Methodenartikel

Mikrofabrikation von Substraten mit mikroskaligen Steifigkeitsgradienten zur Steuerung der Migration von Stromazellen im Knochenmark

DOI:

10.3791/69473

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14. November 2025

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1State Key Laboratory of Oral & Maxillofacial Reconstruction and Regeneration, Key Laboratory of Oral Biomedicine Ministry of Education, Hubei Key Laboratory of Stomatology, School & Hospital of Stomatology, Wuhan University, 2School of Power and Mechanical Engineering, The Institute of Technological Science, Wuhan University, 3Department of Oral Implantology, School and Hospital of Stomatology, Wuhan University

* These authors contributed equally

In diesem Artikel

Zusammenfassung

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Dieses Protokoll beschreibt die Herstellung eines zweischichtigen Polydimethylsiloxan (PDMS)-Substrats mittels weicher Lithographie. Die Methode nutzt geometrisch modulierte Mikrostrukturen in einer starren Unterschicht in Kombination mit einer weichen, flachen Deckschicht, um effektive Steifigkeitsgradienten auf der Mikroskala zu erzeugen, die zelluläre mechanobiologische Untersuchungen ohne topographische Interferenz ermöglichen.

Zusammenfassung

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Zu verstehen, wie Zellen auf mechanische Signale reagieren, ist entscheidend für die Aufklärung der Mechanismen, die an der Gewebeentwicklung und dem Fortschreiten der Krankheit beteiligt sind. Vorhandene in vitro Zellkultursubstrate sind jedoch oft nicht in der Lage, die physiologischen Steifigkeitsgradienten auf zellulärer Ebene zu replizieren und gleichzeitig verwirrende topographische Hinweise zu eliminieren. In dieser Studie stellen wir ein entkoppeltes Steifigkeitsmodell vor, das ein zweischichtiges Polydimethylsiloxan (PDMS)-Substrat verwendet. Dieses Substrat besteht aus einer weichen, flachen Deckschicht, die über einer starren Unterlage mit Rillen- und Rillenmikrostrukturen aufgehängt ist. Die Deckschicht überträgt effektiv Steifigkeitsschwankungen in der darunter liegenden Struktur und behält gleichzeitig eine gleichmäßige Topographie und Chemie an der Zellkontaktfläche bei. Die Steifigkeitsmodulation wird durch Variation der Breite der abwechselnden Rillen und Rillen erreicht, die gleichmäßig verteilt sind. Die Rasterelektronenmikroskopie bestätigte die Morphologie der flachen Oberfläche und die konsistente Kontakttopographie. Die Rasterkraftmikroskopie zeigte, dass die Steifigkeitsschwankungen von der Mikrostruktur abhängen: Bei 20-μm-Mustern betrugen die Elastizitätsmodule etwa 950 kPa für Rillen und 850 kPa für Rillen; für 50-μm-Muster lagen diese Werte bei etwa 1070 kPa bzw. 950 kPa. Primäre Knochenmarkzellen der Maus hafteten gut und verteilten sich auf dem Substrat, was eine Präferenz für die Kernlokalisation in Richtung der steiferen Kammregionen im 50-μm-Muster zeigte (61,49%, p < 0,05), was eine effektive zelluläre Wahrnehmung des mechanischen Gradienten bestätigt. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass dieses Protokoll eine reproduzierbare Methode zur Konstruktion eines Zellkultursubstrats mit mikroskaligen Steifigkeitsgradienten bietet, die chemische oder topographische Interferenz minimiert und Untersuchungen der Zellmechanotransduktion ermöglicht.

Einleitung

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Zellen haben die Fähigkeit, mechanische Reize in ihrer äußeren Mikroumgebung wahrzunehmen und darauf zu reagieren 1,2,3, die für die Regulierung verschiedener zellulärer Prozesse wie Adhäsion, Migration, Proliferation und Differenzierung entscheidend sind4. In vivo weisen die mechanischen Eigenschaften der Mikroumgebung des Gewebes eine signifikante räumliche Heterogenität auf, wobei Variationen in der Matrixsteifigkeit sowohl in physiologischen Kontexten - wie an den Verbindungsstellen von Knochen und Muskeln - als auch unter pathologischen Bedingungen, wie z. B. in Tumoren, beobachtet werden 5,6,7. Eine umfassende Untersuchung dieser mechanischen Faktoren ist essentiell, um die Regulationsmechanismen zu verstehen, die das Zellverhalten steuern. Diese Mechanismen sind entscheidend für Prozesse wie die Gewebeentwicklung, das Fortschreiten der Krankheit sowie den Prozess der Regeneration und Reparatur 8,9.

Um diese komplexe mechanische Mikroumgebung in vitro zu simulieren, werden häufig Hydrogele oder Elastomere verwendet, um Substrate mit unterschiedlicher Steifigkeit zu erzeugen, indem der Vernetzungsgrad oder das Komponentenverhältnis 3,10,11,12,13 eingestellt wird. Diese Methoden führen jedoch häufig zu diskreten Steifigkeitsänderungen, die die kontinuierlichen Steifigkeitsgradienten auf der Mikroskala, die die physiologischen Bedingungen genau nachahmen, nicht reproduzierenkönnen 13,14,15,16,17. Neuere Studien haben Techniken wie die optische Vernetzung (z. B. die Verwendung einer Fotomaske zur Regulierung der UV-Exposition)18, das mikrofluidische Mehrkanalmischen19,20 und diffusionsgetriebene Mittel21 zur Konstruktion von Steifigkeitsgradienten untersucht. Leider können diese Ansätze technisch komplex sein und zusätzliche Variablen wie Maschenweite22, Schwellung 23,24 und Topographie25 einführen. Die Einführung von Störfaktoren erschwert die Interpretation der zellulären Reaktionen auf Steifigkeit. Ein zweischichtiges PDMS-System, das Mikrosäulenarrays oder Schachbrettmuster als Stützstruktur verwendet, wurde verwendet, um Zellkultursubstrate mit Steifigkeitsgradienten 26,27 herzustellen. Diese Ansätze beruhen auf diskreten darunter liegenden Stützen unter einer chemisch homogenen Membran, um eine isotrope Steifigkeitsmodulation zu erreichen und wertvolle Plattformen für die Untersuchung der Zelladhäsion und -ausbreitung zu bieten. Die native zelluläre Mikroumgebung in vivo ist jedoch in ihren mechanischen Eigenschaften oft stark anisotrop28,29. Es wird postuliert, dass diese gerichtete mechanische Signalübertragung grundlegende biologische Ereignisse tiefgreifend beeinflusst. Daher sind die derzeitigen Biofabrikationsstrategien nur begrenzt in ihrer Fähigkeit, die in vivo beobachteten subtilen Zell-Steifigkeits-Wechselwirkungen zu replizieren, die auf der genauen Nachahmung von mikroskaligen Steifigkeitsgradienten und räumlicher Heterogenität innerhalb zellbeladener Substrate beruhen.

Frühere Forschungen haben gezeigt, dass Zellen die effektive Steifigkeit starrer Objekte auch dann wahrnehmen können, wenn sie nicht in direktem Zellkontakt stehen30. Basierend auf dieser Studie stellen wir ein neuartiges zweischichtiges Polydimethylsiloxan (PDMS)-Zellkultursubstrat vor, das kontrollierte Steifigkeitsgradienten auf räumlichen Skalen von 5 bis 50 μm erzeugt, die mit dem Größenbereich übereinstimmen, der für die subzelluläre und einzelzellige Mechanosensorik relevant ist. Das Substrat besteht aus zwei unterschiedlichen Schichten: einer starren PDMS-Unterlage mit einstellbaren geometrischen Mikrostrukturen und einer gleichmäßigen, flachen, weichen PDMS-Deckschicht, die als zellberührende Oberfläche dient. Dieses Design ermöglicht eine mechanische Modulation ausschließlich durch Variationen in der Geometrie der Unterstruktur, während eine konsistente Oberflächenchemie und Topographie beibehalten wird. Folglich entkoppelt es das Steifigkeitssignal effektiv von anderen physikalischen und chemischen Hinweisen und bietet ein biologisch relevanteres System zur Steifigkeitsmodulation.

Im Gegensatz zu herkömmlichen Hydrogel-basierten Substraten ermöglicht unser Ansatz einvariable mechanische Studien ohne Interferenz durch Quellung, Maschenweite oder Oberflächentopologie. Das Substrat lässt sich einfach mit der Standard-Softlithographie herstellen und ist hochgradig reproduzierbar31. Es ist auch mit hochauflösender Mikroskopie kompatibel und eignet sich daher besonders gut für die Live-Bildgebung und quantitative Studien der zellulären Reaktionen auf mikroskalige Steifigkeitshinweise. Dieses Manuskript stellt das vollständige Herstellungsprotokoll vor, beschreibt die Strategie zur Parametersteuerung und demonstriert die Nützlichkeit des Substrats mit repräsentativen Zellkulturexperimenten. Letztendlich bietet dieser Ansatz ein robustes und zugängliches In-vitro-Werkzeug zur Erforschung der Zellreaktionen auf einen mikroskaligen Steifigkeitsgradienten.

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Protokoll

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Primäre Maus-Knochenmark-Stromazellen (mBMSCs) wurden aus der Tibia und dem Femur von Mäusen isoliert (Nr. WP20230204, genehmigt von der Ethikkommission des Wuhan University Center for Animal Experimentation).

1. Vorbereitung der Meisterform

HINWEIS: Unsere Protokolle sind spezifisch für Negativ-Fotolack auf Epoxidbasis, der während dieser Forschung verwendet wird.

  1. Legen Sie zwei saubere Siliziumwafer (50,8 ± 0,2 mm, <100> orientiert, 525 ± 25 μm) für einige Minuten zum Dehydrieren auf die Heizplatte.
  2. Nehmen Sie einen Siliziumwafer von der Heizplatte und kühlen Sie ihn auf Raumtemperatur ab, bevor Sie mit der Schleuderbeschichtung fortfahren. Tragen Sie 3-5 mL Fotolack auf die Wafermitte auf.
  3. Um eine Strukturhöhe von 20 μm zu erhalten, wenden Sie das folgende Spin-Protokoll an: Spin für 10 s bei 7,1 × g, gefolgt von Spin bei 410 × g für 30 s. Um eine Strukturhöhe von 30 μm zu erhalten, wenden Sie das folgende Spin-Protokoll an: Spin für 10 s bei 7,1 × g, gefolgt von Spin bei 170 × g für 30 s. Verwenden Sie vorsichtig ein Skalpell, um Kantenraupen zu entfernen, die sich während der Schleuderbeschichtung bilden können.
  4. Auf folgende Weise weich backen: Die Herdplatte auf 95 °C stellen, den Wafer 13 min auf der Herdplatte ziehen lassen. Nehmen Sie den Wafer von der Kochplatte und lassen Sie ihn auf natürliche Weise auf Raumtemperatur abkühlen, um einen plötzlichen Temperaturabfall zu vermeiden.
  5. Richten Sie die Fotomaske auf dem mit Fotolack beschichteten Wafer aus und belichten Sie sie mit einer Gesamtdosis von 120 mJ/cm2 UV-Licht.
  6. Nach der Belichtung wie folgt backen: Lassen Sie den mit Fotolack beschichteten Wafer mit zwei Heizplatten (65 °C und 95 °C) 1 Minute auf der 65 °C-Kochplatte ruhen, bevor Sie ihn auf die 95 °C-Kochplatte geben und dort 5 Minuten stehen lassen. Schieben Sie den Wafer auf einen Stapel Mikrofasertücher und lassen Sie ihn auf Raumtemperatur abkühlen.
  7. Entwickeln Sie den Wafer, indem Sie ihn in eine mit PGMEA gefüllte Petrischale überführen, und tauchen Sie den gesamten Wafer in den Entwickler. Beschleunigen Sie die Entwicklung durch manuelles Rühren.
    HINWEIS: PGMEA ist brennbar und reizt die Augen und Atemwege. Entsorgen Sie es als "brennbaren organischen Abfall" in dafür vorgesehenen Behältern.
  8. Nehmen Sie den Wafer nach der Entwicklung aus dem Entwickler und waschen Sie ihn in Isopropanol. Wenn sich im Isopropanol in der Nähe der Probenoberfläche ein milchig-weißer Fluss bildet (die Entwicklung ist noch nicht abgeschlossen), tauchen Sie die Probe wieder in den Entwickler, um den Entwicklungsprozess abzuschließen. Waschen Sie die entwickelte Probe in Isopropanol, bis sich keine milchig-weiße Strömung in der Nähe der Probenoberfläche bildet. Sobald der Fotolack vollständig entwickelt ist, backen Sie ihn hart, indem Sie den Wafer 15 Minuten lang auf eine 150 °C heiße Platte legen.
  9. Fluorieren Sie den Wafer für die folgenden Softlithographie-Prozesse: Setzen Sie den Wafer 30 s (100 W) lang Sauerstoffplasma unter Vakuum aus, um die Oberfläche zu aktivieren, und legen Sie ihn dann in einen Vakuumexsikkator. 30 μl Trichlor(1H,1H,2H,2H-tridecafluor-n-octyl)-silan auf einen Objektträger in den Vakuumexsikkator tropfen. Evakuieren Sie den Exsikkator für 2 Minuten und halten Sie den Vakuumzustand für 30 Minuten aufrecht. Den Wafer bei 90 °C 1 h backen, um den Silanisierungsprozess abzuschließen.
    HINWEIS: Kontrollieren Sie die relative Luftfeuchtigkeit während des gesamten Vorgangs streng unter 60 %. Übermäßige Feuchtigkeit kann zu einer schnellen Hydrolyse des Silans führen, wodurch weiße, nichtflüchtige Polysiloxanausfällungen entstehen. Die Ausfällungen beeinträchtigen die Gleichmäßigkeit der Silandampfverteilung, was zu einer fehlgeschlagenen Silanisierung führt. Führen Sie die Behandlung in einer Haube durch, da Trichlorsilan (1H, 1H, 2H, 2H-tridecafluor-n-octyl) heftig mit Wasser reagiert und giftige HCl-Dämpfe freisetzt. Vor der Entsorgung als fluorierter/chlorierter organischer Abfall mit verdünntem Alkali neutralisieren. Der Silanisierungsprozess erreicht eine Erfolgsquote von 90 %.

2. Herstellung

HINWEIS: Der Softlithographie-Prozess, der zur Herstellung des Doppelschicht-Polydimethylsiloxan-Substrats (PDMS) verwendet wird, kann in zwei verschiedene Schritte unterteilt werden: 1) Die Vorbereitung sowohl der strukturierten Unterschicht als auch der oberen Schicht, 2) die Verklebung der beiden PDMS-Schichten. Die Gesamtausbeute bei der Herstellung liegt bei über 80 %.

  1. PDMS-Vorbereitung
    1. Für die strukturierte Unterlage wird der PDMS-Vorläufer hergestellt, indem das Prepolymer und das Härter im Verhältnis 10:1 gemischt und anschließend unter Vakuum entgast werden. Gießen Sie 1,5 mL des PDMS-Vorläufers (10:1) auf die SU8-Urform, decken Sie die gesamte Oberfläche ab, entgasen Sie es unter Vakuum und ruhen Sie 30 Minuten lang. Vorsichtig in den Ofen schieben und bei 90 °C 1 h aushärten. Entformen Sie die strukturierte PDMS-Unterlage aus der Urform.
    2. Für die Deckschicht wird der PDMS-Vorläufer vorbereitet, indem das Prepolymer und das Härter im Verhältnis 30:1 gemischt und unter Vakuum entgast werden. Gießen Sie den PDMS-Vorläufer auf einen fluorierten Siliziumwafer. Um eine Dicke von 9 μm zu erhalten, wenden Sie das folgende Schleuderbeschichtungsprotokoll an: Schleudern Sie 10 s lang bei 7,1 × g , gefolgt von einem Schleudern bei 2.300 × g für 60 s.
    3. Nach der Schleuderbeschichtung prüfen Sie die PDMS-Folie unter Umgebungslicht visuell, um sie auf Gleichmäßigkeit zu prüfen – insbesondere auf sichtbare Defekte wie Schlieren, Blasen oder ungleichmäßige Kantenbildung. Wenn die Folie gleichmäßig transparent mit gleichbleibendem Reflexionsvermögen über die gesamte Waferoberfläche erscheint, fahren Sie mit dem nächsten Schritt fort. Wenn nicht, wiederholen Sie den Schleuderbeschichtungsprozess mit einem neuen Wafer. Legen Sie den beschichteten Wafer auf eine ebene Fläche, um eine homogene PDMS-Schichtdicke zu gewährleisten. Vorsichtig in den Ofen schieben und bei 90 °C 3 h aushärten.
      HINWEIS: Es wurden Folien mit einer Dicke von 9,11 ± 0,34 μm erhalten.
  2. Bindung
    1. Legen Sie die strukturierte PDMS-Unterlage (10:1) mit der gemusterten Seite nach unten auf die PDMS-Deckschichtfolie, um einen guten Kontakt zwischen den beiden Schichten ohne Blasenbildung an der Schnittstelle zu gewährleisten.
    2. Die Baugruppe in den Ofen schieben und bei 90 °C 3 h aushärten.
    3. Lassen Sie die Montage auf einem Stapel Mikrofasertücher auf Raumtemperatur abkühlen. Lösen Sie die endgültige Doppelschichtstruktur vom Wafer und lagern Sie sie zur weiteren Verwendung in einer Petrischale.
      HINWEIS: Wenn sich beim Abschälen Blasen zwischen der Deckschicht und der Unterschicht bilden, deutet dies in der Regel auf eine unvollständige Haftung zwischen den beiden Schichten hin. Stellen Sie sicher, dass der PDMS-Vorläufer vor dem Schleudern gründlich entgast wird, und stellen Sie sicher, dass die Folienoberfläche frei von Staub oder Verunreinigungen ist, bevor Sie die PDMS-Unterschicht für vollen Kontakt auftragen. Stellen Sie sicher, dass der Siliziumwafer während der Schleuderbeschichtung, Montage und Aushärtung waagerecht ist. Filmrisse können aufgrund der ungleichmäßigen Silanisierung des Wafers oder einer ungleichmäßigen PDMS-Dicke auftreten. Um das Problem zu lösen, kontrollieren Sie die Umgebungsfeuchtigkeit während der Silanisierung unter 60 % RH streng. Der Silanisierungsprozess erreicht eine Erfolgsquote von 90 %.

3. Charakterisierung

  1. Rasterelektronenmikroskopie (REM)
    1. Schneiden Sie die Probe mit einer scharfen Klinge, um saubere Kanten zu erhalten.
    2. Montieren Sie die Proben auf 90°- und 0°-REM-Tischen mit leitfähigem Kohlenstoffband, um eine Querschnitts- bzw. Oberflächencharakterisierung zu ermöglichen.
    3. Sputtern Sie die Proben 120 s lang mit Gold, um die Qualität der REM-Bildgebung zu verbessern und REM-Bilder der Proben zu sammeln.
  2. Rasterkraftmikroskopie (AFM)
    HINWEIS: Wählen Sie die ScanAsyst-Air-Sonde für die quantitative nanomechanische Abbildung des Moduls.
    1. Positionieren Sie die Auslegerspitze des AFM in der Mitte des Sichtfelds. Positionieren Sie den Laserspot ganz am Ende des Auslegers, indem Sie das optische Hebelsystem ausrichten.
    2. Kalibrieren Sie vor PeakForce Quantitative Nanomechanical Mapping (PeakForce QNM)-Messungen den AFM-Cantilever, um die folgenden wesentlichen Parameter zu bestimmen: Cantilever-Federkonstante: 0,40135 N/m; Ablenkungsempfindlichkeit: 28,993 nm/V (bestimmt durch Durchführung einer Kraftkurve an einer starren Referenzprobe); Spitze Radius: ~21 nm (kalibriert mit der relativen Methode gegen eine Referenzprobe mit bekanntem Modul).
    3. Konfigurieren Sie im Scan-Bereich der Liste der Scan-Parameter die folgenden anfänglichen Scan-Einstellungen: Stellen Sie die Scan-Größe auf 70 μm für Proben mit periodischen Streifen mit einem Abstand von 50 μm ein. Stellen Sie die Scangröße auf 50 μm für Proben mit periodischen Streifen mit einem Abstand von 20 μm ein. Stellen Sie Samples/Line und Lines auf 256 ein (was zu einem Bild mit 256 x 256 Pixeln führt).
    4. Öffnen Sie die Engage-Einstellungen im Mikroskop und legen Sie den standardmäßigen Sollwert für den Spitzenkraft-Einrastwert des Instruments in den Einrastparametern fest.
    5. Klicken Sie auf das Symbol "Aktivieren " in der Workflow-Symbolleiste und fahren Sie mit der Überwachung der Echtzeitsignale während des automatisierten Ansatzes fort.
    6. Stellen Sie sicher, dass ScanAsyst Auto Control auf den individuellen Modus eingestellt ist. Stellen Sie den PeakForce-Sollwert auf einen geeigneten Wert ein, um den gewünschten Verformungsbereich zu erreichen: Für die oberste Schicht beträgt der PeakForce-Sollwert 0,020 nN; für die strukturierte Unterschicht beträgt der PeakForce-Sollwert 5 nN.
    7. Starten Sie den Scan, indem Sie auf die Schaltflächen von oben nach unten oder von unten nach oben klicken.
    8. Überwachung und Korrektur von Kraftkennlinien: Wenn Kraftkurven verzerrt erscheinen oder Synchronisationsprobleme auftreten (z. B. unregelmäßige Formen, inkonsistente Basislinien), klicken Sie mit der rechten Maustaste in das Fenster Kraftmonitor und wählen Sie Automatische Konfiguration , um die Ausrichtung und Empfindlichkeit der Kraftkurve automatisch zu korrigieren.
    9. Wählen Sie in den Einstellungen für den Modulberechnungskanal DMT-Modell aus, um den Rückzugsteil der Kraftkurve für die Berechnung des Elastizitätsmoduls anzupassen.
    10. Klicken Sie auf die Schaltfläche Erfassen , um die hochauflösende Topografie und die Karte der nanomechanischen Eigenschaften abzurufen und zu speichern.
    11. Führen Sie eine Analyse nach der Erfassung mit der Bildverarbeitungs- und Analysesoftware AFM durch. Öffnen Sie die gespeicherten AFM-Datendateien, und extrahieren Sie Modulwerte, indem Sie Bereiche auf der Probenoberfläche auswählen. Berechnen Sie den durchschnittlichen Modul, die Standardabweichung und die Verteilungsprofile sowohl für die oberste als auch für die untere Schicht mit den integrierten statistischen Analysewerkzeugen der Software. Exportieren Sie verarbeitete Modulkarten und quantitative Daten.
    12. Anzahl der AFM-Scans pro Probe: Führen Sie drei unabhängige vollflächige Scans für jede Probe durch. Stellen Sie sicher, dass jeder Scan einen Bereich abdeckt, der der strukturellen Merkmalsgröße der Probe entspricht, nämlich 70 μm × 70 μm für Proben mit periodischen Streifen im Abstand von 50 μm und 50 μm × 50 μm für Proben mit Streifen mit einem Abstand von 20 μm. Für Modulmessungen der darunter liegenden Struktur (10:1 PDMS) und der Deckschichtfolie (30:1 PDMS) implementieren Sie die folgende Probenahmestrategie, um die Zuverlässigkeit der Daten zu gewährleisten.
      1. Deckschichtfolie (30:1 PDMS): Messen Sie den Modul 2x unabhängig voneinander, wobei jede Messung aus zwei nicht überlappenden 5 μm × 5 μm Scans besteht.
      2. Zugrunde liegende Struktur (10:1 PDMS): Gemessen an den beiden unterschiedlichen periodischen Streifenkonfigurationen (20 μm und 50 μm Abstand) ist der Modul für jede Konfiguration 2x unabhängig voneinander zu messen.

4. In-vitro-Zellkultur-Experiment

HINWEIS: PDMS ist ein hydrophobes Material, das beschichtet werden muss, um die Zelladhäsion vor der Zellkultur zu fördern, und die geeignete Beschichtungsmethode sollte je nach Zelltyp ausgewählt werden. Eine ethische Genehmigung muss eingeholt werden, wenn Primärzellen für das zelluläre Experiment verwendet werden.

  1. Poly-D-Lysin (PDL)-Beschichtung
    1. Sterilisieren Sie das Substrat durch Eintauchen in Alkohol für 10 Minuten; dann 3 x 5 min mit PBS waschen.
    2. Lösen Sie PDL (Molekulargewicht 150.000 bis 300.000 Da) mit PBS in einer Konzentration von 0,1 mg/ml. Für das Substrat mit 24-Well-Plattengröße fügen Sie 1 ml PDL-Arbeitslösung hinzu und legen Sie es für 4 Stunden in einen 37 °C-Inkubator, um die Substratoberfläche vollständig zu beschichten.
    3. Nachdem die Beschichtung abgeschlossen ist, entfernen Sie die PDL-Arbeitslösung und entfernen Sie alle PDL-Reste, indem Sie sie 3x mit PBS waschen. Verwenden Sie das Substrat für nachfolgende Zellexperimente. Wenn die Beschichtung nicht sofort verwendet wird, trocknen Sie sie und lagern Sie sie bei 4 °C.
      HINWEIS: Eine erfolgreiche Beschichtung präsentierte unter Phasenkontrastmikroskopie eine homogene, strukturlose Oberfläche ohne sichtbare kristalline Ausfällungen oder Trocknungsartefakte. Substrate mit Anzeichen von Kristallisation oder ungleichmäßiger Beschichtung wurden verworfen.
  2. Isolierung und Kultivierung von primären Maus-Knochenmark-Stromazellen (mBMSCs)
    1. Isolieren Sie primäre Knochenmarkstromazellen (mBMSCs) der Maus aus der Tibia und dem Femur von Mäusen.
    2. Kultivieren Sie die Zellen in einem Wachstumsmedium, das aus α-MEM besteht, das mit 10 % fötalem Rinderserum (FBS), 1 % Antibiotikum-Antimykotikum und 1 % Natriumpyruvat ergänzt wird.
    3. Samenzellen an der Passage 3 auf die in Schritt 4.1.3 erhaltenen Substrate mit einer Dichte von 5.000 Zellen/cm2 , um mögliche Störeffekte durch Zell-Zell-Kontakt zu minimieren.
  3. Immunfluoreszenzfärbung und Bildgebung
    1. Nach 16 h Kultur (37 °C, 5 % CO2) die Zellen 10 min lang bei Raumtemperatur mit 4 % Paraformaldehyd fixieren und 3x mit PBS waschen. Anschließend die Zellen mit 0,1% Triton X-100 für 15 min bei Raumtemperatur permeabilisieren und 3x mit PBS waschen.
    2. Für die Visualisierung des Zytoskeletts färben Sie das F-Aktin 20 Minuten lang bei Raumtemperatur mit Phalloidin (1:500 Verdünnung) und waschen Sie es 3x mit reichlich PBS, um eventuelle Farbstoffreste zu entfernen.
    3. Montieren Sie das Substrat bei gleichzeitiger Färbung der Zellkerne. Tragen Sie einen Tropfen Glycerin mit DAPI auf, um die Zellen zu bedecken. Legen Sie danach vorsichtig ein Deckglas auf den Untergrund und versiegeln Sie die Ränder mit Nagellack. Vermeiden Sie Blasen so weit wie möglich.
    4. Erfassen Sie Fluoreszenzbilder, die die zelluläre Morphologie und die Kernpositionierung mit einem inversen Fluoreszenzmikroskop erfassen.

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Ergebnisse

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Die Photolithografie wurde zur Herstellung wiederverwendbarer Silikon-Masterformen mit parallelen Rillen-und-Rillen-Mikrostrukturen eingesetzt. Es wurden zwei Designs mit einer Rillenbreite (die Rillenbreite ist identisch mit der Rillenbreite) von 20 bzw. 50 μm entwickelt. Jede gemusterte Fläche maß 7 mm × 7 mm. Die Präzision und Wiederverwendbarkeit der Silikonformen vereinfachte den Prozess der wiederholten Substratherstellung erheblich. Mit der Urform wurden dann die Mikrostrukturen in PDMS nachgebildet. Eine harte PD...

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Diskussion

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Diese Studie stellt einen neuartigen Ansatz vor, um ein zweischichtiges PDMS-basiertes Substrat zu entwickeln, das entwickelt wurde, um lokale Steifigkeitsvariationen einzuführen und gleichzeitig eine topographisch einheitliche strukturlose Oberfläche zu erhalten. Dieser Ansatz ermöglicht eine mechanische Modulation ausschließlich durch Variationen in der Geometrie der Unterstruktur, während eine konsistente Oberflächenchemie und Topographie beibehalten wird. Folglich entkoppelt es das S...

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Offenlegungen

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Die Autoren erklären, dass sie keine konkurrierenden finanziellen Interessen haben.

Danksagungen

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Diese Studie wurde finanziell unterstützt von den Fundamental Research Funds for the Central Universities of China (Nr. 2042024YXB018 an W. Ji).

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
  4 % ParaformaldehydServicebio-TechnologieG1101
AcetonShanghai Aladdin10000418
Anti-AntiGibco15240-062Antibiotikum-Antimykotikum
Antifade-Montagemedium mit DAPIBeyotime BiotechnologieP0131Glycerin mit DAPI 
ZellkulturplatteNEST70200124 Brunnen
ExsikkatorSichuan Shubo (Group) Co., Ltd913354-30SNInnendurchmesser=180 mm
Fetales RinderserumHyCloneSV30208.02
Invertiertes FluoreszenzmikroskopOlympDP74
IsopropanolShanghai Aladdin80109218GC≥ 99.7%
Masken-AlignerSichuan Nanguang Vacuum Technology Co., LtdH94-37
MEM Alpha-ModifikationHyCloneSH30265.01
NanoskopanalyseBrukerVersion 3.0AFM-Bildverarbeitungs- und Analysesoftware.
Opera Phenix Plus Hochgehalt-BildgebungssystemPerkin Elmer2400L23248 Ausgestattet mit 10x Luftobjektiv
PGMEASuzhou NanoMicro Technology Co., Ltd171011-1Entwickler-Negativ-Photoresist; SPEC: UL; Prozent: Min99,7%
PhalloidinUelandy YP0052L594-Phalloidin
Phosphatgepufferte KochsalzlösungHyCloneSH30256.01
PlasmareinigerPlasmatechnologie (Deutschland)Flecto 10 
Poly-D-lysinBeyotime BiotechnologieST508CAS-Nummer 27964-99-4
RastersondenmikroskopBrukerDimensionssymbolVerwendet Nanoscope-Steuerungssoftware, darunter PeakForce Quantitative Nanomechanical Mapping (PF-QNM) und Point-and-Shoot Ramping experimentelle Arbeitsbereiche.
Siliziumspitze am NitridhebelBrukerSCANASYST-AIRDie Sonde verfügt über einen einzelnen, V-förmigen, mit Al-Reflex beschichteten Cantilever; k= 0,4 N/m (nominal), f0 = 70 kHz.
SiliziumwaferShenzhen Rigorous Technology Co., Ltd-50.8± 0,3 mm Durchmesser, (100) ausgerichtet, 525 & plusmn; 25 & mu; m-Dicke
NatriumpyruvatGibco11360-070
Spin CoaterInstitut für Mikroelektronik der Chinesischen Akademie der WissenschaftenKW-4A
SU-8 3025Suzhou NanoMicro Technology Co., Ltd-Negativer Photoresist; 72,3 % Feststoff; Viskosität 4400; Dichte 1,143 g/ml
SYLGARD 184 Silikon-Elastomer-KitDie Dow Chemical Company01673921
Trichlor(1H,1H,2H,2H-Tridecafluor-n-Octyl)SilanShanghai Aladdin78560-45-9
Triton X-100BioFroxx1139ML1000,1 % Triton X-100 für Permeabilisierung
Trypsin-EDTAGibco25200-0720,25 % Trypsin-EDTA (1x)
VakuumofenMemmert (Deutschland) VO 200 

Referenzen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Vining, K. H., Mooney, D. J. Mechanical forces direct stem cell behaviour in development and regeneration. Nat Rev Mol Cell Biol. 18 (12), 728-742 (2017).
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