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Methodenartikel

Ein fortgeschrittenes Kokulturmodell der menschlichen Blut-Cerebrospinal-Flüssigkeitsbarriere für eine separate Analyse des Choroidplexus-Epithels und Endothels

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DOI:

10.3791/69275

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28. November 2025

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Pediatric Infectious Diseases, Department of Pediatrics, Medical Faculty Mannheim, Heidelberg University, 2European Center for Angioscience, Medical Faculty Mannheim, Heidelberg University, 3Department of Medical Statistics, Biomathematics and Information Processing, Medical Faculty Mannheim, Heidelberg University, 4Laboratory of Clinical Regenerative Medicine, Department of Neurosurgery, Faculty of Medicine, University of Tsukuba

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Eine Kokultur menschlicher Epithel- und Endothelzellen des Choroidplexus wurde hergestellt, um ein fortschrittliches In-vitro-Modell der Blut-Liquen-Spinal-Flüssigkeitsbarriere zu erstellen. Wir beschreiben die getrennte Isolierung von Epithel und Endothel für die anschließende RNA-Präparation und Transkriptionsanalyse unter ausgewählten Bedingungen.

Zusammenfassung

Der stark durchströmte Choroidplexus (CP), der im ventrikulären System des Gehirns liegt, besteht aus mehreren strukturellen Komponenten, darunter ein kubisches Epithel und ein fenestriertes Endothel, und ist der Standort der Blut-Licura-Flüssigkeitsbarriere (BCSFB). Um die CP in vitro zu untersuchen, sind verschiedene Zellkultur-Setups denkbar. Ein invertiertes Zellkulturfiltermodell mit starker Barrierefunktion, basierend auf humanen epithelialen CP-Papillomen (HIBCPP)-Zellen, wurde von unserem Labor entwickelt und umfangreich eingesetzt. Kürzlich konnten wir eine stabile, unsterbliche humane CP-Endothelzelllinie (iHCPEnC) erzeugen. Durch die Kombination beider Zelllinien haben wir ein fortschrittliches funktionelles Modell mit zwei Zellen zusammengestellt, das eine erhöhte Barrierefunktion im Vergleich zu HIBCPP-Zellen allein entwickelte. Da dieses Modell sowohl das CP-Epithel als auch das Endothel repräsentiert, ermöglicht es die Untersuchung des Zusammenspiels der beiden Zelltypen unter ausgewählten Bedingungen wie Infektion, Entzündung oder anderen. In diesem Protokoll beschreiben wir Methoden zur Einrichtung dieses Zwei-Zell-Typ-Modells mit anschließender Trennung der Epithel- und Endothelzellen für transkriptionelle Analysen. Wir beschreiben PCR-Primer, die spezifisch für Epithel und Endothel sind und dazu dienen, mögliche Kreuzkontaminationen zwischen den beiden Zelltypen zu erkennen. Um einen möglichen Einfluss des CP-Endothels auf das Epithel in diesem Modell unter entzündlichen Bedingungen zu untersuchen, wurden die Expressionsniveaus ausgewählter Gene im Zusammenhang mit der Behandlung mit Lipopolysaccharid (LPS) in der HIBCPP-Zellfraktion analysiert. Das fortschrittliche CP-In-vitro-Modell und die Möglichkeit, die epithelialen und endothelialen Antworten separat zu analysieren, sind von großem Interesse für die Forschung an zellulären Prozessen, die biologische und pathologische Funktionen des CP betreffen.

Einleitung

Der Choroidplexus (CP) ist ein stark gefäßartiges Konglomerat verschiedener Zellpopulationen, die in allen vier Ventrikeln des Gehirns liegen. Unter anderem dient sie als physiologische Barriere, die sogenannte Blut-Liquenspinalwasser-Barriere (BCSFB), zwischen dem zentralen Nervensystem (ZNS) und dem Blut und verhindert, dass das Gehirn beispielsweise infektiöse Substanzen im Blut zirkulieren. Das CP besteht aus verschiedenen Zelltypen, darunter die polarisierten Epithelzellen, die enge und Adhärenzverbindungen sowie Desmosomen enthalten und auf einer Basalmembran sitzen. Die Oberfläche der Epithelzellen wird durch das Vorhandensein von Mikrovilli auf der luminalen Oberfläche vergrößert. Fenestrierte endotheliale Kapillaren, umgeben von Bindegewebe wie Fibroblasten und Immunzellen, befinden sich unter der Basalmembran 1,2,3. Kürzlich wurde berichtet, dass CP-Endothelzellen in der Lage sind, die Integrität von BCSFB zusammen mit den Epithelzellen zu verbessern und somit eine Rolle beim Schutz des Gehirns während entzündlicher Prozessespielen könnten 4,5.

Bislang ist die invertierte Kultur humaner epithelialer CP-Papillomzellen (HIBCPP) das am häufigsten verwendete In-vitro-Modell, um ein humanes BCSFB mit hohen transepithelialen elektrischen Widerstandswerten (TEER) und einer starken Barrierfunktion nachzuahmen. Um die zellulären Funktionen besser zu verstehen und gleichzeitig Tierversuche zu vermeiden, ist es wichtig, so viele Informationen wie möglich aus In-vitro-Experimenten herauszuholen. Die erste stabile unsterbliche humane CP-Endothelzelllinie (iHCPEnC) wurde kürzlich in unserem Labor etabliert 6,7. Mit Hilfe von HIBCPP-Zellen und iHCPEnC können wir ein Co-Culture-in-vitro-Modell zusammenstellen, das das BCSFB auf fortschrittlichereWeise imitiert. Mit diesem Zwei-Zell-Typ-Modell konnten wir zeigen, dass die Kokultur von HIBCPP-Zellen und iHCPEnC zu erhöhten TEER-Werten im Vergleich zu HIBCPP-Zellen allein führt. Es ist wichtig zu beachten, dass iHCPEnC allein kein TEER 7,8 entwickelt. Eine separate Vorbereitung und anschließende Analyse der beiden in diesem Modell verwendeten Zelltypen würde es uns ermöglichen, ihr Zusammenspiel unter gesunden und kranken Bedingungen zu untersuchen.

Hier beschreiben wir zwei verschiedene Ansätze, um dieses Ziel zu erreichen. Die Grundlage ist, dass in beiden Fällen der Ansatz auf dem invertierten Zellkulturmodell der HIBCPP-Zellen basiert (Abbildung 1). Methode 1, die "direkte Kokultur"-Methode, umfasst beide Zellen auf einem Filtereinsatz. HIBCPP-Zellen werden vor der Aussaatung von iHCPEnC in der Standardmethode 7,8 invertiert gezüchtet. Methode 2, die "Membran-in-Insert"-Kultur, hier haben wir eine separate Membran mit denselben Eigenschaften wie die in den Filterinserts verwendeten Membran hinzugefügt. Diese zusätzliche Membran wird in einen Filtereinsatz eingesetzt, in dem HIBCPP-Zellen bereits in invertierter Kultur wachsen. iHCPEnC werden auf die zusätzliche Membran in Standardkultur-Verfahren ausgesaat.

Die anschließende Trennung der Zellen für die RNA-Analyse ermöglicht Einblicke in die transkriptionelle Reaktion des CP-Epithels und Endothels unter ausgewählten Bedingungen. Wir beschreiben PCR-Primer, die spezifisch für HIBCPP-Zellen und iHCPEnC sind und die Bestätigung der erfolgreichen und sauberen Trennung beider Zelltypen ermöglichen. Nach der Behandlung mit Lipopolysaccharid (LPS) verwenden wir die beschriebenen Modelle, um die unterschiedlichen Reaktionen des CP-Epithels in Anwesenheit des Endothels unter entzündlichen Bedingungen zu untersuchen.

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Protokoll

1. HIBCPP-Zellen

HINWEIS: Im Folgenden beschreiben wir die Kultur und Pflege von HIBCPP-Zellen sowie die Vorbereitung von invertierten Zellkulturfilter-Einsätzen mit HIBCPP-Zellen. Dieses Protokoll ist für das Wachstum von HIBCPP-Zellen auf 12-Well-Zellkulturfilter-Einsätzen konzipiert. Ein detailliertes Protokoll mit begleitendem Video zur Kultur von HIBCPP-Zellen auf 24-Well-Zellkulturfilter-Einsätzen wurde bereitsveröffentlicht 9.

  1. Aufnahme von HIBCPP-Zellen in Kultur
    1. Taue ein Fläschchen mit HIBCPP-Zellen bei Raumtemperatur (RT) auf.
    2. Suspendieren Sie den Inhalt des Fläschchens mit 10 ml DMEM/HAMS-F12-Medium, das 10 % fetales Kalbserum (FCS) enthält, und 5 μg Insulin/mL vorgewärmtem Medium (10 % HIBCPP-Medium).
    3. Geben Sie die resuspendierten HIBCPP-Zellen in eine T75-Zellkulturkolbe und inkubieren Sie 24 Stunden bei 37 °C mit 5 %CO2.
    4. Ändere das Medium der Kolben, um das DMSO 24 Stunden nach dem Aussäen der Zellen zu entfernen.
    5. Kultivieren Sie die Zellen bis zur 90%igen Konfluenz, dieser Schritt dauert etwa 2 Wochen. Wechsle das Medium zweimal pro Woche.
  2. Kontinuierliche Kultur von HIBCPP-Zellen
    HINWEIS: Für kontinuierliche Kultur werden HIBCPP-Zellen 1:3 in neue T75-Zellkulturkolben aufgeteilt.
    1. Entferne das Kulturmedium aus dem T75-Kolben.
    2. Wasche die Zellen einmal mit 10 ml PBS.
    3. Entfernen Sie das PBS.
    4. Abkoppeln Sie HIBCPP-Zellen mit Hilfe von 3 ml 0,25 % Trypsin-EDTA. Dieser Schritt dauert bei 37 °C etwa 10–20 Minuten. Wirbel die Flasche in der Zwischenzeit, um die vollständige Abdeckung der Zellschicht mit Trypsin-EDTA sicherzustellen.
    5. Gib 7 ml HIBCPP-Medium hinzu und zentrifugiere mit 50 x g für 10 Minuten bei RT.
    6. Das Zellpellet in 30 ml 10% HIBCPP-Medium neu suspendieren und auf 3 neue T75-Kolben aufteilen.
    7. Die Zellen bis zu 90 % Konfluenz kultivieren; Die Zellen erreichen die Zusammenfluss in etwa einer Woche.
    8. Wechsle das Medium zweimal pro Woche.
      HINWEIS: HIBCPP-Zellen sind nicht wachstumshemmend; daher wird der Kolben zusammenfließen, und die Zellen wachsen weiter und bilden mehrere Schichten.
  3. Aussäen von HIBCPP-Zellen in invertierter Kultur
    1. Entferne das Kulturmedium aus dem T75-Kolben.
    2. Wasche die Zellen einmal mit 10 ml PBS.
    3. Entfernen Sie das PBS.
    4. Abkoppeln Sie HIBCPP-Zellen mit Hilfe von 3 ml 0,25 % Trypsin-EDTA. Dieser Schritt dauert bei 37 °C etwa 10–20 Minuten. Wirbel die Flasche in der Zwischenzeit, um die vollständige Abdeckung der Zellschicht mit Trypsin-EDTA sicherzustellen.
    5. In der Zwischenzeit bereiten Sie die Filtereinsätze vor. Drehen Sie 12-Well-Filtereinsätze in umgedrehter Ausrichtung mit Hilfe einer Pinzette zu einer 6-Well-Zellkulturplatte und füllen Sie sie mit vorgewärmtem 10%-HIBCPP-Medium. Befeuchten Sie die Membran mit einem Tropfen Medium auf jedem Filtereinsatz vor.
    6. Resuspendiere trypsinisierte Zellen mit 17 ml eines 10%igen HIBCPP-Mediums.
    7. Zentrifugiere mit 50 x g für 10 Minuten bei RT und stelle die HIBCPP-Zellen auf eine Konzentration von 1 × 106 Zellen/ml ein.
      HINWEIS: HIBCPP-Zellen neigen dazu, kleine Agglomerate zu bilden. Es ist nicht notwendig, sie vollständig aufzulösen, bevor man sie auf Filtereinsätze einsät. Stellen Sie sicher, dass 90 % der Zellen einzeln sind.
    8. Säen Sie HIBCPP-Zellen invertiert auf 12-Well-Filter-Einsätzen mit einer Dichte von 4 × 105 Zellen pro Einsatz.
    9. Warte, bis die Zellsuspension von der Membran aufgenommen wurde. Schließen Sie den Deckel der 6-Well-Zellkulturplatte.
    10. Setze die Platten mit den umgekehrten Einsätzen in den Inkubator.
    11. 24 Stunden nach der Aussäung werden die Einsätze mit Hilfe einer Zangelei in die richtige Ausrichtung gewickelt und zu einer neuen 12-Well-Zellkulturplatte gedreht. Geben Sie 2 ml 10 % HIBCPP-Medium in das untere Fach und 1 ml in das obere Fach.
    12. Lassen Sie die Zellen 5 bis 6 Tage ohne jeglichen Mediumwechsel stehen und beginnen Sie mit der Bestimmung von TEER und der Einrichtung der Kokultur.

2. Bestimmung von TEER

HINWEIS: Die Bestimmung der TEER-Werte erfolgt mit Hilfe eines MilliCell ERS2 und einer Essstäbchen-Elektrode. Für die Berechnung ist eine Rohstoffmessung aus Zellkulturfilter-Einsätzen im Medium ohne Zellen (Ohm-Blank) erforderlich.

  1. Bewahren Sie die Elektrode der Essstäbchen trocken auf. Vor Beginn der Messung sollte man die Elektrode für 10 Minuten in 80 % Ethanol zur Desinfektion einsetzen.
  2. Danach spülen Sie die Elektrode mit PBS.
  3. Beginn der Messung: Setzen Sie das lange Ende der Elektrode in den Brunnen und das kurze Ende der Elektrode in den Filtereinsatz mit den bezaimten Zellen.
  4. Zeichnen Sie den Ohm-Wert des 12-Well-Zellkulturfilterinserts (Ohm-Probe) auf.
  5. Berechnen Sie den TEER wie folgt: Ohm·cm2 = (Ohm-Probe –Ohm-Blankur) × 1,1 cm2.
  6. Nach Abschluss der Messung spülen Sie die Elektrode mit 80 % Ethanol ab und lagern sie dann trocken.
    HINWEIS: Zwischen Messungen verschiedener experimenteller Bedingungen oder Messungen verschiedener Zelllinien muss die Essstäbchen-Elektrode desinfiziert und mit PBS gespült werden, um Kreuzkontamination zu verhindern.

3. iHCPEnC

  1. iHCPEnC in die Kultur einführen
    1. Taue ein Fläschchen iHCPEnC bei RT auf.
    2. Den Inhalt des Fläschchens mit vorgewärmtem 5 ml Complete Classic Endothelial Medium (iHCPEnC) wieder aufheben.
    3. Zentrifugiere bei 500 g für 5 Minuten bei RT.
    4. In der Zwischenzeit wird eine T25-Zellkulturflasche etwa 1 Minute lang mit 2 ml Attachment Factor beschichtet. Aspiriere den Attachment Factor und lasse den Kolben stehen, bis du das iHCPEnC ausgesät hast.
    5. Suspendiere das Zellpellet mit 5 mL iHCPEnC-Medium und gib es in den vorbereiteten T25-Zellkulturkolben.
    6. Inkubieren Sie bei 37 °C mit 5 % CO2für eine Woche ohne Veränderung des Mediums.
  2. Kontinuierliche Kultur von iHCPEnC
    HINWEIS: Für kontinuierliche Kultur teilen Sie iHCPEnC 1:4 in neue T25-Zellkulturkolben auf.
    1. Entferne das iHCPEnC-Medium und wasche die Zellen einmal mit 3 ml PBS. Achte darauf, dass die Zellen nicht abgetrennt werden.
    2. Aspiratiere das PBS.
    3. Abkoppeln Sie das konfluente iHCPEnC mit Hilfe von 1 ml Trypsin-EDTA. Dieser Schritt dauert bei RT etwa 3-5 Minuten.
    4. Lassen Sie die Zellen in 5 mL iHCPEnC-Medium wieder suspendieren.
    5. Zentrifugiere bei 500 g für 5 Minuten bei RT.
    6. In der Zwischenzeit beschichten Sie 4 neue T25-Kolben mit 2 ml Attachment Factor pro Kolben.
    7. Setzen Sie das Zellpellet mit 20 mL iHCPEnC-Medium wieder auf.
    8. Verteilt 5 ml der Zellsuspension auf jede der 4 vorbereiteten Kolben.
    9. Noch einmal: Kultivieren Sie die Zellen eine Woche lang ohne jegliche Veränderung des Mediums. Sie erreichen die Zusammenflussphase in einer Woche.
      HINWEIS: iHCPEnC-Zellen sind wachstumshemmend; daher wird der Kolben zusammenfließen, und die verbleibenden Zellen schwimmen.

4. Vorbereitungen für Kokultur-Experimente

  1. Methode 1: Für die "direkte Kokultur" (Kultivierung der Epithel- und Endothelzellen auf beiden Seiten eines Einsatzes) sollten Sie keine weiteren Mittel vorbereiten.
  2. Methode 2: Für die "Membran-in-insert"-Methode führen Sie folgende Schritte durch:
    1. Stanzen Sie 12-Well-Zellkulturfilter-Membranen mit Hilfe eines No.-11-Perforationseisen (entsprechend einem Durchmesser von 11 mm) aus einer separaten Din-A-4-Membran heraus.
    2. Leg ausgeschlagene Membranen in eine Petrischale.
    3. Sterilisieren Sie ausgestanchene Membranen für 60 Minuten mit ultraviolettem (UV-)Licht (UV-C, 254 nm).
      HINWEIS: Ausgestanzte und sterilisierte 12-Well-Zellkulturfilter-Membranen können im Voraus vorbereitet und unter sterilen Bedingungen gelagert werden.

5. Aufbau der Kokultur

HINWEIS: Zu diesem Zeitpunkt sind die HIBCPP-Zellen bereits für das Zwei-Zell-Typ-In-vitro-Kulturmodell vorbereitet. HIBCPP-Zellen werden seit 5 bis 6 Tagen gezüchtet (vergleiche Schritte 1.3.8-1.3.12). HIBCPP-Zellen sollten beginnen, einen TEER zu entwickeln (etwa 20 Ohm·cm 2).

  1. Für beides, Methode 1 ("direkte Co-Kultur") und Methode 2 ("Membran-im-Insert"), ersetzen Sie das 10%ige HIBCPP-Medium durch 1%iges HIBCPP-Medium. Zu diesem Zweck werden 2 ml 1 % HIBCPP-Medium in einen Brunnen einer 12-Well-Zellkulturplatte gegeben.
  2. Entleeren Sie den Filtereinsatz mit Invertiertenkultur mit Hilfe einer Pipette und einer Zange und setzen Sie den Filtereinsatz in Standardausrichtung in das vorbereitete 12-Well-Bohrloch.
  3. Für Methode 2 ("Membran-in-Insert") bereiten Sie Filtereinsätze wie folgt vor:
    1. Setzen Sie die ausgestanzte und sterilisierte Membran in einen vorbereiteten 12-Well-Filtereinsatz mit HIBCPP-Zellen in umgekehrter Kultur mit Hilfe einer Pinzette.
  4. Bringen Sie die Zellkulturplatten zurück in den Inkubator zur Trypsinisierung des iHCPEnC (beschrieben in Schritt 6).

6. Aussaat und Kultivierung von iHCPEnC in der Kokultur

HINWEIS: Im folgenden Abschnitt wird die Einrichtung einer Kokultur von HIBCPP-Zellen und iHCPEnC auf 12-Well-Zellkultur-Filterinserts beschrieben. Ein detailliertes Protokoll zur Kokultur von HIBCPP-Zellen und iHCPEnC auf 24-Well-Zellkulturfilter-Einsätzen wurde bereitsbeschrieben 8. Berechnen Sie vor dem Abtrennen von iHCPEnC, wie viele Zellen für die Co-Kultur benötigt werden. Eine konfluente T25-Zellkulturflasche liefert eine ungefähre Menge von 5 × 105Zellen .

  1. Entfernen Sie das Medium einer zusammenführenden T25-Flasche, die iHCPEnC enthält.
  2. Waschen Sie iHCPEnC mit 3 ml PBS. Vermeiden Sie es, die Zellen abzutrennen.
  3. Entfernen Sie das PBS.
  4. Abkoppeln Sie das konfluente iHCPEnC mit Hilfe von 1 ml Trypsin-EDTA. Dieser Schritt dauert bei RT etwa 3-5 Minuten.
  5. Die Zellen in einer 5-mL/T25-Flasche mit iHCPEnC-Medium wieder suspendieren.
  6. Zähle die Zellen in einer Neubauer-Kammer.
  7. Zentrifugiere mit 500 × g für 5 Minuten bei RT.
  8. Das Zellpellet wird auf eine Endkonzentration von 1 × 105 Zellen/mL im iHCPEnC-Medium resuspendiert.
  9. Sowohl Methode 1 ("direkte Kokultur") als auch Methode 2 ("Membran im Einsatz"): Samen 700 μL iHCPEnC (7x105 Zellen) in einem 12-Bohrloch-Filtereinsatz.
  10. Überwachen Sie die TEER-Werte der Co-Kultur und der Kontrollgruppen (d. h. ausschließlich HIBCPP- und iHCPEnC-Kulturen) erstmals 24 Stunden nach der Aussaatung von iHCPEnC und danach täglich.

7. LPS-Behandlung

HINWEIS: Kokulturen sollten höhere TEER-Werte aufweisen als nur HIBCPP-Zellkulturen (empfohlener Faktor: 1,5 oder höher).

  1. Messung und Aufzeichnung der TEER-Werte von Zellkultur-Einsätzen, die für Experimente eingerichtet wurden.
  2. Bereiten Sie eine Mastermischung mit 5 μg/mL LPS in einem 1%igen HIBCPP-Medium vor.
  3. Bereiten Sie neue 12-Well-Platten mit 2 ml 1 % HIBCPP-Medium pro Bohrloch vor.
  4. Entleeren Sie die Einsätze mit Hilfe von Pinzetten und Pipettern.
  5. Setzen Sie Einsätze in die vorbereiteten Brunnen.
  6. Fügen Sie 1 ml des LPS-Mastermixes oder 1 % HIBCPP-Medium hinzu (Negativkontrolle).
  7. Inkubieren Sie 4 Stunden bei 37 °C.
  8. Messen und notieren Sie TEER-Werte, bevor Sie zu Abschnitt 8 übergehen.

8. Getrennte Isolierung von RNA aus HIBCPP-Zellen und iHCPEnC für eine anschließende transkriptionelle Analyse

HINWEIS: Um zwei separate Zellfraktionen zu erreichen und Kreuzkontamination durch im Kokulturmodell kultivierte Zellen zu vermeiden, werden die Zellfraktionen sorgfältig separat vom Einsatz abgekratzt. Führen Sie alle Schritte der RNA-Isolierung für jeden Filtereinsatz ohne Unterbrechung durch (die Einsätze dürfen nicht austrocknen).

  1. Waschfiltereinsätze einmal mit PBS. Zu diesem Zweck werden 12 Zellkulturplatten mit 1,5 mL PBS pro Bohrloch vorbereitet.
  2. Entleeren Sie die Zellkulturfilter-Einsätze mit Hilfe einer Pipette und einer Pinzette. Setzen Sie die Einsätze in die mit PBS gefüllte 12-Well-Zellkulturplatte.
  3. Gib 1 ml PBS in die Einsätze.
  4. Um iHCPEnC- und HIBCPP-Zellen für Methode 1 ("direkte Kokultur") vorzubereiten, führen Sie folgende Schritte durch:
    1. Nehmen Sie das PBS aus dem Einsatz und legen Sie es in eine leere, trockene 12-Well-Zellkulturplatte.
    2. Mit Hilfe einer Pipettenspitze und dem Pipettern von 10–20 μL PBS werden die iHCPEnC durch Abschaben vom Einsatz gelöst.
    3. Setzen Sie diese Zellfraktion in ein 1,5-ml-Rohr mit 350 μL RNA-Lysepuffer. Pipette hoch und runter, um die Zellen richtig mit dem RNA-Lysepuffer zu mischen.
    4. Nachdem die Ernte der iHCPEnC-Fraktion abgeschlossen ist, drehen Sie den Einsatz kopfüber in das Deckel einer Zellkulturplatte.
    5. Nehmen Sie HIBCPP-Zellen wie die iHCPEnC-Fraktion von der Membran und legen Sie sie in ein vorbereitetes 1,5-ml-Rohr mit 350 μL RLT-β-Mercapttoethanol.
      HINWEIS: Wenn mehrere Kokulturen für eine Bedingung vorbereitet werden, nehmen Sie 350 μL RNA-Lysepuffer pro Insert und Zellfraktion. Einzelzellanteile einer bestimmten Bedingung werden auf derselben Säule nacheinander gereinigt.
  5. Um iHCPEnC- und HIBCPP-Zellen für Methode 2 ("Membran-in-insert") vorzubereiten, führen Sie folgende Schritte durch:
    1. Entfernen Sie die zusätzliche Membran mit Hilfe einer Pinzette und legen Sie sie in einen trockenen Deckel einer 12-Well-Zellkulturplatte. Pipette 100 μL RNA-Lysepuffer auf die Membran zur Lyse von iHCPEnC.
    2. Geben Sie dieses 100 μL Lysat in ein 1,5 ml Rohr mit 250 μL RNA-Lysepuffer und mischen Sie es gut.
    3. Entfernen Sie das PBS aus dem Filtereinsatz und legen Sie es kopfüber in den Deckel einer 12-Well-Zellkulturplatte. Fügen Sie 100 μL RNA-Lysepuffer auf die Membran des Einsatzes hinzu und lysieren Sie die HIBCPP-Zellfraktion.
    4. Geben Sie dieses 100 μL Lysat in ein 1,5 ml Rohr mit 250 μL RNA-Lysepuffer.
  6. Führen Sie die RNA-Isolierung gemäß dem Protokoll des Herstellers durch.
  7. Messen Sie die RNA-Menge mit einem Spektrophotometer.
  8. Führen Sie eine Reverse-Transkription und qPCR-Analyse von RNA-Proben durch, wie vom Hersteller beschrieben.
    HINWEIS: Da die Kokulturen weniger Mengen iHCPEnC enthalten als HIBCPP-Zellen, sind je nach anschließender Analyse mehrere 12-Well-Filterinserts erforderlich, um ausreichend RNA aus iHCPEnC zu isolieren. Die RNA-Lysate der unterschiedlichen Filter-Einsätze müssen zusammengelegt werden. Reverse Transkription und qPCR können wie zuvor beschriebendurchgeführt werden.

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Ergebnisse

In diesem Protokoll beschreiben wir die Schritt-für-Schritt-Generierung eines Zweizellmodells des menschlichen CP, bestehend aus Epithel (HIBCPP-Zellen) und Endothel (iHCPEnC) auf Zellkulturfilter-Einsätzen, wie schematisch in Abbildung 1 dargestellt. In diesem Modellsystem werden HIBCPP-Zellen auf der unteren Seite des Filters in umgekehrter Weise gezüchtet, während iHCPEnC entweder auf der Oberseite des Filters des Einsatzes oder auf einem zweiten Filter, ...

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Diskussion

Das humane CP besteht aus mehreren verschiedenen Zelltypen, darunter ein barrierenbildendes Epithel und ein Endothel der erweiterten Gefäße3. Obwohl die Endothelzellen der CP fenestratiert sind, haben neuere Forschungen ihren Beitrag zur Barrierfunktion am BCSFB 4,7 gezeigt. Um die komplexen Wechselwirkungen zwischen Endothel und Epithel in Organen als CP zu untersuchen, sind fortschrittliche In-vitro-...

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Offenlegungen

Die Autoren erklären, dass sie keinen Interessenkonflikt haben.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
0,25 % Trypsin-EDTALife Technologies 25200056
12-Brunnen-Zellkulturplatten StarLabCC7682-7512
12 Bohrlochfilter-Einsätze (3 & Mikro; M-Poren)Greiner Bio One665631
24-Brunnen-Zellkulturplatte  StarLabCC7672-7524
24-Bohrloch-Filtereinsatz  (0.4 µ M-Poren)Greiner Bio One662641
24-Bohrloch-Filter-Einsatz (3 & Mikro; M-Poren)Greiner Bio One662631
6-Well-Zellkulturplatte  StarLabCC7682-7506
AffinityScript cDNA-Synthese-Kit (cDNA-Synthese)Agilent600559
BindungsfaktorZellsysteme4ZO-500Teil des kompletten klassischen Endothelmedium-Kits.
Brilliant II SYBR Green qPCR Master Mix (Echtzeit-PCR)Agilent600828
Essstäbchen-ElektrodeMilliporeMERSSTX01Dieses Produkt wird eingestellt.
Vollständiges klassisches Endothelmedium (iHCPEnC-Medium)Zellsysteme4ZO-500Kit, das Medium, Ergänzungsmittel und Attachment Factor für die Beschichtung enthält.
DMEM/F-12 (1:1) mit Phenol (10 % HIBCPP-Medium)Thermo Fisher31330-038
DMEM/F-12 (1:1) ohne Phenol (1 % HIBCPP-Medium)Thermo Fisher11039-021
Fetales Kalbserum (FCS) (1 % und 10 % HIBCPP-Medium)Thermo Fisher10270-106
Insulin (1 % und 10 % HIBCPP mittelmäßig)SigmaI9278
Lipopolysaccharid (LPS)SigmaL3024
MilliCell ERS2 MilliporeMERS00002Dieses Produkt wird eingestellt.
Nanodrop (Spektrophotometer)ThermowissenschaftlichND1000Dieses Produkt wird eingestellt.
Nr. 11 PerforationseisenWü RTH880223211
PBSLife Technologies 14190169
Primer-DesignwerkzeugNCBIhttps://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/
Primers SigmaVC00021
Qiagen RNeasy microQiagen74004
RLT+b-ME (Teil des Qiagen Rneasy Micro-Kits)Qiagen74004
T25-ZellkulturkolbeSarstedt AG & Co KG83,39,10,002
T75-ZellkulturkolbenSarstedt AG & Co KG83,39,11,002
TRAKETCH PET 3,0 cc (separate Membran)SabeuSK4580
UV-LichtCarl RothH469.1

Referenzen

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  3. Ghersi-Egea, J. F., et al. Molecular anatomy and functions of the choroidal blood-cerebrospinal fluid barrier in health and disease. Acta Neuropathol. 135 (3), 337-361 (2018).
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