Methodenartikel

Erzeugung von 3D-kollagen-eingebetteten A549/MRC-5 Alveolarorganoiden mit einem mechanischen Zellstreckungs-Bioreaktor

DOI:

10.3791/69447

⸱

27. März 2026

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1Department of Biology, University of British Columbia - Okanagan, 2Centre for Heart Lung Innovation, St. Paul's Hospital, University of British Columbia

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Erratum-Hinweis

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Zusammenfassung

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Dieses Protokoll beschreibt die Erzeugung von Organoiden aus A549-alveolären Epithelzellen und MRC-5-Lungenfibroblasten auf einem extrazellulären Matrix-Hydrogelgerüst, gefolgt von der Einbettung in 3D-Kollagen-Gelen und der Exposition gegenüber mechanischer Belastung mit einem zelldehnenden Bioreaktor zur Untersuchung der alveolaren Mechanobiologie.

Zusammenfassung

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Obwohl Atemdynamik und mechanische Anstrengung eine entscheidende Rolle in der Alveolarbiologie spielen, werden ihre Beiträge zur Pathogenese von Atemwegserkrankungen oft übersehen. Um diese Lücke zu schließen, entwickelten wir ein Organoid-Modell, bei dem alveoläre epitheliale Fibroblast-Organoide mit einem Zelldehnungs-Bioreaktor einer kontrollierten mechanischen Belastung unterzogen werden. Diese Plattform repliziert die räumliche Organisation und mehrzellige Komplexität des Alveolargewebes und ermöglicht die Untersuchung, wie Zell-Zell-Kommunikation und Mechanotransduktion die Gewebestruktur und -funktion in Gesundheit und Krankheit beeinflussen. In diesem Protokoll beschreiben wir Methoden zur Erzeugung und Kultivierung von epithelialen Fibroblasten-Organoiden unter Verwendung von A549-alveolären Epithelzellen und MRC-5-Lungenfibroblastenzelllinien in einem basalmembran-extrazellulären Matrix-Hydrogel. Organoide werden dann nicht-enzymatisch isoliert und in 3D-Kollagengele in spezialisierten Platten im Bioreaktor eingebettet. Wir skizzieren Verfahren zur Anwendung gleichmäßiger Dehnung, um pathologische Atemmuster bei Atemverschlechterbungen nachzuahmen. Abschließend präsentieren wir einen standardisierten Charakterisierungsablauf, einschließlich Immunfärbung für zellspezifische Marker und Immunoassays zur Profilierung der Freisetzung von Immunmediatoren. Zusammen unterstützen diese Analysen die Beurteilung der Struktur und Funktion des Organoids. Dieses Protokoll bietet eine benutzerfreundliche, reproduzierbare und anpassungsfähige Plattform zur Untersuchung der Alveolarbiologie unter mechanischem Stress, mit leicht anpassbaren Parametern, um vielfältige experimentelle Ziele zu erreichen und die Forschung zu Lungenerkrankungsmechanismen voranzutreiben.

Einleitung

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Die Alveolen sind die Endsäcke des Atemsystems und dienen als Hauptort des Gasaustauschs. Sie bestehen hauptsächlich aus alveolären Epithelzellen Typ I und II, die für den Gasaustausch, Immunfunktionen und die Aufrechterhaltung der strukturellen Integrität verantwortlich sind, sowie Fibroblasten in den Wänden, die die extrazelluläre Matrix-Homöostase1 aufrechterhalten. Diese und andere ansässige Zellen sind während der Atmung kontinuierlich zyklischer Dehnungs- und Scherspannungausgesetzt. Solche mechanischen Hinweise werden in biochemische Signale umgewandelt, die die Zellstruktur, Differenzierung und Kommunikation beeinflussen3.

Pathologische mechanische Belastung wird bei Lungenerkrankungen wie chronisch obstruktiver Lungenerkrankung (COPD) beobachtet. COPD ist eine fortschreitende Erkrankung, die durch parenchymale Zerstörung, chronische Entzündungen und Verengung der kleinen Atemwegegekennzeichnet ist. Bei dieser Erkrankung beeinträchtigen die Zerstörung der Alveolarwände, der Verlust von Elastin, die Umstrukturierung der extrazellulären Matrix (ECM) zu Fibrose und chronische Entzündungen gemeinsam die Fähigkeit der Lunge, strukturellen Schädenauszuhalten 5,6. Dies führt zu einer heterogenen und abnormen alveolaren Deformation während der Atmung, die bei Krankheitsschüben noch verschärft wird. 7,8.

Obwohl mehrere in-vitro-Ansätze zur Untersuchung der alveolaren Biologie verwendet wurden, weist jeder von ihnen bemerkenswerte Einschränkungen auf. 2D-Kokultursysteme erleichtern die Untersuchung von Cell-Zell-Interaktionen, können jedoch die Gewebearchitektur oder die Dynamik der extrazellulären Matrix nicht erfassen, was die physiologische Bedeutung verringert. Statische 3D-Kulturen bewahren strukturelle Organisation und Matrixinteraktionen besser, integrieren jedoch keine dynamischen mechanischen Hinweise, die in vivo vorhanden sind. Mikrofluidische und Organ-on-Chip-Plattformen können Flüssigkeitsfluss und mechanische Dehnung nachahmen und bieten eine hohe physiologische Genauigkeit, sind jedoch oft technisch komplex, niedrig durchsatzfähigund kostspielig. Im Gegensatz dazu kombiniert das hier präsentierte 3D-Modell des mechanisch gedehnten Organoids strukturelle Komplexität, zelluläre Heterogenität und kontrollierte mechanische Stimulation – ein Aspekt, der in bestehenden Modellen oft übersehen wird – innerhalb einer reproduzierbaren, skalierbaren Plattform, die ein Gleichgewicht zwischen physiologischer Relevanz und experimenteller Zugänglichkeitbietet 10,11.

Um die komplexen Mechanismen, die zu Krankheiten wie COPD beitragen, zu verstehen und therapeutische Ziele zu entdecken, wurden Krankheitsmodelle entwickelt. Trotz ihrer Bedeutung wird mechanische Belastung in den in vitro alveolaren Modellen, die zur Untersuchung der Mechanismen und der Pathogenese von Lungenerkrankungen wie COPD verwendet werden, oft übersehen. Um diese Lücke zu schließen, präsentieren wir eine Methode zur Kultivierung von alveolaren epithelial-Fibroblast-Organoiden in einer Kellermatrix, zur Gewinnung und Einbettung in 3D-Kollagengele, zur Anwendung zyklischer mechanischer Belastung mit einem Zelldehnungs-Bioreaktor sowie zur Bewertung wichtiger struktureller und funktionaler Ergebnisse. Diese 3D-mechanischen Organoid-Modelle erfassen zelluläre Interaktionen und die Mikroumgebung der menschlichen alveolären Nische besser und ermöglichen so die Untersuchung des epithelial-mesenchymalen Übersprechens12.

Der Bioreaktor übt eine gleichachsige Dehnung mit konfigurierbaren Parametern aus, wodurch bis zu 30 % Verlängerung und Frequenzen von bis zu 5 Hz ermöglicht werden, um sowohl physiologische als auch pathologische Bedingungen zu modellieren. In dieser Studie erzeugten wir organoide Modelle, die in Kollagen-I-Hydrogele eingebettet wurden und 24 Stunden lang 18 % Belastung bei 0,4 Hz unterzogen wurden, um pathologische Atmung nachzuahmen. Wir haben einen standardisierten Charakterisierungsworkflow eingerichtet, der Immunfärbung für zellspezifische Marker und Immunoassays umfasst, um die Freisetzung von Immunmediatoren nach mechanischer Belastung zu quantifizieren. Ziel dieser Studie ist es, eine physiologisch relevante, benutzerfreundliche und anpassungsfähige Plattform zur Untersuchung der Alveolarbiologie unter mechanischem Stress bereitzustellen.

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Protokoll

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Alle Schritte erfordern aseptische Techniken, sterile Materialien und Reagenzien und werden in einem Biosicherheitsschrank durchgeführt, um die Exposition des Personals gegenüber biologisch gefährlichen Materialien und Kulturkontaminationen zu verringern. Die Reagenzien und die verwendeten Geräte sind in der Materialtabelle aufgeführt.

1. Zellkultur und Etablierung von Zelllagern

  1. Vor der Organoidbildung werden A549- und MRC-5-Zellen auf standardisierten, mit Gewebekulturen behandelten Kunststoffflaschen (T75 cm2) bis etwa 70 % Konfluenz mit Dulbeccos Modified Eagle Medium (DMEM) mit 10 % fetalem Rinderserum (FBS) und 1 % Penicillin-Streptomycin, hiermit als "vollständiges DMEM" bezeichnet, kultiviert.
  2. Für sowohl A549 als auch MRC-5 wird bei 2 x 104 Zellen /cm² gesät, bei einem Gesamtvolumen von 10 mL vollständigem DMEM. Zellkulturen bei 37 °C mit 5 % CO2in einer befeuchteten Umgebung bis etwa 70 % bis 80 % Konfluenz erreicht ist.
  3. Ersetzen Sie das Kulturmedium alle 48 Stunden, um optimale Wachstumsbedingungen zu gewährleisten.
  4. Subkultur, indem man alle Medien aus dem Kolben absaugt, sobald 70 % bis 80 % zusammenfließt, einmal mit warmer phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) gewaschen und dann 4 ml Trypsin-EDTA hinzufügt.
  5. Inkubieren Sie bei 37 °C für 5 Minuten und visualisieren Sie die Kolben mit einem Hellfeldmikroskop, um eine vollständige Ablösung sicherzustellen. Neutralisieren, indem du 4 ml vollständiges DMEM hinzufügst.
  6. Zählen Sie die Zellen mit der bevorzugten Technik, wie zum Beispiel dem Trypan-blauen Ausschlusszählen.
  7. Zentrifugiere die Zellsuspension bei 200 x g für 5 Minuten.
  8. Saugen Sie das Supernatant ab, sodass ein Zellpellet am Boden des konischen Röhrchens bleibt. Lassen Sie das Zellpellet in einem angemessenen Volumen vollständigen DMEM durch sanftes Triturieren wieder auf.
  9. Zum Einfrieren wird in einem kompletten Medium mit 10 % DMSO erneut suspendiert, um 1 x 106 Zellen /mL zu erhalten. Für die Organoidbildung resuspendieren Sie, um 1 x 106 Zellen /ml zu erhalten.

2. Etablierung und Charakterisierung der Reifung eines 3D-alveolären epithelial-fibroblast-organoiden Modells

HINWEIS: Die Kellermatrix sollte über Nacht auf Eis aufgetaut und während dieser Schritte auf Eis gestellt werden. Höhere Temperaturen können zur Verfestigung der Matrix führen.

  1. Bereite eine 2:3-Mischung aus Kellermatrix und fortgeschrittenem DMEM vor. Fügen Sie 300 μL dieser Lösung zu jedem Brunnen einer 24-Bohrloch-Platte hinzu, um sicherzustellen, dass der Boden jedes Bohrlochs gleichmäßig beschichtet ist. Inkubieren Sie die Platte bei 37 °C in einem befeuchteten Inkubator für 1 Stunde, damit die Matrix erstarren kann.
  2. Bereiten Sie eine 5%ige Basalmatrixlösung in vollständigem DMEM vor, das als Kulturmedium für die Organoide dient. Für jedes Bohrloch werden 1,2 ml dieser Lösung hergestellt, indem man 60 μL Grundgebirgsmatrix in 1.140 μL vollständigen DMEM verdünnt.
  3. Während der Zeit der Verhärtung der Kellermatrixmischung mischen Sie 300.000 A549-Zellen mit 30.000 MRC-5-Zellen in 200 μL der 5%-Kellermatrixlösung, die in vollständigem DMEM hergestellt wird, wie in Schritt 2.2 beschrieben.
  4. Sobald das 2:3-Basengemisch erstarrt ist, pipettiert man 200 μL des A549/MRC-5-Gemisch auf die gelierte Matrix und bringt die 24-Well-Platte wieder in die Inkubation bei 37 °C, 5 % CO₂ für 21 Tage, um Wachstum und Differenzierung der alveolaren Organoide zu ermöglichen.
  5. Visualisieren Sie die Kulturen unter einem Lichtmikroskop für die nächsten 48 Stunden. Zellen sollten sich in diesem Zeitraum sammeln.
  6. Ersetzen Sie alle 48 Stunden die 5%ige Kellermatrix/DMEM-Lösung durch 200 μL frisches 5%-Medium. Um die im Hydrogel eingebetteten Organoide zu vermeiden, kippen Sie die Platte vorsichtig, sodass sich die alte Lösung vor der Aspiration entlang der Bohrlochwand sammelt.
  7. An den Tagen 3, 9 und 21 der Reifung bilden Sie die Organoide mit 10-facher Objektivvergrößerung ab und machen Sie vier repräsentative Bilder oder Sichtfelder jedes Bohrlochs. Repräsentative Bilder der frühen organoiden Morphologie an den Tagen 3, 9 und 21 sind in Abbildung 1 dargestellt.
  8. Für jedes Sichtfeld zählen Sie alle Organoide mit einem Durchmesser größer als 50 μm. Mit der bekannten Fläche des Sichtfelds extrapoliert man die durchschnittliche Gesamtzahl der Organoide pro Bohrloch aus der durchschnittlichen Anzahl pro Feld, unter Annahme einer Plattenoberfläche von 24 Bohrlöchern von 1,9 cm².
    HINWEIS: Diese Analysen können mit Bildanalysesoftware wie Fiji13 durchgeführt werden.
  9. Der durchschnittliche Durchmesser und die Fläche der Organoide können ebenfalls gemessen werden, um quantitative Informationen über die Wachstumseigenschaften der Organoide in der Kultur zu erhalten.

3. Ernten von 3D-alveolären Epithel-Fibroblast-Organoiden

HINWEIS: Alle Schritte zur Entnahme der Organoide sollten auf Eis durchgeführt werden.

  1. Nach 21 Tagen Reifung aspirieren Sie das Supernatant und waschen Sie vorsichtig mit etwa 1–2 ml eiskaltem PBS.
  2. Fügen Sie 1–2 ml kalte organoide Entsorgungslösung hinzu und inkubiere die Platte bei 2–8 °C für 30–90 Minuten mit moderatem Schütteln.
    HINWEIS: Beenden Sie die Brutzeit, wenn die Organoide am Boden des Brunnens schwimmen.
  3. Überwachen Sie die Dissoziation mit einer Hellfeldmikroskopie. Die Dissoziation gilt als abgeschlossen, sobald die Grundmatrix am Boden des Bohrlochs nicht mehr sichtbar ist und die Organoide in Suspension sind. Ein Zellschaber kann verwendet werden, um das Organoid-Basalment-Matrix-Hydrogel sanft zu lösen, um den Prozess zu beschleunigen.
  4. Sammeln Sie den Inhalt aller Brunnen in ein 50-mL konisches Rohr auf Eis.
  5. Zentrifugiere bei 500 × g für 5 Minuten bei 2-8 °C. Aspiratiere das Supernatant, wasche das organoide Pellet mit 1–2 ml eiskaltem PBS und zentrifugiere dann erneut, um ein Pellet zu erhalten. Aspiratiere das PBS.

4. Etablierung von 3D-kollagen-eingebetteten alveolär-fibroblast-Organoiden und Anwendung mechanischer Dehnung

HINWEIS: Verwenden Sie runde Schaumstoffkulturplatten mit Schaumankern, die mit einem zelldehnenden Bioreaktor kompatibel sind. Die in diesem Protokoll verwendete Kulturplatte hat eine Wachstumsfläche von ~6,6 cm².

  1. Bereite eine Arbeitslösung aus 2 mg/mL Kollagen-I-Gel vor. Die Lösung sollte 1× PBS, 11,4 mM NaOH und 2 mg/mL Kollagen I enthalten, wobei das Endvolumen mit sterilem Wasser angepasst wird. Bereite pro Bohrloch der runden Schaumstoff-6-Well-Platte 2 ml dieser Kollagen-I-Lösung vor.
  2. Gib 1 ml der 2 mg/mL Kollagen-I-Lösung zu den Schaumstoffankern am Rand der Platte, um eine vollständige Sättigung sicherzustellen.
    HINWEIS: Die Schaumanker müssen gründlich mit Kollagen-I-Lösung gesättigt werden, um eine ordnungsgemäße Haftung zu gewährleisten. Eine unvollständige Sättigung kann während der mechanischen Dehnung zu einer Ablösung des Kollagengels führen, was zu einer geringeren effektiven Dehnung im Vergleich zum beabsichtigten Ziel führt.
  3. Suspendiere das Organoid-Pellet in 6 mL 2 mg/mL Rattenschwanzkollagen und pipette 1 mL der Suspension in die Mitte einer 6-Wellen-runden Schaumschicht, wobei die organoid-infusierte Kollagenmischung sich mit dem ursprünglich organoidfreien Kollagen zu den runden Schaumankern vermischt.
    HINWEIS: Vermeiden Sie es, Blasen zu erzeugen, wenn die Organoidsuspension in jedes Bohrloch gegeben wird.
  4. Polymerisieren Sie das Kollagen-I für 1 Stunde, indem Sie die Platten in einem Inkubator lassen (37 °C, 5 %CO2). Nach der Polymerisation sollte das Gel trüb erscheinen.
  5. Fügen Sie 2 ml vollständiges DMEM auf 3D-kollagen-eingebettete A549/MRC5-Organoide hinzu und bringen Sie die Platte für 24 Stunden zurück in den Inkubator.
  6. Ersetze das Kulturmedium durch DMEM + 1 % FBS und inkubiere es über Nacht vor der mechanischen Belastung.

5. Zelldehnungs-Bioreaktoraufbau und Exposition gegenüber mechanischer Belastung

  1. Setzen Sie Ladestationen in jede Öffnung der Grundplatte ein. Diese enthalten sechs Ladeposten mit 25 mm Durchmesser, die es der flexiblen Membran der Tissue Train-Platten ermöglichen, sich um sie herum zu verformen und die 3D-Kultur einer gleichmäßigen Dehnung auszusetzen.
  2. Tragen Sie eine dünne Schicht Silikonfett auf die Oberseite der Ladepfosten auf.
  3. Setze rote Dichtungen auf den Boden jeder 6-Well-Platte.
  4. Setzen Sie die vorbereiteten Platten auf die Ladepfosten in die Grundplatte ein.
  5. Bringen Sie dieses Gerät in einen 37 °C, befeuchteten Inkubator mit 5 %CO2 und verbinden Sie die Schnellverbindungen mit der Grundplatte. Wiederholen Sie die Schritte 5.1 bis 5.6, lassen Sie jedoch die Verbindungen weg, um eine unbelastete Steuerung zu erzeugen.
    HINWEIS: Optional kann man einen Rohrdichtungsstopper anbringen, der verhindert, dass Vakuumdruck auf den Boden eines einzelnen BioFlex-Bohrlochs angewendet wird, wodurch eine unbelastete Kontrollkultur auf derselben Platte erzeugt werden kann.
  6. Decken Sie mit einer Plexiglasplatte ab und fügen Sie ~5-10 Pfund Gewicht hinzu, um eine dichte Abdichtung zu gewährleisten.
  7. Drehen Sie den Luftkompressor ein und öffnen Sie das Ablassventil des Luftkompressors.
  8. Schalten Sie die Vakuumdruckpumpe ein und öffnen Sie das Druckreservoirventil, das mit dem Auslauf des Vakuumtanks verbunden ist. Stellen Sie sicher, dass der Vakuumdruck etwa 90 kPa beträgt.
  9. Öffnen Sie das Einlassventil des Luftkompressors, der sich in der Nähe des Bioreaktorreglers befindet. Stellen Sie den Druck so ein, dass der Druck am Entlüftungsanschluss nicht mehr als 15 PSI beträgt.
  10. Starte die Bordsoftware und richte die gewünschten zyklischen mechanischen Dehnungsparameter ein. Für diese Studie wurde ein Regime mit 18 % Dehnungsamplitude bei 0,4 Hz für 24 Stunden verwendet. Um dies zu konfigurieren, erstellen Sie ein neues Regime, setzen Sie die minimale Verlängerung auf 0 %, die maximale Verlängerung auf 18 % und starten Sie das Protokoll.
  11. Beobachten Sie die Platte und die Membran, um sicherzustellen, dass die Bewegung während der gesamten Belastungssitzung sichtbar ist. Die Membran sollte sich um die Ladepfosten herum verformen.
  12. Überprüfen Sie regelmäßig die Wasseraufscheidung auf Feuchtigkeit und beobachten Sie den Computerbildschirm auf Laufzeit, Fortschritt und geeignete Morphologie des Zerrungsregimes.
  13. Nach Abschluss des Dehnungsprogramms trennen Sie die Grundplatte und bringen Sie die gespannten Kulturen wieder in 24 Stunden zum Inkubieren, bevor die nachgelagerten Charakterisierungsanalysen durchgeführt werden.
  14. Schalten Sie das System in umgekehrter Startreihenfolge herunter und zerlegen: Schließen oder schließen Sie das Luftkompressor-Zulassventil, dann das Druckreservoirventil, die Vakuumdruckpumpe, das Abflussventil des Luftkompressors und schließlich den Luftkompressor, in dieser Reihenfolge.
  15. Sammeln Sie das Überstandsmittel nach 24 Stunden Inkubation nach mechanischer Belastung. Lagere bis zur Anwendung bei -80 °C.

6. Morphologische Charakterisierung von Organoiden mittels Immunfluoreszenz

  1. Waschen Sie das Organoid-Kollagen-Gel-Modell dreimal mit PBS, indem Sie vorsichtig 1 ml PBS hinzufügen und 5 Minuten bei Zimmertemperatur inkubieren.
  2. Saugen Sie das PBS vorsichtig ab und wiederholen Sie den Waschvorgang insgesamt dreimal.
  3. Fixieren Sie das Modell, indem Sie 2 ml 4%-Paraformaldehyd für 1 Stunde bei 4 °C inkubieren.
  4. Waschen Sie die Modelle wie oben beschrieben dreimal mit PBS.
  5. Mit einem Skalpell schneiden Sie die runden Schaumanker vorsichtig in den flexiblen Brunnen mit dem Kollagengel und legen Sie es in eine Petrischale.
  6. Permeabilisieren Sie die Organoide, indem Sie mit 2 ml 0,1 % Triton X-100 in PBS für 5 Minuten bei Zimmertemperatur inkubieren.
  7. Waschen Sie die Modelle dreimal mit PBS.
  8. Blockieren Sie die unspezifische Bindung, indem Sie die Modelle mit 3 ml 5% Rinderserumalbumin (BSA) in PBS für 1 Stunde bei Raumtemperatur inkubieren. Entferne die Blocklösung und gehe zum nächsten Schritt über.
  9. Inkubieren Sie die Modelle über Nacht bei 4 °C mit einem Färbungscocktail, der antihumane Zonula Occludens-1 (ZO-1) mit Alexa Fluor 594 bei 1:100 Verdünnung, Phalloidin konjugiert mit Alexa Fluor 488 bei 1:1000 Verdünnung zur Beurteilung von F-Aktin und der nuklearen Färbung DAPI bei 1:4000 enthält. Der Verdünner enthält 1 ml 1 % BSA im PBS. Klebe vor der Inkubation die Ränder der Platte bei 4 °C ab.
  10. Am nächsten Tag aspirieren Sie die Flecken-Cocktaillösung und waschen Sie die Modelle dreimal mit PBS.
  11. Bild mit einem konfokalen Mikroskop auf und nimm Z-Stacks mit 5 μm Scheiben repräsentativer Organoide mit 40-facher Objektivvergrößerung.
  12. Analysieren Sie die Fluoreszenzintensität mit der Fiji-Bildanalyse-Software. Normalisieren Sie die mittlere Fluoreszenzintensität mit der Fläche des Organoids, um einen genauen Vergleich über verschiedene Umweltbedingungen zu gewährleisten.

7. Funktionelle Charakterisierung von Organoiden mittels ELISA- und Laktatdehydrogenase-(LDH)-Zytotoxizitätstests

  1. Auftauen Sie Supernatanten auf Eis und prüfen Sie die Sekretion von Interleukin-6 (IL-6) und Interleukin-8 (IL-8) mit handelsüblichen ELISA-Kits gemäß dem Protokoll des Herstellers.
  2. Bewerten Sie die Freisetzung von LDH, einem Marker der Zytotoxizität, mithilfe eines kommerziell erhältlichen LDH-Absorptionstests.
  3. Erzeugen Sie eine Standardkurve mit rekombinantem LDH-Protein bei halben Log-Konzentrationen von 0,5 μg bis 0,5 ng. Interpolieren Sie LDH-Konzentrationen aus jeder Probe mit der Standardkurve.

8. Optional: Isolierung von Proben für RNA- oder Proteinanalysen

  1. Anstatt 4 % Paraformaldehyd für die Immunfluoreszenzfärbung hinzuzufügen, fügen Sie einen vorbereiteten RLT-Puffer mit β-Mercapttoethanol bei 10 μL pro 1 ml RLT hinzu.
  2. Verwenden Sie 300 μL pro Modell und pipeten Sie auf und ab, um die Zellen vollständig abzutrennen und zu lysieren.
  3. Übertragen Sie das Lysat in ein RNase-freies Mikrozentrifugenrohr und legen Sie die Röhren auf Trockeneis zum schnellen Einfrieren. Auf -80 °C für die Langzeitlagerung übertragen.
    HINWEIS: Alternativ kann man den RIPA-Puffer für die Proteinextraktion verwenden, indem man vorbereitet: 50 mM Tris-HCl, pH 7,4–7,5; 150 mM NaCl; 1 % NP-40 oder Triton X-100; 0,5 % Natriumdeoxycholat; 0,1 % SDS in deionisiertem Wasser. Ein vorgefertigter RIPA-Puffer ist ebenfalls kommerziell erhältlich.
  4. Fügen Sie 200 μL pro Modell hinzu, legen Sie 5 Minuten auf Eis und nehmen Sie dann das Lysat ein.
  5. Schleudern Sie bei 15.000 x g für 10 Minuten bei 4 °C auf Pelletzellenreste und übergeben Sie sie auf -80 °C für die Langzeitlagerung.

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Ergebnisse

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Zelllinien-abgeleitete alveoläre epitheliale Fibroblast-Organoide wurden etabliert und über 21 Tage lang kultiviert. Während dieser Zeit wurden morphologische Veränderungen beobachtet, wobei an den Tagen 3, 9 und 21 Anzahl der Organoide, Fläche und Durchmesser bewertet wurden, um Wachstum und Entwicklung zu überwachen. Die durchschnittliche Anzahl von Organoiden pro Bohrloch sank an den Tagen 9 und 21 signifikant im Vergleich zu Tag 3 (Abbildung 2A). Im Gege...

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Diskussion

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Dreidimensionale (3D) alveoläre Epithel-Fibroblast-Organoide stellen eine physiologisch hochrelevante Plattform zur Modellierung der Lungenstruktur und -funktion unter mechanischer Belastung dar. Im Gegensatz zu 2D- oder sogar 3D-Kokultursystemen bewahren Organoide wichtige Merkmale der in vivo Lungenmikroumgebung, darunter räumliche Organisation, epithelial-mesenchymale Übersprechen und extrazelluläre Matrix (ECM)-Interaktionen14. Mechanische Belastung s...

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Offenlegungen

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Die Autoren erklären, dass die Forschung ohne kommerzielle oder finanzielle Beziehungen durchgeführt wurde, die als potenzieller Interessenkonflikt ausgelegt werden könnten.

Danksagungen

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Die Autoren würdigen die Unterstützung des Providence Airway Center bei Providence Health Care, dessen Beiträge die Fertigstellung dieses Manuskripts ermöglichten. Diese Arbeit wurde von MITACS (ID IT27789) in Zusammenarbeit mit dem Providence Airway Center (PAC) von Providence Health Care (PHC) und dem Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada (NSERC) (IDs AWD-024378 und AWD-024440) finanziert.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
1,5 mL MikrozentrifugenröhreEppendorf0030 125.215
15 mL konische RöhreFisher Scientific14-959-53A
16 % ParaformaldehydThermo Fisher Scientific28908
2-MercapptoethanolMillipore SigmaM3148
50 mL konische RöhreFisher Scientific14-432-22
6-Well-(flexible Membran) Tissue Train kreisförmige SchaumstoffplatteFlexcell InternationalTTCF-5001
A549-ZellenSammlung der amerikanischen Typkultur (ATCC)CCL-171
LuftkompressorCalifornia Air Tools10020DSPCAD
RinderserumalbuminMillipore SigmaA9418
Puffer RLTQiagen79216
CO2 InkubatorPHCBIMCO-170AICUVL-PA
Cultrex-Organoid-ErntelösungBio-Techne3700-100-01
CyQUANT LDH Zytotoxizitäts-Assay-KitThermo Fisher ScientificC20300
DAPI (4′,6-diamidino-2-phenylindol)Thermo Fisher ScientificD1306
DimethylsulfoxidSigma AldrichD2650-100ML
Dulbecco' s modifizierte Adler' s medium (DMEM)Thermo Fisher Scientific11965092
EVOS XL Core MikroskopThermo Fisher ScientificAMEX1200
Fetales Rinderserum (FBS)Thermo Fisher ScientificA5209501
Fiji-Bildanalyse-SoftwareNationale Gesundheitsinstitute
Flexcell FX-6000 Zug- und Gewebezugsystem (umfasst Flexlink FX-6000 Zugregler, Druckreservoir, Grundplatten, Acrylfenster, zylindrische Ladestationen mit 25 mm Durchmesser, Wasserfall, FlexSoft FX-6000 V1.0 Software und verschiedene Schläuche)Flexcell InternationalFX6000T
Humanes Interleukin-6 Duoset ELISABio-TechneDY206
Humanes Interleukin-8 Duoset ELISABio-TechneDY208
Leica DMi8 KonfokalmikroskopLeica Microsystems11889122
Matrigel-Basementmembran-MatrixCorning356237
MRC-5-ZellenATCCCCL-185
ParafilmMillipore SigmaP7793
Penicillin/Streptomycin (Pen/Strep)Thermo Fisher Scientific15140122
Phalloidin-Markierungssonden, Alexa Fluor 488Thermo Fisher ScientificA12379
Phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS)Thermo Fisher Scientific14190-144
Rattenschwanzkollagen ISigma-AldrichC3867
Rekombinantes humanes Laktatdehydrogenaseprotein (aktiv)AbcamAb93699
RIPA-LysepufferThermo Fisher Scientific89901
RNase-freie MikrofugeröhrchenThermo Fisher ScientificAM12400
T75 cm2 KulturkolbenGreiner658175
Triton X-100Sigma-AldrichX100-5ML
ZO-1 monoklonaler Antikörper (ZO1-1A12), Alexa Fluor 594Thermo Fisher Scientific339194

Referenzen

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Formal Correction: Erratum: Generation of 3D Collagen-Embedded A549/MRC-5 Alveolar Organoids using a Mechanical Cell-Stretching Bioreactor
Posted by JoVE Editors on 8/19/2026. Citeable Link.

This corrects the article 10.3791/69447

Schlagwörter

3D KollagenA549 ZellenMRC 5 Fibroblastenmechanische Dehnungepitheliale Fibroblasten OrganoideImmunf rbungsmarkerOrganoid CharakterisierungMechanotransduktion
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