Hier stellen wir ein Protokoll vor, um die Schritte zur Anastomosierung entweder des tiefen zervikalen Lymphknotens oder seines afferenten Lymphgefäßes mit der hinteren Gesichtsvene bei der Ratte klar zu definieren, den Einfluss anderer Variablen zu minimieren und die Durchführung chirurgischer Forschung zu standardisieren.
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Methodenartikel
Chirurgische Protokolle für die tiefe zervikale lymphovenöse Anastomose im Rattenmodell: Lymphknoten- und Lymphgefäßanastomosen
* These authors contributed equally
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Die tiefe zervikale lymphovenöse Anastomose (dcLVA) hat sich zu einer vielversprechenden Behandlungsstrategie für die Alzheimer-Krankheit (AD) entwickelt, die im Vergleich zu den derzeit begrenzten Behandlungsmöglichkeiten erhebliche Verbesserungen bietet. Der zugrundeliegende Mechanismus von dcLVA bleibt jedoch unklar. Obwohl die klinischen Studien noch nicht abgeschlossen sind, bieten Tiermodelle, die dcLVA simulieren, ein wertvolles Werkzeug zur Erforschung seines Mechanismus. Ziel dieser Studie ist es, ein standardisiertes Protokoll für die Erstellung von dcLVA-Modellen bei Tieren zu entwickeln, um die Grundlagenforschung zu erleichtern und klinische Herausforderungen anzugehen. Wir beschreiben die chirurgischen Verfahren und die wichtigsten Schritte zur Anastomosierung des tiefen zervikalen Lymphknotens (dcLN) und seines afferenten Lymphgefäßes (ALV) mit der Vena posterior facialis (PFV) und beschreiben diese beiden unterschiedlichen Operationsmethoden: die tiefe zervikale Lymphknoten-Venen-Anastomose (dcLnVA) und die tiefe zervikale lymphatische Gefäß-Venen-Anastomose (dcLaVA). Neben der Förderung der Lymphdrainage hilft uns der Vergleich dieser beiden Operationsmethoden auch, die Rolle des tiefen zervikalen Lymphknotens und des tiefen zervikalen Lymphsystems in der Pathogenese der Alzheimer-Krankheit zu verstehen und zu erforschen. Insgesamt trägt die vollständige und klare Darstellung des chirurgischen Verfahrens und der wichtigsten anatomischen Orientierungspunkte bei der Ratte dazu bei, das Operationsprotokoll zu standardisieren. Dies kann Störfaktoren minimieren und die interexperimentelle Variabilität reduzieren, wodurch eine solide methodische Grundlage für ein tieferes Verständnis der beteiligten Mechanismen gelegt wird.
Einleitung
Die Alzheimer-Krankheit (AD) ist eine allmählich fortschreitende neurodegenerative Erkrankung, die häufig zu einem kognitiven Verfall führt. Die charakteristischen pathologischen Merkmale der Alzheimer-Krankheit sind Amyloid-beta (Aβ)-Plaques und neurofibrilläre Verwicklungen, die durch abnormal phosphorylierte Tau-Proteine gebildet werden. Jüngste Forschungen über das lymphatische System des Gehirns haben neue therapeutische Wege für die Behandlung von Alzheimer eröffnet. Dieses System erleichtert die Drainage von Aβ aus der interstitiellen Flüssigkeit (ISF) in die Zerebrospinalflüssigkeit (CSF) und anschließend über die meningealen Lymphgefäße (mLVs) in die tiefen zervikalen Lymphknoten1. Im Jahr 2024 berichtete das Team von Professor Xie über den ersten Fall einer kognitiven Verbesserung bei einem Alzheimer-Patienten nach einer tiefen zervikalen lymphovenösen Anastomose (dcLVA) und leitete anschließend eine klinische Studie (NCT06530732)2.
Obwohl dcLVA als neuartiger Therapieansatz für die Alzheimer-Krankheit vielversprechende Aussichten für Patienten bietet, bedürfen die genauen Mechanismen, die den therapeutischen Effekten zugrunde liegen, einer weiteren Aufklärung3. Tiermodelle bieten eine unverzichtbare Plattform, um diese Mechanismen zu untersuchen. Ein umfassendes Verständnis der therapeutischen Mechanismen von dcLVA wird nicht nur unser Verständnis der AD-Pathogenese verbessern, sondern auch Operationstechniken optimieren, Behandlungsindikationen klären und letztendlich einen größeren klinischen Nutzen für die Patienten bringen.
Das Team von Professor Xie hat kürzlich ein dcLVA-Modell vorgestellt, das die Machbarkeit der Verbindung von Zuflüssen der Vena jugularis externa mit dem tiefen zervikalen Lymphknotendemonstriert 4. Die Beschreibung des Modells ist jedoch noch nicht ausreichend. Erstens ist die Beschreibung des tiefen zervikalen Lymphknotens (dcLN) und seiner umgebenden Anatomie unzureichend. Zweitens gibt es keine objektive, quantitative Beurteilung der postoperativen Durchgängigkeit. Noch wichtiger ist, dass es an detaillierten Beschreibungen der Schritte zur Anastomose von dcLN und Venen sowie an klaren und intuitiven Bildern und Videos mangelt, die für den Unterricht geeignet sind.
Angesichts der Tatsache, dass diese Technik eine komplizierte chirurgische Manipulation erfordert und die anatomischen Unterschiede zwischen Ratten und Menschen berücksichtigt werden, können Unterschiede in den chirurgischen Verfahren und technischen Details in Rattenmodellen zu erheblichen Diskrepanzen bei den experimentellen Ergebnissen führen. Daher ist es sowohl wichtig als auch dringend, die relevanten anatomischen Merkmale bei Ratten klar zu veranschaulichen und detaillierte technische Beschreibungen des Anastomosenverfahrens zu liefern. Solche Bemühungen sind unerlässlich, um die Reproduzierbarkeit und Standardisierung des chirurgischen Protokolls zu verbessern und so eine breitere Anwendung durch Forscher zu unterstützen und damit verbundene wissenschaftliche Untersuchungen voranzutreiben. Darüber hinaus sind angesichts der Vielfalt klinischer Operationstechniken, wie z. B. der Lymphknoten-zu-Venen-Anastomose und der lymphaticovenösen Anastomose, und des Potenzials für unterschiedliche Ergebnisse je nach chirurgischem Ansatz vergleichende Studien gerechtfertigt, um ihre relative Wirksamkeit zu bewerten. Als Antwort auf diese Herausforderungen stellen wir zwei hochgradig reproduzierbare dcLVA-Methoden vor: die tiefe zervikale Lymphknoten-zu-Venen-Anastomose (dcLnVA) und die tiefe zervikale lymphatische Gefäß-Venen-Anastomose (dcLaVA). Diese Methoden zielen darauf ab, den Prozess der Modellerstellung zu standardisieren und die anschließende Grundlagenforschung zu erleichtern.
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Protokoll
Diese Studie wurde mit Genehmigung des Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) der Harbin Medical University (Approval No. SYDW2025-037). Bei den Probanden handelte es sich um männliche Sprague-Dawley-Ratten (SD) mit einem Gewicht von 400-500 g und einem Alter von 12-14 Wochen, die vom Tierzentrum der Universität zur Verfügung gestellt wurden. Das Zentrum unterhält eine Einrichtung für spezifische Krankheitserreger (SPF) und erfüllt die nationalen Zuchtstandards.
HINWEIS: In dieser Studie werden hauptsächlich zwei Methoden der Anastomose zwischen der tiefen Halslymphe und den Venen untersucht. Herstellung einer chirurgischen Verbindung zwischen dem dcLN und der hinteren Gesichtsvene (PFV); Diese Technik wird als dcLnVA bezeichnet. Schaffung einer anatomischen Verbindung zwischen dem tiefen zervikalen Lymphgefäß (dcLaV) und dem PFV; Diese Technik wird als dcLaVA bezeichnet. Wir beschreiben beide mikrochirurgischen Verfahren im Detail, einschließlich ihrer operativen Methoden und der Bewertung nach der Anastomose.
1. Präoperative Vorbereitung
- Betäuben Sie die Ratte durch intraperitoneale Injektion von Natrium-Pentobarbital (50 mg/kg). Beobachte die Reaktionen der Ratte genau. Fahren Sie nur fort, wenn der Pedalreflex vollständig fehlt.
- Verabreichen Sie mit einer Nadel mit stumpfer Spitze langsam Evans-Blue (EB)-Lösung (ca. 60-100 μl/kg, 5%)5 in die Nasenschleimhaut einer einseitigen Nasenhöhle. Positionieren Sie die Ratte in einer halblateralen Liegeposition, wobei der Bauch nach oben und das EB-injizierte Nasenloch nach unten zeigt. Sichern Sie den Kopf, um zu verhindern, dass EB in das kontralaterale Nasenloch oder die Atemwege gelangt.
- Rasieren Sie die Haare am Hals der Ratte, um ein klares Operationsfeld zu gewährleisten. Tragen Sie Vaseline auf beide Augen auf, um Trockenheit oder Hornhautverletzungen während der Operation zu vermeiden.
2. Chirurgischer Schnitt
- Desinfizieren Sie die Mittellinie des Halses der Ratte dreimal mit Jodtinktur, um ein steriles Operationsfeld zu gewährleisten.
- Machen Sie mit einer chirurgischen Schere einen etwa 3 cm langen Schnitt in der Mittellinie.
HINWEIS: Achten Sie darauf, die Submaxillarlrüse (SMG) und die Blutgefäße während der Dissektion nicht zu beschädigen. - Ziehen Sie den chirurgischen Schnitt zurück, um den Musculus sternothyreose (STM), den Musculus sternocleidomastoideus (SCM) und den Musculus omohyoidus (OHM) freizulegen.
3. Vorbereitung des PFV
- Identifizieren Sie das PFV, einen Zufluss der Vena jugularis externa (EJV), entlang des lateralen Randes der SCM.
- An der Bifurkation zwischen dem PFV und dem EJV wird das PFV mit einem mikrovaskulären Clip verschlossen.
- Fahren Sie mit dem stumpfen Präparieren des PFV fort, um eine ausreichende Länge zu erhalten, und klemmen Sie es am distalen Ende fest. Stellen Sie sicher, dass das PFV-Segment so locker wie möglich bleibt, um eine spätere Traktion während der Anastomose mit dem dcLN zu ermöglichen.
- Einen Längsschnitt parallel zur Gefäßachse mit einer Mikrovaskulärschere herstellen.
HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass der PFV-Schnitt in Längsrichtung erfolgt, da der Querschnitt durch Zug vergrößert und gerissen werden kann. - Spülen Sie das isolierte Gefäßsegment gründlich mit heparinisierter Kochsalzlösung (0,1 % Natriumheparin in 0,9 % NaCl), bis die intravaskulären Erythrozyten vollständig beseitigt sind.
4. Lymphknoten-Venen-Anastomose
- Erforschen und zeigen Sie dcLN und sein afferentes Lymphgefäß (ALV) in der Mitte des STM und SCM4 vollständig frei.
- Präparieren Sie das dcLN nach und nach mit einer stumpfen Technik. Schneiden Sie vorsichtig die Faszie zwischen dem dcLN und dem umgebenden Gewebe ein, um eine Beschädigung sowohl des dcLN als auch seines ALV zu vermeiden.
HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass PFV und dcLN nahe beieinander liegen, um die Spannung nach der Anastomose zu minimieren. - Machen Sie einen Schnitt am distalen Ende des dcLN. Stellen Sie sicher, dass die Breite des Schnitts kleiner oder ähnlich dem Durchmesser des PFV ist, damit der PFV-Blutfluss nicht wesentlich beeinträchtigt wird.
- Anastomosieren Sie mit einer 12-0-Nylonnaht das proximale Ende des PFV-Schnitts bis zum proximalen Ende des dcLN-Schnitts.
- Verlängern Sie die Schnittlänge des PFV weiter bis zum distalen Ende, so dass sie etwas größer ist als die Länge des dcLN-Schnitts.
- Führen Sie die Nadel nacheinander durch die Außenkante der dcLN-Transsektion und die Innenkante des PFV-Schnitts, wodurch die dcLN-Transsektion in das PFV-Lumen gezogen wird.
- Führen Sie eine durchgehende Naht von der unteren zur oberen Kante der dcLN-Durchtrennung durch. Verabreichen Sie kurz vor Abschluss der letzten Naht noch einmal Heparin-Natrium, um die Thrombusbildung im PFV-Lumen zu verhindern. Halten Sie während des kontinuierlichen Verschlusses eine angemessene Spannung auf der Naht, um einen sicheren Verschluss zu gewährleisten und ein späteres Auslaufen zu verhindern.
- Platzieren Sie unterbrochene Nähte überall dort, wo die kontinuierliche Anastomose locker ist.
5. Anastomose der lymphatischen Gefäß-Venen-Anastomose
- Durchschneiden Sie das ALV und bewahren Sie das umgebende Gewebe, das als Nahtankerpunkt dient.
- Führen Sie diese mit einer Nahtnadel 12-0 etwa 2 mm proximal zum PFV-Schnitt ein und schieben Sie sie durch die Öffnung des PFV-Schnitts zum Austritt vor.
- Dringen Sie mit der Nahtnadel in das Gewebe in der Nähe des ALV-Stumpfes ein, um das ALV aufzufangen.
- Führen Sie die Nadel in den PFV-Schnitt ein und durch den proximalen Rand heraus, binden Sie dann die Naht an die Fixierung des ALV-Stumpfes im PFV-Lumen.
HINWEIS: Führen Sie den ALV-Stumpf vollständig in das Lumen des PFV ein und richten Sie ihn in proximale Richtung aus, um die physiologische Drainage aufrechtzuerhalten. - Nähen Sie das umgebende Gewebe in der Nähe des ALV-Stumpfes an den inneren Rand des PFV-Schnitts, um eine externe Fixierung zu gewährleisten. Geben Sie Heparin-Natrium vor dem letzten Stich, um das PFV-Lumen frei von Gerinnseln zu halten.
6. Naht- und postoperative Versorgung
- Führen Sie eine kontinuierliche Naht für die subkutane Faszie und eine unterbrochene Naht für die Epidermis durch.
- Desinfizieren Sie den Operationsbereich mit Jodtinktur. Tragen Sie dann die Erythromycin-Salbe gleichmäßig um den Einschnitt auf, um eine Infektion zu verhindern.
- Postoperativ ist an fünf aufeinanderfolgenden Tagen einmal täglich Penicillin-Natrium (800.000 Einheiten/kg) per intraperitonealer Injektion zu verabreichen, um das Infektionsrisiko zu verringern.
7. Validierung der Anastomose
- Identifizieren und präparieren Sie die vordere Gesichtsvene (AFV), einen Nebenfluss des EJV, lateral des PFV.
- Verifizieren Sie den Erfolg der Anastomose, indem Sie eine signifikant intensivere Färbung im PFV im Vergleich zum benachbarten AFV beobachten.
- Quantifizieren Sie Farbänderungen objektiv mit dem standardisierten CIE LAB-Farbraum. Definieren und extrahieren Sie Regions of Interest (ROIs) in Fidschi, um die mittleren CIE L*a*b*-Werte zu erhalten, und berechnen Sie dann den Farbtonwinkel (h°) in Grad mit der folgenden Formel:
H° = ATAN2(B, A) × (180/π)6,7.
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Ergebnisse
Die chirurgischen Abläufe und postoperativen Ergebnisse von dcLnVA und dcLaVA werden mit jeweils einem repräsentativen Fall dargestellt. Im Fall von dcLnVA wurde PFV (2 mm Durchmesser) identifiziert und von der lateralen Grenze des SCM dissoziiert (Abbildung 1A, Abbildung S1A). In der Lücke zwischen SCM und STM, ca. 4 mm medial zum PFV, wurde ein langes ovales dcLN (5 mm × 4 mm × 2 mm) gefunden und fein getrennt (
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Diskussion
Im Jahr 2012 beschrieben ILif et al. erstmals das glymphatische System8. Im Jahr 2015 identifizierten Louveau et al. T-Zell-Aggregate im Lumen von Lymphgefäßen und bezeichneten diese Strukturen als meningeale Lymphgefäße. Sie zeigten weiterhin, dass die meningealen Lymphgefäße sowohl mit dem glymphatischen System als auch mit dcLN verbunden sind. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass im Rahmen der Regulation des lymphatischen Systems des Gehirns, einschließlich d...
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Offenlegungen
Die Autoren haben nichts offenzulegen.
Danksagungen
Diese Arbeit wurde unterstützt von der National Natural Science Foundation of China (82173384 und 81773161), dem Schlüsselforschungs- und Entwicklungsprogramm der Provinz Heilongjiang (2023ZX06C11) und dem Genertec Medical Scientific Research Fund Project (TYYLKYJJ-2024-043).
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Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| 0,9 % sterile Kochsalzlösung | Shandong Qidu Pharmaceutical Co., Ltd. | R9824041307 | |
| Erythromycin-Salbe | Sanqi Pharmaceutical Co., Ltd. | H34020307 | |
| Evans Blue Farbstoff 5 % (50 ml) | LEAGENE | DK0053 | |
| Heparinnatriumlösung 0,1 % | BIOSCO | BAC006 | |
| Mikropinzetten | ANLIXIN | AT-15 | |
| Mikrovaskuläre Klemme | Tigergen | TG-AC-18-Z | |
| Penicillinnatrium | Hebei Yuanzheng Hemu Pharmaceutical Co., Ltd | JFT230602 | |
| Weiße Vaseline | Tiancheng | 20250202 |
Referenzen
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