aller motorischen Aktivitäten und Bewusstseinsverlust für 1–2 Minuten. Manche Tiere verloren nach der Wiedererwachung für 10–15 Minuten den Halt an ihren Pfoten.

Die Überlebensrate der Tiere 3 Stunden nach CAE lag bei 100 %, aber nach 24 Stun...

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Diskussion

MCAO ist eine gängige Methode zur Modellierung des fokalen ischämischen Schlaganfalls bei Ratten, die durch Thrombusbildung, lokalen Krampf der mittleren Großhirnarterie und vorübergehende Verschluss durch Filament2 erreicht wird. Ziel solcher Modelle ist (1) die fokale Apoptose des neuronalen Hirngewebes16 mit standardisiertem Läsionsvolumen und Bereich17 zu erreichen, (2) das neurologische Defizit von Tieren für 2–...

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Offenlegungen

Die Autoren haben nichts offenzulegen.

Danksagungen

Diese Studie wurde von der Russischen Wissenschaftsstiftung, Projektnummer 25-15-00037, unterstützt.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
3-Komponenten-Spritze mit einer 2-mL-Nadel  LEIKO52322223G
Aladdin EinzelinfusionspumpeWeltpräzisionsinstrumenteAL-1000
CiprofloxacinPharmavet38977445%-Lösung von Ciprofloxacin
Computerisiertes System PowerLab 8/35 ADInstruments3508-1090
DezinApteka.ru0,5 % Chlorhexidin-Biglukonat in 70 % Ethanol
Digitales ThermometerB.Well Swiss AGLOS 0413
Elektronisches Dynamometer-GriffkraftmessgerätBioMed Easy Technologies007231024415MC01
ELISA-Kit für S100 Calcium-bindendes Protein B (S100B)CLOUD-CLONE CORP. (CCC)SEA567Ra48T
AngelschnurDurchmesser: 0,9 mm
GasanästhesiesystemUGO BASILE 21100
GraphPad-StatistiksoftwarePrismav.10
RillennadelleiterFisher ScientificKatalog Nr. 11-0012,7 cm
HeparinEndopharm. Moskauer Endokrines Werk30122
ImageJNationale Gesundheitsinstitute und das Labor für optische und computergestützte Instrumentierung
InsulinspritzeSFM Krankenhausprodukte1603030,5 mL, U-100, 30G
Intravenöser KatheterKD MedicalG24
Isofluran (Isoflurin)Vetpharma100 mL, 1000 mg/kg
Labortier-Immobilisator für LabortiereOpen ScienceAE1001-R1
LichtmikroskopZEISSAxio Scope.A1
Lichtmikroskopie-ObjektträgerThermowissenschaftlich15442933
Medizinische Polyethylen-MikroschläucheScientific Commodities Inc.BB31695-PE/4Innendurchmesser 0,76 mm
Medizinische sterile MulltücherNeues Leben 45x29 CM
MikroröhreSARSEDT AG & Kompanie KGS0443781,5 mL
Mikropipetten-Eppendorf-Forschung plusEppendorf200 & Mikro; L
Objektträger mit dem MikroskopFisher Scientific11562203
Mikrochirurgische Pinzette (gebogen)Kazan Medizinische InstrumentenfabrikF0106
Mikrochirurgische Pinzette (gerade)RWD Life ScienceF11029-11
Mikrotome-KlingenThermowissenschaftlich3052835MX35 Premier+
MultikonditionierungssystemTSE-Systeme131202-10
Neutral gepuffertes FormalinHem1072024pH 6,8-7,2 
Nicht absorbierbarer chirurgischer NahtlavsanLintex2022-01
Augenschere bei der IridektomieCM InstrumenteAJ-410-05
SauerstoffkonzentratorBewaffnetYYT327009607F-3L
PhosphatpufferAMRESCO2120C462
Piptte-SpitzenServicebio200 & Mikro; L
Rattenbezogen von der Labortier-Baumschule" Puschchino" (www.spf-animals.ru), Shemyakin-Ovchinnikov Institut für Bioorganische Chemie der Russischen Akademie der Wissenschaften.
Kühllabor Multifunktionale ZentrifugeEppendorf5804 R
Rota-Rod Rotamex-5 COLUMBUS-INSTRUMENTE210426
Schere METZENBAUM Medstandart-InstrumentMT-H-256
Chirurgisches NahtmaterialREPROMED114/0042011124Kaproag 4/0
OperationstischVetKormTorgVETBOT STL-1, TD00472
TelazolZoetis67291350 mg/mL Tiletamin und 50 mg/mL Zolazepam in 5 ml
TriphenyltetrazoliumchloridDia-MTTC1809
XylazinNITA-FARM1512 % Xylazinhydrochlorid in 50 ml

Referenzen

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