Molekularer Mechanismus von Hydroxyldistelgelb A bei Kniearthrose durch Modulation der Autophagie über Hemmung des HIF-1α/BNIP3-Signalwegs

Als weit verbreitete chronische orthopädische Erkrankung betrifft Kniearthrose (KOA) Menschen mittleren Alters und ältere Menschen und beeinträchtigt deren Lebensqualität erheblich ^1,2. Trotz ihres weit verbreiteten Auftretens sind die genaue Ätiologie und die pathophysiologischen Mechanismen, die der KOA zugrunde liegen, nach wie vor unvollständig verstanden. Darüber hinaus unterstreicht sowohl für die Prävention als auch für die kurative Behandlung die Dringlichkeit, die komplizierten pathologischen Grundlagen dieser Erkrankung zu enträtseln. Ein Bereich von aufkommendem Interesse ist die Rolle der Autophagie bei der Knorpelhomöostase, wobei sich die Hinweise häufen, dass eine reduzierte Autophagie im Knorpelgewebe zu dessen Degeneration bei KOA beiträgt ^3,4.

Die Autophagie, ein zellulärer Abbauprozess, der für die Aufrechterhaltung der zellulären Homöostase unerlässlich ist, ist von großer Bedeutung für die Erhaltung und Reparatur des Knorpels. In der hypoxischen Mikroumgebung, die im Gelenkknorpel vorherrscht, zeigt sich der Hypoxie-induzierbare Faktor 1α (HIF-1α)/Adenovirus E1B 19 kDa interacting protein 3 (BNIP3) Signalweg als zentraler Regulator der Autophagie. Bei KOA-Patienten wurde eine erhöhte HIF-1α-Expression beobachtet, was darauf hindeutet, dass eine Dysregulation dieses Signalwegs zu einer gestörten Autophagie und einer anschließenden Knorpeldegeneration beitragen kann ^5,6,7.

Akupunktur, Moxibustion, Kräuter und Massage sind vier klassische Methoden der traditionellen chinesischen Medizin zur Behandlung von Kniearthrose. Die derzeitigen Behandlungen, wie z. B. nichtsteroidale entzündungshemmende Medikamente, Hyaluronsäure-Injektionen und Endoprothesen, haben sich als hilfreich erwiesen, sind aber auch mit bestimmten Nebenwirkungen verbunden⁸. Darüber hinaus gibt es keine empfohlene Routinebehandlung für Kniearthrose. Im Laufe der Zeit hat die Traditionelle Chinesische Medizin (TCM) als gängige ergänzende Therapie für KOA zahlreiche pflanzliche Heilmittel entwickelt, die bei der Behandlung von KOA^{vielversprechend sind 9}. Unter diesen hat Hydroxyldistelgelb A aufgrund seiner entzündungshemmenden und autophagiemodulierenden Eigenschaften große Aufmerksamkeit erregt^10,11. Die genauen Mechanismen, durch die HSYA seinen therapeutischen Einfluss auf die Kniearthrose (KOA) ausübt, insbesondere im Hinblick auf die Regulation der Autophagie über den HIF-1α/BNIP3-Signalweg, bleiben jedoch ungewiss. Daher untersuchen wir den Mechanismus der therapeutischen Wirkung von HSYA bei KOA, indem wir uns auf ihren Einfluss auf die Chondrozyten-Autophagie und ihre Interaktion mit dem HIF-1α/BNIP3-Signalweg konzentrieren. Wir vermuten, dass HSYA die Kniearthrose abschwächt, indem es die Autophagie und Proliferation der Chondrozyten verbessert und gleichzeitig die Apoptose und Entzündung über die Hemmung des HIF-1α/BNIP3-Signalwegs unterdrückt.

Alle Verfahren, bei denen menschliche Proben verwendet werden, wurden von der Ethikkommission des Zhanjiang Central People's Hospital genehmigt (Zulassungs-Nr. KY-YS-2021-09). Vor der Probenentnahme wurde von allen Teilnehmern eine schriftliche Einverständniserklärung eingeholt. Die verwendeten Reagenzien und die verwendeten Geräte sind in der Materialtabelle aufgeführt.

1. Patienten und Studiendesign

Es wurden dreißig Patienten rekrutiert, bei denen Kniearthrose (KOA) diagnostiziert wurde und die sich einer Knie-Totalendoprothetik unterzogen. Die Kohorte umfasste 14 Männer und 16 Frauen im Alter von 52 bis 75 Jahren (mittlere ± SD: 64,3 ± 12,6 Jahre), die alle die KOA-Kriterien des American College of Rheumatology^{erfüllten 12}. Patienten wurden ausgeschlossen, wenn sie innerhalb von 2 Wochen vor der Operation nichtsteroidale Antirheumatika oder Steroide oder intraartikuläre Injektionen innerhalb von 1 Monat erhalten hatten.

2. Primäre Chondrozytenkultur

Der Gelenkknorpel wurde unmittelbar nach der Operation unter sterilen Bedingungen entnommen und in kaltes PBS gelegt. Mit sterilen Skalpellen wurde der Knorpel auf einer eiskalten Glasplatte in ~1 mm³ große Fragmente geschnitten und in ein 50 mL Zentrifugenröhrchen mit 10 mL 0,25% Trypsin-EDTA überführt. Das Röhrchen wurde 30 Minuten lang in einem 37 °C heißen Schüttelwasserbad bei 80 U/min inkubiert und alle 5 Minuten vorsichtig umgedreht, um die Verdauung zu erleichtern. Der Überstand wurde aspiriert, und das Gewebepellet wurde einmal mit PBS gewaschen und bei 200 × g für 5 min zentrifugiert. Das Pellet wurde dann in 10 ml 0,02 % Typ-II-Kollagenase resuspendiert und bei 37 °C für 4 h unter Schütteln verdaut. Die Suspension wurde alle 30 Minuten auf und ab pipettiert, um die Dissoziation zu fördern, durch ein 70-μm-Sieb geleitet und erneut bei 200 × g für 5 Minuten zentrifugiert. Das resultierende Pellet wurde in DMEM, ergänzt mit 10 % FBS, 100 μg/ml Penicillin und 100 μg/ml Streptomycin, resuspendiert und in T25-Kolben ausgesät. Die Zellen wurden bei 37 °C mit 5 % CO₂ inkubiert, das Medium wurde alle 2-3 Tage ausgetauscht und Zellen aus den Passagen 1-2 wurden für Experimente verwendet. Zu den Versuchsgruppen gehörten die Normalkontrolle, das Blindmodell, HSYA (100 μmol/L), der HIF-1α-Inhibitor YC-1 (10 μmol/L), Rapamycin (10 nmol/L), HSYA + YC-1 und HSYA + Rapamycin.

3. siRNA-vermittelter HIF-lα, BNIP3-Knockdown

Primäre Chondrozyten wurden in 6-Well-Platten mit 2-5 × 10⁵ Zellen/Well ausgesät und bei 37 °C kultiviert, bis sie eine Konfluenz von 30 % bis 50 % erreichten. Für jede Vertiefung wurden 5 μl 20 μM siRNA in 250 μl Opti-MEM verdünnt, und 5 μl lipidbasiertes Transfektionsreagenz wurden separat in 250 μl Opti-MEM verdünnt. Die beiden Lösungen wurden schonend gemischt und 15-20 min bei Raumtemperatur zu Komplexen inkubiert. Das Kulturmedium wurde durch 1,5 mL frisches DMEM mit 10 % FBS ersetzt, und der siRNA-Lipid-Komplex (500 μL) wurde tropfenweise entlang der Well-Wand unter sanftem Schwenken zugegeben. Die Zellen wurden 6 Stunden lang inkubiert, das Medium wurde durch vollständiges Medium ersetzt und die Kultur wurde für 48-72 Stunden fortgesetzt. Die Knockdown-Effizienz wurde durch qRT-PCR und Western Blot vor weiteren Behandlungen verifiziert.

4. ELISA

Zellkulturüberstände wurden gesammelt, 5 Minuten lang bei 200 × g zentrifugiert und bei Bedarf 1:2 in Assay-Puffer verdünnt. Es wurden ELISA-Kits für IL-1β, TNF-α und IL-6 gemäß dem Protokoll des Herstellers verwendet. Standards, Blindproben und Proben wurden in dreifacher Ausfertigung durchgeführt. Nach der Substratreaktion wurde die Absorption bei 450 nm mit einem Mikroplatten-Reader innerhalb von 15 min gemessen.

5. MTT-Assay

Chondrozyten wurden in 96-Well-Platten mit 5.000 Zellen/Well in 100 μl vollständigem Medium ausgesät und für 0 h, 24 h, 48 h oder 72 h inkubiert. Zu jedem Zeitpunkt wurden 20 μl MTT-Lösung (5 mg/ml in PBS) direkt in jede Vertiefung gegeben, und die Platten wurden 30 Minuten lang bei 37 °C inkubiert, bis violette Formazankristalle am Boden der Vertiefungen sichtbar wurden. Der Überstand wurde vorsichtig aspiriert, ohne die Kristalle zu stören, 150 μl DMSO wurden in jede Vertiefung gegeben, und die Platten wurden 10 Minuten lang bei 100 U/min auf einen Schüttler gelegt, um die Kristalle vollständig aufzulösen. Die Extinktion wurde bei 490 nm mit einem Mikroplatten-Reader gemessen. Die kurze Inkubationszeit wurde gewählt, um eine Signalsättigung in hochmetabolisch aktiven Zellen zu vermeiden.

6. Durchflusszytometrie

Die Zellen wurden durch Trypsinisierung geerntet, 5 Minuten lang bei 200 × g zentrifugiert und zweimal mit kaltem PBS gewaschen. Sie wurden in 500 μl Bindungspuffer bei ~1 × 10⁶ Zellen/ml resuspendiert, und es wurden 5 μl Annexin V-FITC und 5 μl PI hinzugefügt. Nach schonendem Mischen wurden die Zellen 15 Minuten lang bei Raumtemperatur im Dunkeln inkubiert. Die Proben wurden auf einem Durchflusszytometer analysiert, wobei mindestens 10.000 Ereignisse pro Probe erfasst wurden (Anregung 488 nm, Emission FITC 530/30 nm, PI > 600 nm). Apoptotische Zellen wurden mit Hilfe von Standardsoftware quantifiziert.

7. Westliche Blotting

Die Zellen wurden zweimal mit kaltem PBS gespült und in 200 μl RIPA-Puffer mit Proteaseinhibitoren auf Eis für 30 Minuten lysiert. Die Zellen wurden mit einem Kunststoffschaber abgeschabt, auf und ab pipettiert, um die Viskosität zu reduzieren, und 10 Minuten lang bei 4 °C bei 12.000 × g zentrifugiert. Es wurden Überstände gesammelt und die Proteinkonzentrationen mit dem BCA-Assay gemessen. Gleiche Mengen Protein (30 μg) wurden mit 5× Ladepuffer gemischt, 5 min lang auf 95 °C erhitzt und auf 10%-12% SDS-PAGE-Gelen getrennt. Die Elektrophorese wurde bei 80 V für das Stapeln und 120 V für die Trennung durchgeführt, und die Proteine wurden 90 Minuten lang bei 300 mA auf PVDF-Membranen übertragen. Die Membranen wurden in 5 % fettfreier Milch für 1 h bei Raumtemperatur blockiert und über Nacht bei 4 °C mit Primärantikörpern (1:1.000) inkubiert. Nach drei Waschgängen mit TBST wurden die Membranen mit HRP-konjugierten Sekundärantikörpern (1:5.000) für 1 h bei Raumtemperatur inkubiert. Die Proteinbanden wurden mit einem ECL-Substrat sichtbar gemacht und mit einem Chemilumineszenz-Detektionssystem mit einer Exposition von 30-120 s abgebildet. Die Bandenintensitäten wurden mit ImageJ quantifiziert, und GAPDH wurde als Belastungskontrolle verwendet.

8. Färbung von Monodansylcadaverin (MDC)

Unmittelbar vor der Verwendung wurde aus der Stammlösung eine 50 μM MDC-Arbeitslösung hergestellt. Die Zellen wurden 10 Minuten lang bei Raumtemperatur mit 1 ml 4 % Paraformaldehyd fixiert, zweimal mit PBS gewaschen und 30 Minuten lang bei 37 °C im Dunkeln mit 500 μl MDC-Arbeitslösung inkubiert. Nach zwei Waschgängen mit PBS wurden Deckgläser mit Antifading-Eindeckmedium montiert und unter einem Fluoreszenzmikroskop (Anregung 355 nm, Emission 512 nm) betrachtet.

9. Transmissionselektronenmikroskop (TEM)

Die Zellen wurden geerntet und durch Zentrifugation bei 200 × g für 5 min pelletiert und dann über Nacht in 2 % Glutaraldehyd bei 4 °C fixiert. Die Proben wurden dreimal jeweils 5 Minuten lang mit PBS gewaschen und 1 h lang bei 4 °C in einem Abzug in 1 % Osmiumtetroxid nachfixiert. Die Dehydratisierung wurde durch eine abgestufte Acetonreihe von 30 %, 50 %, 70 %, 90 % und 100 % für jeweils 10 Minuten durchgeführt. Die Proben wurden 1 h lang mit 1:1 Aceton/Epoxidharz infiltriert und anschließend über Nacht mit reinem Harz infiltriert. Die Einbettung erfolgte in frisches Harz und polymerisierte bei 60 °C für 48 h. Ultradünne Schnitte von 50-70 nm wurden mit einem Ultramikrotom geschnitten, auf 200-Mesh-Kupfergitter montiert, 30 min lang mit 2 % Uranylacetat gefärbt, gefolgt von Bleicitrat für 15 min, mit destilliertem Wasser gewaschen, an der Luft getrocknet und unter einem Transmissionselektronenmikroskop bei 80 kV untersucht. Als Sicherheitshinweis: Glutaraldehyd und Osmiumtetroxid sind giftig und flüchtig und dürfen nur in einem Abzug mit Handschuhen und Schutzbrille gehandhabt werden. Abfälle sollten in ausgewiesenen gefährlichen Behältern gemäß den institutionellen Sicherheitsprotokollen entsorgt werden.

10. Statistische Auswertung

Alle Experimente wurden in dreifacher Ausfertigung durchgeführt. Die Daten werden als Mittelwert ± SD ausgedrückt. Die statistische Signifikanz wurde mittels Einweg-ANOVA und anschließendem LSD-Post-hoc-Test bewertet, wobei P < 0,05 als signifikant angesehen wurde.

Die Wirkung von HSYA auf die Expression von proinflammatorischen Zytokinen (IL-1β, TNF-α, IL-6) von Chondrozyten
Im Vergleich zur normalen Kontrollgruppe zeigten alle anderen Gruppen signifikant erhöhte Spiegel an proinflammatorischen Zytokinen (IL-1β, TNF-α und IL-6) (P < 0,05, Tabelle 1, Abbildung 1A-G). Die Behandlung mit HSYA, HIF-1α-Inhibitor, Autophagie-Induktor, HSYA + HIF-1α-Inhibitor oder HSYA + Autophagie-Induktor reduzierte die Zytokinspiegel im Vergleich zur Blind-Modellgruppe signifikant (P < 0,05). Unter diesen reduzierten die kombinierten Behandlungen (HSYA + HIF-1α-Inhibitor oder HSYA + Autophagie-Induktor) die Zytokinexpression weiter, mit einer Abnahme von etwa 35 % bis 40 % im Vergleich zur Modellgruppe (P < 0,05). In den Geninterferenzexperimenten (Abbildung 1H-J) führte der siRNA-Knockdown von HIF-1α oder BNIP3 zu einer Verringerung der Zytokinspiegel um ~25%-30% im Vergleich zur Modell + Blindgruppe. Die HSYA-Behandlung verstärkte diese Effekte weiter. Insbesondere waren die Zytokinspiegel in der siHIF-1α + HSYA-Gruppe ~20 % niedriger als in der siHIF-1α + Blind-Gruppe, und die Spiegel in der siBNIP3 + HSYA-Gruppe waren ~22 % niedriger als in der siBNIP3 + Blind-Gruppe (P < 0,05).

Wirkung von HSYA auf die Chondrozytenproliferation
Die normale Kontrollgruppe zeigte eine Proliferationsaktivität zu Studienbeginn, während die Gruppe des Blanko-Modells eine signifikante Reduktion aufwies (P < 0,05, Abbildung 2A). Die Proliferation wurde nach der Behandlung mit HSYA, HIF-1α-Inhibitor oder Autophagie-Induktor teilweise wiederhergestellt und durch kombinierte Behandlungen mit HSYA + HIF-1α-Inhibitor oder HSYA + Autophagie-Induktoren deutlich verstärkt (P < 0,05). In den siRNA-Experimenten (Abbildung 2B) förderte der Knockdown von HIF-1α oder BNIP3 die Proliferation um ~25% im Vergleich zur Modell-Kontrollgruppe. Die HSYA-Behandlung verstärkte die Proliferation weiter, was zu einer ~40% höheren Proliferation im Vergleich zur Modellgruppe führte (P < 0,05).

Wirkung von HSYA auf die Apoptose und die Autophagie-bezogene Proteinexpression in Chondrozyten
Die Western-Blot-Analyse zeigte signifikante Unterschiede in der Proteinexpression zwischen den Gruppen (Tabelle 2). Die Blindmodellgruppe zeigte eine deutliche Hochregulation von HIF-1α und eine reduzierte Expression von LC3, P62, Beclin1 und BNIP3 im Vergleich zu den Kontrollen (P < 0,05). Die Behandlung mit HSYA, HIF-1α-Inhibitor oder Autophagie-Induktor erhöhte die LC3-, P62-, Beclin1- und BNIP3-Expression und verringerte die HIF-1α-Spiegel (P < 0,05). Die kombinierten Behandlungen mit HSYA + HIF-1α-Inhibitor oder HSYA + Autophagie-Induktor führten zu den größten Veränderungen, wobei sich die LC3- und Beclin1-Spiegel im Vergleich zur Blanko-Modellgruppe fast verdoppelten. Obwohl P62 typischerweise reduziert ist, wenn die Autophagie aktiviert wird, stieg sein Spiegel hier nach der HSYA-Behandlung an. Dies kann auf eine erhöhte Autophagosomenakkumulation oder einen unvollständigen Fluss hinweisen, ein Phänomen, das auch in früheren Studien zur Chondrozyten-Autophagie berichtet wurde.

Einfluss von HSYA auf die Apoptoseraten in Chondrozyten
Die durchflusszytometrische Analyse zeigte, dass die Blindmodellgruppe eine signifikant höhere Apoptoserate aufwies als die normale Kontrollgruppe (P < 0,05, Abbildung 3A,B). HSYA, HIF-1α-Inhibitor und Autophagie-Induktor reduzierten jeweils die Apoptose, während die kombinierten Behandlungen (HSYA + HIF-1α-Inhibitor oder HSYA + Autophagie-Induktor) die niedrigsten Apoptoseraten erzeugten, mit Reduktionen von ~45%-50% im Vergleich zur Blanko-Modellgruppe (P < 0,05). In den siRNA-Experimenten wurde die Apoptose auch durch den Knockdown von HIF-1α oder BNIP3 verringert und durch die HSYA-Behandlung weiter reduziert.

Einfluss von HSYA auf die Apoptoseraten und die autophagische Vesikelbildung in Chondrozyten
MDC-Färbung und TEM-Bildgebung zeigten deutliche Unterschiede in der autophagischen Vesikelbildung zwischen den Gruppen (Abbildung 4A-D). Die Blanko-Modellgruppe zeigte eine spärliche Verteilung von Vesikel, während HSYA-, HIF-1α-Inhibitor- oder Autophagie-Induktor-Behandlungen die Vesikelzahlen erhöhten. Die kombinierten Behandlungen (HSYA + HIF-1α-Inhibitor oder HSYA + Autophagie-Induktor) führten zu einer am stärksten ausgeprägten Verbesserung, wobei bei TEM im Vergleich zur Modellgruppe etwa doppelt so viele Vesikel beobachtet wurden. In Übereinstimmung mit diesen Ergebnissen waren die durch Durchflusszytometrie gemessenen Apoptoseraten (Abbildung 5A-E) in den kombinierten Behandlungsgruppen am niedrigsten.

DATENVERFÜGBARKEIT:
Alle in dieser Studie generierten Daten sind in der Zusatzdatei 1 enthalten.

Abbildung 1: Die Expression von Chondrozyten-proinflammatorischen Zytokinen (IL-1β, TNF-α, IL-6) in jeder Gruppe (n = 3). (A-G) Die Proteinexpressionsniveaus von IL-1β, TNF-α und IL-6 wurden durch Western Blotting (WB) nachgewiesen. (H-J) Die Gehalte an IL-1β, TNF-α und IL-6 wurden mittels Enzyme-linked Immunosorbent Assay (ELISA) gemessen (P < 0,05). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 2: Vergleich der Chondrozytenproliferationsaktivität in jeder Gruppe (n = 3). (A) Die behandelten Gruppen und (B) die HIF-1α- und BNIP3-Knockdown-Gruppen, P< 0,05. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 3: Vergleich der Apoptoserate jeder Gruppe (n = 3). (A) 1, Gruppe Normal; 2, Modellgruppe; 3, HSYA-Gruppe; 4, HIF-1α-Inhibitor-Gruppe; 5, Autophagie-Gruppe; 6, HSYA + HIF-1α-Inhibitor-Gruppe; 7, HSYA + Autophagie-Induktor-Gruppe. (B) Die HIF-1α- und BNIP3-Gen-Knockdown-Gruppen. Im Vergleich zur normalen Kontrollgruppe < *P 0,05. Im Vergleich zur leeren Modellgruppe #P< 0,05. Im Vergleich zur HSYA + HIF-1α-Inhibitorgruppe & P< 0,05. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 4: TEM-Bildgebung der autophagischen Vesikelbildung in Mitochondrien. (A) Leeres Modell. (B) HSYA-Gruppe. (C) HIF-1α-Inhibitor-Gruppe. (D) Autophagie-Induktor-Gruppe. Maßstabsbalken = 1 μm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 5: Einfluss von HSYA auf die Apoptoseraten der Zellen in jeder Gruppe (n = 3). (A) Leeres Modell. (B) HSYA-Gruppe. (C) HIF-1α-Inhibitor-Gruppe. (D) Autophagie-Induktor-Gruppe. (E) Die Gesamtanalyse jeder Gruppe im Vergleich zur normalen Kontrollgruppe, **P< 0,01. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Tabelle 1: Vergleich der pro-inflammatorischen Zytokinspiegel in jeder Gruppe. Im Vergleich zur normalen Kontrollgruppe < *P 0,05. Im Vergleich zur leeren Modellgruppe #P< 0,05. Im Vergleich zu Gruppen, die mit HASY, dem HIF-1α-Inhibitor und dem Autophagie-Induktor behandelt wurden, & P< 0,05.

Tabelle 2: Vergleich der Proteine in den verschiedenen Gruppen. Im Vergleich zur normalen Kontrollgruppe, *P< 0,05. Im Vergleich zu Gruppen, die mit HSYA, dem HIF-1α-Inhibitor und dem Autophagie-Induktor behandelt wurden, #P< 0,05.

Ergänzende Datei 1: Die Rohdaten, die während der Studie generiert wurden. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Die Autoren erklären, dass keine konkurrierenden Interessen bestehen.