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Forschungsartikel

Ganzhirong-Granulat hemmt die hepatische Glukoneogenese über die SIRT3-MPC1-PC/PDH-Achse bei Typ-2-Diabetes

409 Aufrufe

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DOI:

10.3791/69500

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12. Dezember 2025

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1College of Traditional Chinese Medicine, Changchun University of Chinese Medicine, 2Department of Gastroenterology, The Affiliated Hospital to Changchun University of Chinese Medicine, 3Research Center of Chinese Traditional Medicine, The Affiliated Hospital to Changchun University of Chinese Medicine, 4Preventive Treatment Center, The Affiliated Hospital to Changchun University of Chinese Medicine

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Diese Studie untersuchte, ob Ganzhirong-Granule die Hyperglykämie bei Typ-2-Diabetes lindert, indem es die hepatische Glukoneogenese über die SIRT3-MPC1-PC/PDH-Achse hemmt.

Zusammenfassung

Typ-2-Diabetes mellitus (T2DM) ist eine globale Stoffwechselerkrankung, die durch hepatische Insulinresistenz und übermäßige Glukoneogenese gekennzeichnet ist. Ganzhirong Granule (GZRG), eine Formel der traditionellen chinesischen Medizin, hat Potenzial bei der Behandlung von T2DM gezeigt, doch die zugrunde liegenden Mechanismen, insbesondere im Hinblick auf die hepatische Glukoneogenese, bleiben unklar. Diese Studie untersuchte, ob GZRG Hyperglykämie durch Modulation des SIRT3-vermittelten Signalwegs mildert. Die antidiabetischen Effekte von GZRG wurden bei fettreichen Ernährungsmäusen (HFD)-induzierten T2DM-Mäusen und frei-Fettsäuren (FFA)-induzierten insulinresistenten HepG2-Zellen untersucht. Metabolische Parameter, Glukose- und Pyruvattoleranz, Insulinsensitivität sowie Lipidprofile wurden bewertet. Molekulare Mechanismen wurden durch die Überexpression und Knockdown von SIRT3 erforscht, wobei die Expression wichtiger Proteine (SIRT3, MPC1, PC, PDH-E2, PCK1 und G6Pase) im gluconeogenen Weg untersucht wurde. Die GZRG-Behandlung verbesserte signifikant die Hyperglykämie, erhöhte die Insulinsensitivität und verbesserte den Lipidstoffwechsel sowohl bei T2DM-Mäusen als auch bei insulinresistenten (IR) HepG2-Zellen. Sie schwächte die hepatische Steatose ab und unterdrückte die Glukoneogenese. Mechanistisch reduzierte GZRG die SIRT3-Expression, was zu gleichzeitigen Senkungen der MPC1- und PC-Spiegel sowie einer Erhöhung von PDH-E2 führte. Dieser Wandel in der Proteinexpression lenkte den Pyruvatstoffwechsel von der Glukoneogenese weg. Die SIRT3-Überexpression kehrte die suppressiven Effekte von GZRG auf die Glukoneogenese um, während SIRT3-Knockdown mit GZRG synergierte. GZRG lindert T2DM, indem es die hepatische Glukoneogenese über die SIRT3-MPC1-PC/PDH-Achse hemmt. Diese Ergebnisse erläutern einen neuartigen molekularen Mechanismus von GZRG und heben SIRT3 als potenzielles therapeutisches Ziel für das Management von T2DM hervor.

Einleitung

Typ-2-Diabetes mellitus (T2DM) hat sich als eine der weltweit am häufigsten verbreiteten und lähmenden chronischen Stoffwechselerkrankungen etabliert und stellt eine erhebliche öffentliche Gesundheits- und Wirtschaftsbelastung dar. Gekennzeichnet durch Insulinresistenz (IR) und fortschreitende Dysfunktion der β-Zelle der Bauchspeicheldrüse, wird T2DM hauptsächlich durch eine gestörte Glukose- und Lipidhomöostase 3,4 verursacht. Unter den mehreren Organen, die an der Glukoseregulation beteiligt sind, spielt die Leber eine zentrale Rolle, indem sie die endogene Glukoseproduktion durch Glykogenolyse und Glukoneogenesesteuert. Übermäßige hepatische Glukoneogenese ist ein wesentlicher Faktor für die Nüchternhyperglykämie, ein Markenzeichen der T2DM-Pathophysiologie, und stellt ein entscheidendes therapeutisches Ziel zur Wiederherstellung des Glukosegleichgewichts6 dar.

Aktuelle hypoglykämische Wirkstoffe – darunter Metformin7, Thiazolidinedionen8, GLP-1-Rezeptoragonisten9 und SGLT2-Inhibitoren10 – erreichen eine glykämische Kontrolle durch unterschiedliche Mechanismen, doch ihre langfristige Anwendung ist oft durch Nebenwirkungen, nachlassende Wirksamkeit oder Behandlungsintoleranz eingeschränkt. Daher wächst das Interesse an komplementären oder alternativen therapeutischen Ansätzen, die sicher und effektiv mehrere metabolische Signalwege ansprechen können. Die traditionelle chinesische Medizin (TCM), gekennzeichnet durch ihre pharmakologischen Eigenschaften mit mehreren Komponenten und mehreren Zielgruppen, bietet vielversprechende Perspektiven für die Behandlung komplexer Stoffwechselerkrankungen wie T2DM11, 12, 13, 14, 15. Mehrere klassische TCM-Formulierungen wurden berichtet, die Insulinresistenz lindern, den Lipidstoffwechsel verbessern und die hepatische Glukoneogenese durch integrierte regulatorische Mechanismenunterdrücken 16,17.

Ganzhirong-Granulat (GZRG) ist eine standardisierte TCM-Formel mit einer Vorgeschichte klinischer Anwendung bei der Behandlung von Stoffwechselstörungen. GZRG ist eine pflanzliche Formulierung, die aus acht Heilkräutern besteht. Basierend auf unseren bisherigen phytochemischen und pharmakologischen Untersuchungen wurden in GZRG eine Reihe bioaktiver Verbindungen identifiziert, darunter, aber nicht beschränkt auf, Salvianolsäure B, D-Stachyose, Proanthocyanidine, Violettoxalsäure, Salvianolsäure A, Salvianolinsäure C, Calycosin-7-Glucosid, 3′-Methoxypuerarin, 3′-Hydroxy-Puerarin, Apigenin-7-o-beta-d-pyrano, Emodin-8-O-β-D-Glukose, Chrysophanol-1-O-Glucosid, Chrysophanol-8-O-Glucosid, Puerarin, Rosmarinsäure, Cryptotanshinon, Catechin, Ft-nyflavin, Calycosin, Rhein, Guanosin, Oleinsäure, Aloe-Emodin, Formononetin, Palmitinsäure, Chrysophanol, D-Tryptophan, Danshensu, Ferulinsäure, Mannitol, Gallsäure und L-Phenylalanin. Ein grundlegender Vorteil der traditionellen chinesischen Medizin (TCM) bei der Behandlung von Typ-2-Diabetes liegt in ihren multikomponentigen und multi-zielmäßigen synergistischen Wirkungen. Die Dutzenden aktiver Bestandteile, die in GZRG enthalten sind, interagieren wahrscheinlich mit mehreren biologischen Prozessen – wie Insulinsignalwege, Glykogenstoffwechsel und entzündlichen Reaktionen – und erzeugen so einen integrierten Netzwerkeffekt, der von keiner einzelnen gereinigten Verbindung18 ausreichend repliziert werden kann. Frühere Forschungen haben gezeigt, dass GZRG in diabetischenModellen positive Effekte auf den Glukose- und Lipidstoffwechsel hat. die genauen molekularen Mechanismen, die diesen Effekten zugrunde liegen, bleiben jedoch unklar. Insbesondere ist noch nicht geklärt, ob GZRG seine antidiabetischen Wirkungen durch die Modulation der hepatischen gluconeogenen Signalübertragung ausübt.

Sirtuin 3 (SIRT3), eine mitochondriale NAD⁺-abhängige Deacetylase, ist ein zentraler Regulator der zellulären Energiehomöostase20. Durch die Deacetylierung und Aktivierung wichtiger metabolischer Enzyme beeinflusst SIRT3 mitochondriale oxidative Phosphorylierung, Fettsäureoxidation und Glukonneogenese21. Aberrante SIRT3-Expression wurde an der Pathogenese von Insulinresistenz, Fettleber und T2DM22,23 in Verbindung gebracht. Hinweise darauf hindeuten, dass die hepatische SIRT3-Überexpression den gluconeogenen Fluss durch modulierende Enzyme wie mitochondrialen Pyruvatträger 1 (MPC1)24, Pyruvatcarboxylase (PC)25, Pyruvatdehydrogenase (PDH)26, Phosphoenolpyruvatcarboxykinase (PCK1)27 und Glucose-6-phosphatase (G6Pase)28 verstärkt. Daher stellt die SIRT3-vermittelte Kontrolle des Pyruvatstoffwechsels einen entscheidenden Nexus dar, der die mitochondriale Funktion und die hepatische Glukoseproduktion verknüpft, was SIRT3 zu einem attraktiven Ziel für therapeutische Interventionen bei T2DM macht.

Angesichts der etablierten metabolischen Effekte bioaktiver Bestandteile in GZRG sowie der zentralen Rolle von SIRT3 in der Leberglukose-Homöostase wurde die Hypothese aufgestellt, dass GZRG die Hyperglykämie in T2DM durch Modulation des SIRT3-vermittelten glukoneogenen Wegs mildert. Um diese Hypothese zu bewerten, wurden die Auswirkungen von GZRG auf Glukose- und Lipidstoffwechsel in fettreichen T2DM-induzierten Mäusen mit fettreicher Diät (HFD) und in frei-fettsäureinduzierten (FFA)-induzierten insulinresistenten HepG2-Zellen untersucht. Weitere Untersuchungen untersuchten die Beteiligung der SIRT3-MPC1-PC/PDH-Signalachse bei der Vermittlung des suppressiven Effekts von GZRG auf die hepatische Glukoneogenese. Diese Studie zielt darauf ab, die molekularen Mechanismen zu erläutern, die den metabolischen Vorteilen von GZRG zugrunde liegen, und experimentelle Belege für sein therapeutisches Potenzial als Multi-Target-Modulator für das Management von T2DM zu liefern.

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Protokoll

Das Tierversuchsprotokoll wurde vom Institutional Animal Care and Use Committee der Changchun University of Chinese Medicine genehmigt (Genehmigungsnummer 2024396). Alle Tierversuche wurden nach den nationalen Richtlinien und den einschlägigen nationalen Gesetzen zum Schutz von Tieren durchgeführt.

Experimentelle Medikamente
GZRG (Batch-Nummer 26210483) wurde vom angeschlossenen Krankenhaus der Changchun University of Chinese Medicine (Jilin, China) bereitgestellt. Die wichtigsten bioaktiven Bestandteile und Qualitätskontrollparameter von GZRG wurden in einer früheren Studie18 charakterisiert.

Reagenzien und Antikörper
Kommerzielle Testkits wurden verwendet, um Glukose, Glykogen, nicht-esterifizierte Fettsäuren (NEFAs), Triglyzeride (TG), Gesamtcholesterin (TC), HDL-Cholesterin mit hoher Dichte und LDL-Cholesterin mit niedriger Dichte zu quantifizieren. Enzymgebundene Immunsorbent-Assay (ELISA)-Kits für glykosyliertes Hämoglobin und Insulin wurden ebenfalls kommerziell erworben. ELISA-Kits für Pyruvatdehydrogenase (PDH) und Pyruvatcarboxylase (PC) wurden ebenfalls kommerziell erworben. Für RNA- und cDNA-Arbeiten wurden das RNA Tissue/Cell Kit, qPCR PreMix und gDNA RT SuperMix kommerziell erworben. Die Transfektion wurde mit einem Transfektionsreagenz durchgeführt. Primäre Antikörper gegen SIRT3 (RRID: AB_2837621), Phosphoenolpyruvat-Carboxykinase 1 (PCK1; RRID: AB_2838732), PDH-E2, Glukose-6-phosphatase (G6Pase; RRID: AB_2845572), mitochondrialer Pyruvatträger 1 (MPC1; RRID: AB_2836209), PC (RRID: AB_2836732) und Glyceraldehyd-3-phosphat-Dehydrogenase (GAPDH; RRID: AB_2833041) wurden von einem kommerziellen Anbieter beschafft.

Mäuse und Behandlungen
Männliche C57BL/6J-Mäuse (5–6 Wochen alt) wurden von der Liaoning Changsheng Biotechnology Co., Ltd. bezogen und unter Standardbedingungen (22 ± 2 °C, 50%–60 % Luftfeuchtigkeit, 12 Stunden Hell/Dunkel-Zyklus) mit freiem Zugang zu Nahrung und Wasser gepflegt. Nach einer einwöchigen Akklimatisierungsphase wurden sechs Mäuse zufällig als Kontrollgruppe (Con) bestimmt und erhielten eine Standard-Chow-Diät. Die übrigen Mäuse erhielten eine fettreiche Diät (HFD) für 12 Wochen, um Fettleibigkeit und Insulinresistenz auszulösen.

In Woche 13 wurden Mäuse mit einem Nüchternblutzuckerwert (FBG) ≥ 11,1 mmol/L als erfolgreiche Typ-2-Diabetes-mellitus-(T2DM)-Modelle klassifiziert. Diese diabetischen Mäuse wurden zufällig in fünf experimentelle Gruppen eingeteilt (n = 6 pro Gruppe): die HFD-Modellgruppe, niedrig dosierte GZRG (L-GZRG, 3,2 g/kg/d), mitteldosierte GZRG (M-GZRG, 6,4 g/kg/d), hochdosierte GZRG (H-GZRG, 12,8 g/kg/d) und Metformin (Met, 0,2 g/kg/d). GZRG und Met wurden 8 Wochen lang täglich oral verabreicht. Die Modellgruppen Con und HFD erhielten gleichwertige Mengen destilliertes Wasser. Nach Abschluss der Behandlungsphase wurden Blut- und Lebergewebeproben von allen Mäusen zur anschließenden Analyse entnommen.

Intraperitonealer Glukosetoleranztest (IPGTT), Pyruvattoleranztest (PTT) und Insulintoleranztest (ITT)
Metabolische Toleranztests wurden zwischen 6 und 8 Wochen nach Beginn der medikamentösen Behandlung durchgeführt. Beim IPGTT und PTT wurden die Mäuse über Nacht (etwa 16 Stunden) gefastet. Für die ITT wurde eine kürzere Fastenzeit von 4 Stunden eingeführt. Nach dem Fasten erhielten die Mäuse eine intraperitoneale Injektion entweder von Glukose (2 g/kg für IPGTT), Natriumpyruvat (2 g/kg für PTT) oder menschlichem regulärem Insulin (1 U/kg für ITT). Die Blutzuckerwerte wurden aus Blutprobeln der Schwanzvene 0 Min, 30 Min, 60 Min, 90 Min. und 120 Minuten nach der Injektion mit einem kalibrierten Blutzuckermesser gemessen.

Biochemische Analysen und Enzymaktivitätstests
Die Nüchternblutzuckerwerte (FBG), Hämoglobin A1c (HbA1c) und Insulin (INS) wurden mit kommerziellen Assay-Kits gemäß den Anweisungen des Herstellers bestimmt. Die homöostatische Modellbewertung der Insulinresistenz (HOMA-IR) wurde mit folgender Formel berechnet:

HOMA-IR = [FBG (mmol/L) x INS (μU/mL)] / 22,5

Die zirkulierenden Konzentrationen von NEFAs, TG, TC, LDL-C, HDL-C sowie die enzymatischen Aktivitäten von PDH und PC in Lebergeweben wurden mithilfe der jeweiligen kommerziellen Kits quantifiziert.

Histopathologische Analyse von Lebergeweben
Frisches Lebergewebe wurde 24 Stunden lang in 10 % neutralgepuffertem Formalin fixiert, gefolgt von der Standardverarbeitung zur Paraffineinbettung. Schnitte (5 μm dick) wurden geschnitten und mit Hämatoxylin und Eosin (H&E) gefärbt zur allgemeinen morphologischen Untersuchung. Zur Lipidvisualisierung wurden ausgewählte Leberproben in eine Optimal Cutting Temperature (OCT)-Verbindung eingebettet, mit Schnappsfroren, kryosektioniert und mit Oil Red O gefärbt.

Zellkultur und Behandlung
Die humane Hepatomzelllinie HepG2 stammt aus der Typkultursammlung der Chinesischen Akademie der Wissenschaften (China). Die Zellen wurden in Minimum Essential Medium (MEM) kultiviert, ergänzt mit 25 mM Glukose, 10 % fetalem Rinderserum (FBS) und 1 % Penicillin-Streptomycin. Kulturen wurden bei 37 °C in einem befeuchteten Inkubator mit 5 %CO2 gehalten.

Um ein in-vitro-Modell der Insulinresistenz (IR) zu etablieren, wurden Zellen bei 70%-80% Konfluenz 24 Stunden lang mit einer Mischung aus freien Fettsäuren (FFA) behandelt, bestehend aus Oleinsäure und Palmitinsäure im Molarverhältnis von 2:1, basierend auf einer zuvor berichteten Methode mit geringfügigen Modifikationen29. Nach der FFA-Induktion wurde das Kulturmedium durch frisches MEM ersetzt, das dieselbe FFA-Mischung sowie verschiedene GZRG-Konzentrationen für eine zusätzliche 24-stündige Inkubation enthielt.

Zellviabilitätstest (CCK-8)
HepG2-Zellen in der logarithmischen Wachstumsphase wurden geerntet und in 96-Well-Platten mit einer Dichte von 1 x 104 Zellen pro Bohrloch ausgesät. Die peripheren Bohrlöcher wurden mit 100 μL steriler phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) gefüllt, um die Verdunstung zu minimieren. Nach einer Übernachtung zur Sicherstellung der Haftung wurden die Zellen nach dem experimentellen Design behandelt. Nach der Behandlung wurde jedem Brunnen 10 μL CCK-8-Lösung zugegeben, und die Platten wurden 2 Stunden bei 37 °C inkubiert. Die Absorption bei 450 nm wurde mit einem Mikroplattenleser gemessen. Die Zelllebensfähigkeit wurde berechnet wie folgt:

[(As - Ab) / (Ac - Ab)] x 100%

wobei As die Absorption der Probe ist, Ac die Absorption der Kontrollgruppe (unbehandelte Zellen) und Ab die Absorption des Rohlings (Brunnen ohne Zellen).

Plasmidtransfektion in HepG2-Zellen
Das SIRT3-Überexpressionsplasmid (OV-SIRT3) und drei verschiedene SIRT3-zielorientierte kleine interferierende RNA-Plasmide (si-SIRT3-1#, si-SIRT3-2#, si-SIRT3-3#) sowie eine negative Kontroll-siRNA (si-NC) wurden von einem Anbieter konstruiert. Transfektionen wurden mit einem Transfektionsreagenz durchgeführt, wenn die Zellen eine Konfluenz von 50 % bis 60 % erreichten. Der Transfektionskomplex wurde unter sterilen Bedingungen wie folgt hergestellt: Lösung A wurde erzeugt, indem 1 μg Plasmid-DNA in 250 μL reduziertes Serummedium mit sanfter Mischung verdünnt wurde. Lösung B wurde hergestellt, indem 2–3 μL Transfektionsreagenz in 250 μL reduziertes Serummedium verdünnt wurden, gefolgt von einer 5-minütigen Inkubation bei Raumtemperatur ohne Vortex. Die beiden Lösungen wurden kombiniert, sanft durch Pipettieren vermischt und 30 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert, um DNA-Lipid-Komplexe zu bilden. Für die Transfektion wurde 1 Stunde vor dem Eingriff das Zellkulturmedium aspiriert, die Zellen mit PBS gewaschen und 1 ml reduziertes Serummedium (serumfrei und antibiotikafrei) hinzugefügt. Anschließend wurden 500 μL des Transfektionskomplexes zu jedem Brunnen hinzugefügt, und die Kulturplatte wurde vorsichtig gewirbelt, um die Homogenität zu gewährleisten. Die Zellen wurden bei 37 °C für 4–6 Stunden inkubiert, danach wurde das Medium durch ein vollständiges Medium ersetzt, um die Zytotoxizität zu mildern. Anschließend wurden die Zellen für weitere 24–48 Stunden kultiviert, bevor eine weitere Analyse erfolgte. Die Transfektionseffizienz wurde mittels quantitativer PCR (qPCR) bewertet. Die Gesamt-RNA wurde extrahiert, rückwärts in cDNA transkribiert und mit SIRT3-spezifischen Primern und 18S rRNA als interne Kontrolle amplifiziert. Die relativen Expressionsniveaus wurden mittels der ΔΔCt-Methode bestimmt, und das effektivste siRNA-Konstrukt wurde für spätere Experimente auf Basis dieser Ergebnisse ausgewählt.

Ölrote O-Färbung zur intrazellulären Lipidansammlung
HepG2-Zellen in der logarithmischen Wachstumsphase wurden in 24-Well-Platten mit einer Dichte von 2 x 105 Zellen pro Bohrloch ausgesat und mit einem hochlipidreichen Medium mit 250 μM Olinsäure und 250 μM Palmitinsäure für 48 Stunden induziert, um das Lipidakkumulationsmodell zu etablieren. Nach den Behandlungen wurden die Zellen mit PBS gewaschen und mit 10 % Formaldehyd für 10 Minuten bei Zimmertemperatur fixiert. Nach einer Spülung mit destilliertem Wasser und einem kurzen Eintauchen in 60 % Isopropanol wurden die Zellen mit einer frisch zubereiteten Oil Red O-Arbeitslösung (gewonnen durch das Mischen der Komponenten A1 und A2 im Verhältnis 3:2) für 10–15 Minuten gefärbt. Überschüssige Farbe wurde durch Waschen mit 60 % Isopropanol entfernt, gefolgt von destilliertem Wasser. Die Kerne wurden 1–2 Minuten lang mit Mayers Hämatoxylin (1,0 g/L) gekonterfärbt. Nach einer letzten Reinigung wurden die Zellen mit Glycerolgelatine montiert und Bilder mit einem Lichtmikroskop mit 200-facher Vergrößerung aufgenommen, um qualitativ die Lipidtröpfchen zu beurteilen.

Induktion von Insulinresistenz und Glukosequantifizierung in HepG2-Zellen
HepG2-Zellen wurden in 24-Well-Platten mit einer Seedingdichte von 2 x 105 Zellen pro Bohrloch kultiviert, um ein in-vitro-Modell der Insulinresistenz zu etablieren. Nach 24 Stunden Behandlung wurde das Kultur-Supernatant zur weiteren Analyse entnommen. Zur intrazellulären Glukosemessung wurden Zellsuspensionen bei 1000 x g für 10 Minuten bei 4 °C zentrifugiert. Der Supernatant wurde verworfen, und das Zellpellet wurde ein- oder zweimal mit einem isotonischen Puffer gewaschen, gefolgt von Zentrifugation unter denselben Bedingungen. Das Pellet wurde anschließend in 0,2 bis 0,3 mL Homogenisierungsmedium homogenisiert und mit einer 300-W-Sonde einer ultraschallischen Störung in einem Eiswasserbad unterzogen, mit Pulsen von 3-5 Sekunden, gefolgt von 30-Sekunden-Intervallen, wiederholt 3-5x. Das resultierende Homogenat wurde direkt ohne weitere Zentrifugation geprüft. Die Glukosewerte sowohl im Kultursupernatant als auch im Zellhomogenat wurden mit einem standardisierten Glukosetestkit gemäß den Anweisungen des Herstellers gemessen, um eine genaue und reproduzierbare Bewertung der Stoffwechselreaktionen sicherzustellen.

Messung des zellulären Triglyzeridgehalts
HepG2-Zellen wurden durch Zentrifugation bei 1000 x g für 10 Minuten gesammelt, und das Übersetzungsmittel wurde entsorgt. Das Zellpellet wurde ein- oder zweimal mit einem isotonischen Phosphatpuffer (0,1 M, pH 7,0–7,4) gewaschen, gefolgt von Zentrifugation unter denselben Bedingungen. Nach der Entfernung des Supernatants wurde das Pellet wieder suspendiert und mit 0,2–0,3 mL absolutem Ethanol homogenisiert. Das Homogenat wurde auf Eis einer Ultraschallstörung ausgesetzt (300 W, 3–5 Sekunden pro Stoß, 30-Sekunden-Intervalle, 3–5 Mal wiederholt). Das resultierende Homogenat wurde direkt für die nachfolgende Analyse ohne weitere Zentrifugation verwendet. Eine 96-Well-Platte wurde mit Blank-, Standard- und Probenbohrungen aufgebaut. Nach gründlichem Mischen wurde die Platte bei 37 °C für 10 Minuten inkubiert, und die Absorption wurde mit einem Mikroplattenleser bei 500 nm gemessen. Der Triglyzeridgehalt in den Zellproben wurde auf Basis einer Standardkurve berechnet, die aus seriellen Verdünnungen von Glycerolstandards abgeleitet wurde.

Messung des gesamten Cholesteringehalts
HepG2-Zellen (5 x 106) wurden in 1 ml Extraktionspuffer durch Ultraschallstörung auf Eis lysiert. Das Homogenat wurde bei 10.000 x g für 10 Minuten bei 4 °C zentrifugiert, und der Supernatant wurde zur sofortigen Analyse gesammelt. Eine Cholesterin-Standardlösung (50 μmol/mL) wurde hergestellt und seriell verdünnt, um eine Standardkurve (0,3125 bis 10 μmol/mL) zu erzeugen. Eine funktionierende chromogene Lösung wurde hergestellt, indem die Reagenzien eins, zwei und drei im Cholesterintest-Testkit gemischt und auf 37 °C vorgewärmt wurden. Proben oder Standards wurden mit der Arbeitslösung vermischt, bei 37 °C für 30 Minuten inkubiert, und die Absorptionsfähigkeit wurde bei 500 nm gemessen. Der Cholesteringehalt wurde anhand der Standardkurve berechnet.

Immunfluoreszenzfärbung
Zellen, die auf Deckschichten gezüchtet wurden, wurden mit eiskaltem PBS abgespült und bei Zimmertemperatur 15 Minuten lang mit 4 % Paraformaldehyd fixiert. Nach PBS-Waschen wurden die Zellen mit 0,1 % Triton X-100 für 10 Minuten permeabilisiert und über Nacht mit 5 % BSA bei 4 °C blockiert. Die Zellen wurden anschließend über Nacht mit einem primären Anti-SIRT3-Antikörper (1:500-Verdünnung) bei 4 °C inkubiert. Nach PBS-Waschverfahren wurden die Zellen mit einem fluoreszenzkonjugierten sekundären Antikörper (1:2000-Verdünnung) für 1 Stunde bei Raumtemperatur im Dunkeln inkubiert. Die Kerne wurden 10 Minuten lang mit DAPI (0,5 μg/mL) gefärbt. Deckfolien wurden mit einem Anti-Fade-Montagemedium auf Glasfolien montiert und unter einem Fluoreszenzmikroskop visualisiert.

RNA-Extraktion und quantitative Echtzeit-PCR (qRT-PCR)
Die Gesamt-RNA wurde aus den Zellen mittels RNA Tissue/Cell Kit extrahiert. Genomische DNA wurde entfernt und cDNA mit dem gDNA-RT-Kit synthetisiert. Quantitative PCR wurde mit dem qPCR-Kit auf einem Echtzeit-PCR-Detektionssystem durchgeführt. Genspezifische Primer-Sequenzen sind in Tabelle 1 aufgeführt.

Western-Blot-Analyse
Für die Proteingewinnung aus Lebergewebe wurden etwa 50–200 mg Gewebe gewogen, in einer Petrischale gehackt und in einen Homogenisator übergeben. Ein vorgekühlter Lysispuffer (RIPA-Puffer), ergänzt mit Protease- und Phosphataseinhibitoren, wurde hinzugefügt, um den Proteinabbau zu verhindern. Die Homogenisierung wurde gründlich auf Eis durchgeführt, um eine vollständige Gewebezerstörung sicherzustellen, und das Homogenat wurde in ein Zentrifugenrohr übertragen und 30 Minuten auf Eis inkubiert, um die Proteinlösung zu erleichtern. Anschließend wurde das Homogenat bei 4 °C bei 12.000 x g für 10–30 Minuten zentrifugiert, und der Supernatant wurde sorgfältig als Gesamtproteinextrakt gesammelt, um eine Kontamination durch das Pellet zu vermeiden. Zur zellulären Proteinextraktion wurde ein vorgekühlter Lysepuffer (RIPA-Puffer mit 1 % Triton X-100 und Proteaseinhibitoren) in die Zellen gegeben, gefolgt von einer 15–30 Minuten Inkubation auf Eis, um eine vollständige Lyse zu erreichen. Die Zellstörung wurde durch wiederholtes Schrubben mit einem Zellschaber oder kräftiges Pipettern gewährleistet. Das Lysat wurde in ein Zentrifugenrohr übertragen und bei 4 °C bei 14.000 x g für 30 Minuten zentrifugiert, wobei der Supernatant als Gesamtproteinextrakt gesammelt wurde. Die Proteinkonzentration wurde mit einem BCA-Protein-Testkit quantifiziert, und Aliquots wurden bei -80 °C für zukünftige Western-Blot-Analysen gelagert oder direkt zur Probenvorbereitung verwendet. Die Proteinproben wurden im Laemmli-Puffer bei 100 °C für 10 Minuten denaturiert, durch SDS-PAGE getrennt und auf PVDF-Membranen übertragen. Die Membranen wurden bei Raumtemperatur 2 Stunden lang mit 5 % fettarmer Milch blockiert und anschließend über Nacht bei 4 °C mit spezifischen primären Antikörpern inkubiert. Nach dem Waschen wurden die Membranen mit HRP-konjugierten sekundären Antikörpern für 1 Stunde bei Raumtemperatur inkubiert. Die Proteinbänder wurden mit einem verstärkten Chemilumineszenz-(ECL)-Substrat visualisiert. Die chemilumineszenten Signale wurden erfasst, und die Bandintensitäten wurden durch densitometrische Analyse mit der ImageJ-Software quantifiziert. Die rohen Western Blots sind in Supplementary File 1 bereitgestellt.

Statistische Analyse
Alle Daten werden als Mittelwert ± Standardfehler des Mittelwerts (SEM) angegeben. Statistische Vergleiche zwischen zwei Gruppen wurden mit einem ungepaarten Schüler-t-Test durchgeführt. Für Vergleiche zwischen drei oder mehr Gruppen wurde eine Einweg-Varianzanalyse (ANOVA) angewandt, gefolgt von Tukeys Post-hoc-Test für Mehrfachvergleiche. Alle statistischen Analysen wurden mit der GraphPad Prism-Software (Version 9.5.0) durchgeführt. Ein p-Wert von weniger als 0,05 wurde als statistisch signifikant angesehen.

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Ergebnisse

GZRG verbesserte Insulinresistenz und Glukoneogenese bei HFD-induzierten T2DM-Mäusen
Das durch HFD induzierte Typ-2-Diabetes-mellitus (T2DM)-Mausmodell, gekennzeichnet durch Insulinresistenz, Hyperglykämie und Dyslipidämie, wird häufig eingesetzt, um die Krankheitspathogenese zu untersuchen und therapeutische Interventionenzu bewerten 30. In der vorliegenden Studie wurde ein HFD-induziertes T2DM-Modell in C57BL/6J-Mäusen etabliert, um die Wirksamkeit und die zugrunde liegenden ...

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Diskussion

Die vorliegende Studie zeigt, dass GZRG signifikante antihyperglykämicische und insulinsensibilisierende Effekte sowohl in vivo - als auch in vitro-Modellen von T2DM ausübt, hauptsächlich durch Unterdrückung der hepatischen Glukoneogenese durch Modulation der SIRT3-MPC1-PC/PDH-Achse. Experimentelle Daten zeigen, dass die Verabreichung von GZRG die Nüchternhyperglykämie abschwächte, die Glukose- und Insulintoleranz verbesserte, die Lipidhomöostase wiederherstellte und di...

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Offenlegungen

Alle Autoren geben an, dass sie keine bekannten konkurrierenden finanziellen Interessen oder persönlichen Beziehungen haben, die die in diesem Artikel veröffentlichte Arbeit beeinflusst haben könnten.

Danksagungen

Diese Forschung wurde vom Science and Technology Development Plan der Provinz Jilin finanziert, Fördernummer 20210101199JC, YDZJ202301ZYTS454.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
FastKing gDNA Dispelling RT SuperMix     Tiangen Biotech Co., Ltd. (China). KR118-02
Glukose-6-phosphatase (G6Pase) AntikörperWuhan Lingjiesi Biotechnology Co., Ltd. (China)LJS-D-12610
Glyceraldehyd-3-Phosphat-Dehydrogenase (GAPDH) AntikörperWuhan Lingjiesi Biotechnology Co., Ltd. (China)LJS-T-0004
Glykosyliertes Hämoglobin ELISA-Kits     Jiangsu Meimian Industrial Co., Ltd. (China).MM-0159M2
GZRGAngeschlossenes Krankenhaus der Changchun Universität für Chinesische Medizin (Jilin, China)26210483
Cholesterin-Testkits mit hoher Dichte-Lipoprotein (HDL)Nanjing Jiancheng Bioengineering Institut (China)A112-1-1
Insulin-ELISA-KitsJiangsu Meimian Industrial Co., Ltd. (China).MM-0579M2
Lipofectamine2000 Invitrogen, USA11668-019
Cholesterin-Testkits mit niedriger Dichte (LDL)Nanjing Jiancheng Bioengineering Institut (China)A113-1-1
Messen Sie GlukosetestkitsNanjing Jiancheng Bioengineering Institut (China)F006-1-1
Mitochondrialer Pyruvatträger 1 (MPC1)AntikörperWuhan Lingjiesi Biotechnology Co., Ltd. (China)LJS-D-3852
Testkits für nicht-esterifizierte Fettsäuren (NEFAs)Nanjing Jiancheng Bioengineering Institut (China)A042-2-1
PC-AntikörperWuhan Lingjiesi Biotechnology Co., Ltd. (China)LJS-D-4364
PDH-E2-AntikörperWuhan Lingjiesi Biotechnology Co., Ltd. (China)LJS-D-14046
Phosphoenolpyruvat-Carboxykinase 1 (PCK1)AntikörperWuhan Lingjiesi Biotechnology Co., Ltd. (China)LJS-D-6770
Pyruvatcarboxylase (PC) ELISA kits Wuhan Lingjiesi Biotechnology Co., Ltd. (China)LJS-160408H
Pyruvat-Dehydrogenase (PDH)ELISA-Kits   Wuhan Lingjiesi Biotechnology Co., Ltd. (China)LJS-160300H
RNA Easy Fast Tissue/Cell Kit   Tiangen Biotech Co., Ltd. (China). DP451
SIRT3-AntikörperWuhan Lingjiesi Biotechnology Co., Ltd. (China)LJS-A-5135
Talent SYBR Green qPCR PreMix Tiangen Biotech Co., Ltd. (China). FP209-02
Gesamtcholesterin (TC)-Assay-KitsNanjing Jiancheng Bioengineering Institut (China)A110-1-1
Triglyzerid-(TG)-Assay-KitsNanjing Jiancheng Bioengineering Institut (China)A111-1-1

Referenzen

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