Research Article

Integrierte transkriptomische und sekretomproteomische Analyse hyperglykämie-stimulierter Endothelzellen sowie Screening von Zielverbindungen

DOI:

10.3791/69578

⸱

December 30th, 2025

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Hebei Luoxue Innovation Medicine Research Institute, 2State Key Laboratory for Innovation and Transformation of Luobing Theory, 3Hebei University of Chinese Medicine, 4Hebei Medical University, 5Chengde Medical University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dieses Protokoll etabliert eine integrierte Multi-Omics-Pipeline (Transkriptom und Proteom) kombiniert mit einem Netzwerk-pharmakologischen Screening, um molekulare Treiber und therapeutische Ziele für endotheliale Dysfunktion bei diabetischen Komplikationen zu identifizieren.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Die endotheliale Dysfunktion ist ein Haupttreiber diabetischer Nierenerkrankung (DKD), aber ihre systemischen molekularen Mechanismen sind weiterhin unvollständig entschlüsselt. Wir vermuteten, dass eine integrierte Multi-Omics-Analyse hyperglykämie-induzierte Endothelschäden kartieren und wiederverwendbare Therapeutika identifizieren könnte. Eine wiederverwendbare computergestützte Pipeline wurde angewendet, um transkriptomische/sekretomische Profile aus hyperglykämischen Endothelzellen und diabetischen Nieren zu integrieren. Dabei wurden 534 häufig hochregulierte Gene/Proteine identifiziert. Die funktionelle Anreicherung zeigte die Aktivierung der Umstrukturierung der extrazellulären Matrix, der interzellulären Kommunikation und der Entzündungswege. Datenbankübergreifende Validierung verfeinerte 278 hochsichere Mediatoren, und die Analyse des Protein-Protein-Interaktionsnetzwerks identifizierte zehn Hub-Gene. Mit Hilfe der Netzwerkpharmakologie haben wir eine zugelassene Arzneimittelbibliothek gescreent und mehrere Kandidatenverbindungen (z. B. Bruceantin, Idelalisib) identifiziert, die möglicherweise dieses Netzwerk ansprechen. Darüber hinaus lieferten die Regulation von Transkriptionsfaktoren und beispielhafte molekulare Andocksimulationen (z. B. Idelalisib mit CTCF/BRD4) mechanistische Hypothesen für die experimentelle Validierung. Abschließend etabliert diese Studie einen wiederverwendbaren Multi-Omics-Rahmen, der endotheliale pathogene Mechanismen bei DKD aufzeigt und wiederverwendbare Wirkstoffkandidaten nominiert, wodurch ein strategischer Ansatz für mechanistische und therapeutische Entdeckungen angeboten wird.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Diabetes mellitus als globale Gesundheitsherausforderung betraf im Jahr 2021 weltweit 529 Millionen Menschen, wobei Prognosen darauf hindeuten, dass er bis 2050 1,31 Milliarden Menschen betreffenwird. Über die glykämische Kontrolle hinaus sind langfristige Komplikationen die Hauptursache für Morbidität, Sterblichkeit und verminderte Lebensqualität. Dazu gehören mikrovaskuläre Komplikationen (z. B. diabetische Nierenerkrankung (DKD), Retinopathie, Neuropathie) und makrovaskuläre Komplikationen (z. B. beschleunigte Arteriosklerose). Entscheidend ist, dass DKD 30 % bis 40 % der diabetischen Patienten betrifft und weltweit die Hauptursache für Endstadium der Nierenerkrankung (ESRD) darstellt2. Die tiefgreifende Belastung dieser Komplikationen unterstreicht einen dringenden, ungedeckten Bedarf an neuartigen Therapien, die auf ihre zugrunde liegenden Mechanismen abzielen.

Endothelzellen (ECs), die die innere Auskleidung aller Blutgefäße bilden, sind zentrale Torwächter der Gefäßgesundheit. Hyperglykämie-induzierte endotheliale Dysfunktion ist ein zentraler Treiber diabetischer Vaskulopathie und Organschäden 3,4. Hohe Glukosewerte lösen eine Kaskade maladaptiver Reaktionen innerhalb von ECs aus, darunter dysregulierte Stickstoffmonoxid-(NO)-Bioverfügbarkeit, erhöhte Endothelin-1 (ET-1)-Sekretion, hochregulierte Adhäsionsmolekülexpression (z. B. VCAM-1, ICAM-1), erhöhter oxidativer Stress durch übermäßige Erzeugung reaktiver Sauerstoffspezies (ROS) (z. B. durch NADPH-Oxidasen) und anhaltende niedriggradige Entzündungen 3,4. Zusammen führen diese Veränderungen zu einer beeinträchtigten Vasodilatation, erhöhter vaskulärer Permeabilität, Leukozytenadhäsion und -infiltration, prothrombotischen Zuständen und letztlich zur vaskulären Remodellierung5. Innerhalb der renalen Mikrovaskulatur stören glomeruläre Endothelschäden die Filtrationsbarriere, fördern Albuminurie und tragen direkt zur Akkumulation der extrazellulären Matrix (ECM), Glomerulosklerose und tubulointerstitieller Fibrosebei 5,6. Die anschließende Aktivierung der residenten Nierenzellen, verbunden mit dem Zustrom von Entzündungszellen, begründet einen Teufelskreis, der die Nierenschädigungverstärkt 5,7. Entscheidend ist, dass klinische Studien zeigen, dass Marker systemischer Endotheldysfunktion stark mit dem Beginn und Fortschreiten der Albuminurie und abnehmender glomerulärer Filtrationsrate (GFR) bei diabetischen Patienten 6,7,8 korrelieren, was ihre direkte Relevanz für menschliche Krankheitsverläufe unterstreicht. Trotz ihrer anerkannten Zentralität bleibt ein umfassendes, systembezogenes Verständnis der präzisen transkriptionellen und sekretorischen Umprogrammierung, die durch chronische Hyperglykämie bei ECs induziert wird – insbesondere Veränderungen, die die ECM-Remodellierung vorantreiben, der Schlüssel zur Nierenfibrose ist – weiterhin unvollständig charakterisiert, was die Identifizierung neuer, mechanistischer therapeutischer Ziele für DKD und andere diabetische Gefäßkomplikationenbegrenzt 7,8.

Die tiefgreifende molekulare Komplexität, die der endothelialen Dysfunktion bei Diabetes zugrunde liegt, stellt eine gewaltige Herausforderung für traditionelle Einzelzieltherapieansätze dar. Hier treten computergestützte Biologie und Bioinformatik als unverzichtbare Werkzeuge hervor, die die Integration und Auswertung vielfältiger, hochdimensionaler Omics-Datensätze ermöglichen, um kausale Hubs innerhalb pathologischer Netzwerke zu priorisieren und multi-zielgerichtete therapeutische Strategien zu identifizieren9. Entscheidend ist, dass konventionelle Einmodalitätsansätze (z. B. Transkriptom/Proteom-only oder pharmakologische Screening) oft ein kritisches Zusammenspiel zwischen Molekülschichten (z. B. Genexpression, Proteindynamik, Arzneimittelantwort) übersehen und synergistische Treiber oder Off-Target-Effekte nicht erfassen10,11. Die integrierte Multi-Omics-Pipeline überwindet diese Einschränkungen, indem sie gleichzeitig transkriptomische, sekretomische und pharmakologische Daten innerhalb desselben Systems profiliert und so eine ganzheitliche Sicht auf den Krankheitsmechanismus ergibt. Netzwerkpharmakologie, Liganden-/Zielvorhersagealgorithmen und in silico molekulares Andocken ermöglichen die systematische Erforschung zugelassener Arzneimittelbibliotheken und beschleunigen so die Neupositionierung oder Entdeckung von Verbindungen, die komplexe Krankheitssignaturen entgegenwirken können3. Dieser Paradigmenwechsel birgt besondere Potenziale für die Identifizierung von Therapien, die auf endotheliale Dysregulation und deren verheerende mikrovaskuläre Folgen wie DKD abzielen, was das Potenzial für eine verbesserte Wirksamkeit und reduzierte Nebenwirkungsprofile bietet. Die Integration von transkriptomischen/sekretomischen Analysen von hyperglykämie-exponierten Endothelzellen identifizierte 534 häufig hochregulierte Moleküle. Funktionelle Anreicherung war mit der Umgestaltung der extrazellulären Matrix, oxidativem Stress und Entzündungen in der frühen DKD-Pathogenese verbunden. Datenbankübergreifende Analyse priorisierte 278 hochkonfidenzielle Ziele, die über PPI-Netzwerke von Hub-Genen verfeinert wurden. Das Netzwerkpharmakologische Screening zugelassener Medikamente sagte 85 Kandidatenverbindungen (darunter Brefeldin-A, Bruceantin, Paracetamol und Idelalisib) voraus, die auf diese Hubs abzielen. Die Vorhersage und das Andocken von Transkriptionsfaktoren in Silico untersuchten Mechanismen. Diese Arbeit definiert endotheliale Treiber von DKD, etabliert eine rechnergestützte Entdeckungspipeline und liefert therapeutische Kandidaten zur Validierung. Letztlich wird erwartet, dass diese Pipeline therapeutische Entdeckungsprogramme für diabetische Komplikationen fördert.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Die Tierversuche wurden mit Zustimmung des Ausschusses für Tierforschung und Ethik des Hebei Yiling Medical Research Institute (Genehmigungsnummer: N2024082) durchgeführt. Siehe die Materialtabelle für die in dieser Studie verwendeten experimentellen Materialien und Instrumente. Das Personal muss beim Umgang mit gefährlichen Reagenzien wie TRIzol (Haut-/Augenreizstoff, enthält Phenol) und Proteaseinhibitoren (potenzielle Atem- und Hautsensibilisatoren) streng geeignete persönliche Schutzausrüstung (PSA) tragen. Trennen Sie biologische/flüssige Abfälle in autoklavierbaren Säcken und gefährliche chemische Abfälle in ausgewiesenen Behältern für institutionelle gefährliche Entsorgung. Dekontaminieren Sie Verbrauchsmaterialien vor der Entsorgung.

Modellierung diabetischer Nephropathie-Mäuse

Die männlichen db/db- und db/m-Mäuse (12 Wochen alt) wurden unter spezifischen, pathogenfreien (SPF) Bedingungen bei 22 ± 2 °C und 56 % ± 5 % Luftfeuchtigkeit mit 12-Stunden-Hell/Dunkelzyklen und ad-libitum-Zugang zu Nahrung/Wasser gehalten. Nach einer einwöchigen Eingewöhnungsphase wurden die Mäuse zufällig numerische Kennungen zugeteilt und den Versuchsgruppen zugeteilt. Die db/db-Mäuse wurden sechs Wochen lang mit einer proteinreichen Diät gefüttert, um DKD zu etablieren. Die erfolgreiche Modellierung wurde durch ein signifikant erhöhtes Albumin-zu-Kreatinin-Verhältnis (UACR) im Vergleich zu db/m-Kontrollen bestätigt, wobei UACR >30 mg/g als primärer funktioneller Biomarker für frühes DKD12 diente.

Hochglukose-Endothelzellmodellierung

Humane nierenglomeruläre Endothelzellen (HRGECs) wurden unter standardisierten Bedingungen hergestellt. HRGECs wurden entweder in normaler Glukose (NG, 5,5 mM D-Glukose) oder hohem Glukosespiegel (HG, 30 mM D-Glukose) Medium kultiviert und in einem befeuchteten Inkubator bei 37 °C mit 5 %CO2 gehalten. Die Zellen wurden entweder ununterbrochen der HG ausgesetzt oder 24 Stunden lang unter Kontrollbedingungen gewachsen, bevor nachgelagerte Analysen durchgeführt wurden. Osmotische Kontrolle (HM, mit 5,5 mM D-Glukose und 24,5 mM Mannitol) sollte enthalten sein. Alle Erkrankungen sollten strenge Zellfitnesskriterien erfüllen: Die Lebensfähigkeit blieb ≥85 %, Apoptosewerte blieben unter 15 %, die ROS-Erhöhungen bei HG im Vergleich zu HM überstiegen 20 % nicht, und die LDH-Freisetzung blieb unter 10 %, was die zelluläre Integrität vor nachgelagerten Analysen validierte.

Konditionierte Mediensammlung

Konditionierte Medien (CM) wurden mit einem standardisierten Protokoll für die Sekretomanalyse13 mit Modifikationen gesammelt. Nach 24 Stunden hoher Glukose (30 mM D-Glukose), normaler Glukose (5,5 mM D-Glukose) oder osmotischer Kontrollstimulation (5,5 mM D-Glukose + 24,5 mM Mannitol) wurden HRGECs mit steriler phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) gewaschen, um Restproteine zu entfernen. Die Zellen wurden mit serumfreiem, phenol-rotfreiem endothelialem Basalmedium aufgefüllt und 12 Stunden bei 37 °C mit 5 % CO₂ inkubiert, um ausgeschiedene Faktoren zu akkumulieren.

CM wurde mit vorgekühlten Zentrifugationsröhrchen gewonnen. Die Probenverarbeitung wurde wie unten beschrieben sequenziell durchgeführt.

Primäre Klarstellung: CM wurde in RNase/DNase-freie konische Röhren übertragen und bei 3.000 x g für 10 Minuten bei 4 °C zentrifugiert. Die pelletierten Trümmer wurden entsorgt.

Protease-Hemmung: Innerhalb von 2 Minuten nach der primären Klärung wurde ein EDTA-freier Proteaseinhibitor-Cocktail zu einer Endkonzentration von 1x (1:50) mit 1x Phosphataseinhibitoren hinzugefügt.

Konzentration: Supernatant wurde sofort in vorgespülte PBS-Zentrifugalfilter (3 kDa MWCO) geladen und bei 4.000 x g für 90 Minuten bei 4 °C zentrifugiert, um eine 10-fache Konzentration zu erreichen.

Sekundäre Klarstellung: Das Konzentrat wurde in vorgekühlte Mikrozentrifugenröhren übertragen und bei 12.000 x g für 15 Minuten bei 4 °C zentrifugiert. Supernatant wurde gesammelt, um pelletierte Aggregate zu vermeiden.

Lagerung: Aliquots mit 50 μL-Volumina wurden in sterilen, proteinarm-bindenden Kryovials hergestellt. Die Fläschchen wurden innerhalb von 30 Minuten nach Abschluss der Ernte in flüssigem Stickstoff gefroren. Die Phiolen wurden bei -80 °C gelagert (keine Frost-Tau-Zyklen).

CM-Chargen wurden mit Endotoxin getestet (<0,25 EU/mL). Das Serumfreie Inkubationsprotokoll zeigte keine Stressinduktion (validiert durch HSP70/CHOP-Immunblots). Die CM-Protein-Ausbeute normalisiert sich bei der Ernte auf eine lebensfähige Zellanzahl/DNA-Gehalt. Verarbeitungsstrenge aufrechterhalten: sterile Technik durchgehend; ≤30 Minuten Fenster von Ernte bis zum Einfrieren; Temperaturausgleich des Rotors bestätigt.

CCK-8-Test konditionierter medienbehandelter Nierentubulärzellen

Um den funktionellen Einfluss des endothelialen Sekretoms auf die Lebensfähigkeit der nierenröhrigen Zellen zu bewerten, wurde ein CCK-8-Test an der humanen proximalen tubulären epibulären Zelllinie HK-2 durchgeführt, die mit CM behandelt wurde, die aus humanen nierenglomerulären Endothelzellen (HRGECs) stammt, gemäß festgelegten Protokollen. HK-2-Zellen wurden in einem DMEM-Medium kultiviert, das mit 10 % fetalem Rinderserum (FBS) ergänzt wurde. Für den Test wurden die Zellen in 96-Well-Platten mit einer Dichte von 5 x 10³ Zellen pro Bohrloch ausgesaat. Die Serumverhungerung der Zellen wurde 12 Stunden lang in einem Medium mit 0,5 % FBS durchgeführt, unmittelbar vor der CM-Behandlung.

CM wurde mit gleicher totaler normalisierter Proteinmasse angewendet. Gefrorene CM-Aliquots wurden bei 37 °C in einem trockenen Bad (<5 Min) aufgetaut und durch Zentrifugation bei 10.000 x g für 5 Minuten bei 4 °C geklärt. HK-2-Zellen (100 μL/Well) wurden mit HG-CM, NG-CM oder HM-CM behandelt, die auf den abgestimmten Protein/DNA-Gehalt normalisiert wurden. Insgesamt wurden pro Bedingung 3 biologische Replikate (jeweils 3 technische Replikate) vorbereitet. Die Proben wurden bei 37 °C mit 5 % CO₂ für 24 Stunden inkubiert. Die Zelllebensfähigkeit wurde mit dem Cell Counting Kit-8 bewertet. Dazu wurden jedem Brunnen 10 μL CCK-8-Lösung zugegeben und 1–4 Stunden bei 37 °C inkubiert. Die Absorption wurde mit 450 nm mittels eines Mikroplattenlesers gemessen. Die Lebensfähigkeit wurde berechnet wie folgt:

Viabilität (%) = [(A_sample - A_blank) / (A_baseline_control - A_blank)] x 100

Detektion von oxidativem Stress

Die cellulären Malondialdehydspiegel (MDA) wurden quantifiziert, eines der Hauptprodukte der Membranlipidperoxidation, mittels des TBA-Assays. Zelllysate (1 x 10 ×7 Zellen) wurden durch Zentrifugation bei 10.000 x g für 15 Minuten klarisiert, und anschließend wurde 0,02 mL Supernatant zusammen mit 0,02 mL MDA-Standards in Probenröhrchen eingestreut. Dem Aliquot wurden 0,02 ml Klärendestoff und 0,6 ml Säurereagenz hinzugefügt. Die Proben/Standards wurden mit 0,2 mL des chromogenen Agens behandelt (Kontrollröhren: 0,2 mL 50 % Essigsäure wurden hinzugefügt). Nach dem Abdichten, Mischen und Inkubieren bei 100 °C für 40 Minuten wurden die Proben abgekühlt und anschließend 10 Minuten lang bei 9569 x g zentrifugiert. Der Supernatant wurde bei 250 μL auf Mikroplatten übertragen, um eine OD₅₃₂-Messung zu erhalten.

Transkriptomisches Profiling

Die Gesamt-RNA wurde mit TRIzol-Reagenz gemäß dem Protokoll des Herstellers isoliert. RNA-Menge und Reinheit wurden jeweils mit einem Spektrophotometer und einem Fragmentanalysator bewertet. Für den Aufbau von Sequenzbibliotheken wurden nur hochwertige RNA-Proben mit RNA-Integritätsnummer (RIN) > 7,0 verwendet.

Polyadenylierte (poly(A)+) mRNA wurde durch zwei Runden oligo(dT)-magnetischer perlenbasierter Selektion angereichert. Die gereinigte mRNA wurde mit einem magnesiumbasierten Fragmentationskit bei 94 °C für 5–7 Minuten auf 200–300 Nukleotide fragmentiert. Die Erststrang-cDNA-Synthese erfolgte mit Reverse-Transkriptase, gefolgt von der Zweitstrang-cDNA-Synthese mit E. coli DNA-Polymerase I und RNase H in Anwesenheit von dUTP (zur Ermöglichung der Strang-Spezifität). Weitere Schritte umfassten Endreparatur, A-Tailing, Adapterligatur und Größenwahl mittels magnetischer Perlen. Vor der PCR-Amplifikation wurde der in dUTP integrierte zweite Strang mit dem UDG-Enzym verdaut.

Eine strengspezifische Bibliothek wurde mit einer durchschnittlichen Insert-Größe von 400 ± 50 bp mittels PCR unter folgenden Bedingungen erstellt: initiale Denaturierung bei 98 °C für 1 Minute; 14 Denaturierungszyklen bei 98 °C für 10 s, Annealing bei 60 °C für 30 s und Verlängerung bei 72 °C für 30 s; und eine letzte Verlängerung bei 72 °C für 5 Minuten. Die gepaarte 150-bp-Sequenzierung erfolgte auf einer Illumina-Plattform mit einer Sequenzierungstiefe von ≥40 Millionen Lesungen pro Probe (Q30 > 85 %).

Bioinformatische Analyse transkriptomischer Daten

Die Qualitätsprüfung der Rohlesungen erfolgte mit FastQC (v0.11.8), und die Ausrichtung auf das GRCh38.p13-Referenzgenom mit HISAT2 (v2.2.1) erfolgte. Die Quantifizierung von Transkripten und die Zusammenstellung des Transkripts pro Probe wurden mit StringTie (v2.1.6) mit Standardparametern durchgeführt. Alle zusammengesetzten Transkriptome wurden aus einzelnen Samples zusammengeführt, um ein umfassendes Transkriptom mit der gffcompled-Software (v0.12.6; gffcompare ist ein eigenständiges Werkzeug, kein Teil von StringTie, und seine Version ist auf die Common Stable Version korrigiert). Die differentielle Expressionsanalyse wurde mit DESeq2 (v1.38.3) unter Verwendung von Schwellenwerten von |log2-facher Änderung (FC)| durchgeführt. > 1 und False Discovery Rate (FDR) < 0,05. Batch-Effekte wurden über das VariancePartition-Paket korrigiert.

Sekretom-proteomische Analyse

CM wurde aus HRGECs entnommen, die unter NG-, HG- oder HM-Kontrollbedingungen mit der zuvor beschriebenen Methode13 kultiviert wurden, mit Modifikationen für die Sekretomanalyse. Die Zellen wurden nach der Stimulation mit PBS gewaschen und 12 Stunden lang in serumfreiem Medium inkubiert. CM wurde gesammelt und bei 3.000 x g für 10 Minuten (4 °C) zentrifugiert.

Gleiche Mengen Peptid aus jeder Probe wurden gemischt, dann mit Lösungsmittel A (5 % ACN, pH 9,8) verdünnt und in die Säule injiziert. Die Fraktionierung des Peptidgemisches erfolgte mit einer 3,5 μm großen 4,6 x 150 x 300 Extend-C18-Säule im binären Rapid Separation System. Die Gradient-Eluation erfolgte bei einer Durchflussrate von 0,3 mL/min: 5 % bis 21 % Lösungsmittel B (97 % ACN, pH 9,8) in 38 Minuten, 21,5 % bis 40 % Lösungsmittel B in 20 Minuten, 40 % bis 90 % Lösungsmittel B in 2 Minuten, 90 % Lösungsmittel B für 3 Minuten und 5 % Lösungsmittel B ausgeglichent für 10 Minuten. Elutionsspitzen wurden bei 214 nm überwacht, und Fraktionen wurden jede Minute gesammelt. Die Fraktionen wurden gemäß Chromatogramme der Eluationsspitzen kombiniert. Insgesamt wurden 10 Fraktionen gesammelt, die dann gefriertrocknet wurden.

Die mobilen Phasen A (100 % Wasser, 0,1 % Ameisensäure) und B (80 % Acetonitril) wurden vorbereitet, und die getrockneten Peptidproben wurden mit 0,1 % Ameisensäure rekonstituiert und bei 20.000 x g für 10 Minuten zentrifugiert. Die Trennung erfolgte mit einem UHPLC-Flüssigphasensystem. Die Proben wurden auf eine ES906 HPLC-Säule (150 mm) mit einem 8-minütigen Gradienten von 2,5 μL/min eingespeist und mit folgendem effektiven Gradienten getrennt: 0–4 Min, 4 % mobile Phase B linear ansteigend auf 25 %; 4–6,9 Minuten, mobile Phase B steigt linear von 25 % auf 35 % an; 6,9–7,3 Min, mobile Phase B steigt linear von 35 % auf 99 % an; 7,3–8,0 Minuten, mobile Phase B bei 99 % gehalten. Die flüssigkeitsphasengetrennten Peptide wurden in ein Massenspektrometer für die DIA-Modenerfassung übertragen. Die Hauptparameter wurden wie folgt gesetzt: normalisierte Kollisionsenergie 25 %, Standardladungszustand 2, Auflösung 240.000, Scanning alle 0,6 Sekunden, Scanbereich 380–980 m/z, Massenspektrometrie AGC 500 %. Fragmentations-Ionenscans wurden mit einer maximalen Scanzeit von 3 ms aufgezeichnet und nutzten 300 2-Te Scanfenster, die von 380 bis 980 m/z reichten.

Das DIA-NN (https://www.nature.com/articles/s41592-019-0638-x, Version 1.9.1) wurde verwendet, um die DIA-Daten mit einer bibliotheksfreien Methode zu analysieren. MS/MS-Daten wurden mit Proteinsequenzen durchsucht, die aus der Uniprot-Datenbank mit folgenden Einstellungen heruntergeladen wurden: Enzym: Trypsin/P; Maximale verpasste Dekolletés: 2; feste Modifikation: Carbamidomethyl (C); variable Modifikationen: Oxidation (M) und Acetyl (Protein N-Term); Vorläufer-Massentoleranz: 20 ppm; Fragmentmassetoleranz: 0,05 Da. Die Ergebnisse wurden mit 1 % FDR gefiltert, und es wurden nur jene Proteingruppen verwendet, die dieses Filterkriterium in der nachgelagerten Analyse erfüllten.

Omics-funktionale Anreicherungsanalyse (GO, KEGG und GSEA)

Funktionelle Anreicherungsanalysen wurden an gefilterten Sätzen differenziell exprimierter Gene (Transkriptomik) und Proteinen (Sekretomproteomik) durchgeführt, basierend auf etablierten bioinformatikbasierten Pipelines. Die Identifikatoren wurden mit Org.Hs.eg.db kartiert. Die GO-Anreicherung (biologische Prozesse, molekulare Funktionen, zelluläre Komponenten) wurde über clusterProfiler durchgeführt. Benjamini-Hochberg passte den p-Wert < 0,05 an, und die semantische Ähnlichkeitsreduktion (Cutoff=0,7) wurde auf Kondensationsterme angewandt. Die KEGG-Signalweganalyse wurde mit der KEGG REST API durchgeführt (HAS, Veröffentlichung 2023). Hypergeometrische Tests wurden mit der Yekutieli FDR-Korrektur eingesetzt. Die Visualisierung der Pathway-Topologie erfolgte mit Pathview. GSEA wurde mit einem rangbasierten Ansatz mit Signal-Rausch-Gen-Ranking angewendet. Testanreicherungen mit MSigDB-Sammlungen (HALLMARK, C2, C5; v2023.2) und kuratierten diabetischen Endothelsignaturen wurden durchgeführt. Die Signifikanz wurde nach 1000 Phänotyp-Permutationen bewertet (FDR < 25 %).

Analyse des Protein-Protein-Interaktionsnetzwerks

Um zentrale molekulare Regulatoren im pathogenen Kandidatenpool zu identifizieren, wurden PPI-Netzwerke und topologische Analysen mittels eines integrierten rechnergestützten Workflows durchgeführt. Die 278 Kandidatengene wurden der STRING-Datenbank (v12.0; Homo sapiens; Evidenzquellen umfassten experimentelle, ko-expressionistische und kuratierte Datenbanken; eine Interaktionskonfidenzschwelle (kombinierter Score) >0,7 für hohe Konfidenzvorteile; und keine zusätzliche Interaktor-Inflation. Die Ergebnisse wurden in Cytoscape (v3.9.1) importiert, und die Netzwerktopologieanalyse wurde mit MCODE (v1.5.2) und CytoHubba (v0.4.1) Plugins durchgeführt. Anschließend wurde das Netzwerk visuell entsprechend dem Grad der Verbindung der Knoten optimiert, sodass Knoten mit hoher Konnektivität dunkler gefärbt, größer und markanter im Label sind.

Entwicklung eines Zielgensets für diabetische Nierenerkrankungen

Die Kriterien für ko-upregulierte mRNAs/Proteine wurden wie folgt definiert: Transkriptom (FDR < 0,05 und |log2FC| > 1) und Sekretom (FDR < 0,01 und |log2FC| > 1,5). Protein- und Gennamen wurden mit UniProt normalisiert und in ein einheitliches Format (Gen-Symbol) umgewandelt. Ein Ziel-Genset wurde für diabetische Nierenerkrankungen erstellt, indem krankheitsassoziierte Gene aus mehreren öffentlichen Datenbanken integriert wurden, darunter GeneCards (Version 5.25, Abfragebegriff: Diabetische Nephropathien, abgerufen Juli 2025), die Comparative Toxicogenomics Database (CTD; https://ctdbase.org/, Abfragebegriff: Diabetische Nephropathien, abgerufen Juli 2025) und Open Targets Platform (https://platform.opentargets.org/, Version 0.13.8, Abfragebegriff: Diabetische Nephropathien, abgerufen Juli 2025) 13,14,15. Dies wurde als umfassender Referenzsatz für diabetische Nierenerkrankungen festgelegt. Die Schnittstelle zwischen ko-upregulierten mRNAs/Proteinen und diesem Gensatz wurde für nachgelagerte Analysen identifiziert.

CCL2-Proteindetektion

Zur Quantifizierung von CCL2 wurde eine 96-Well-Platte mit einem Capture-Antikörper (100 μL/Well) beschichtet und über Nacht bei 4 °C inkubiert. Am nächsten Tag wurde die Platte mit 2x mit Puffer gewaschen und mit ELISA-Verdünner (200 μL/Brunnen) für 1 Stunde bei RT blockiert. Eine 7-Punkt-Standardkurve wurde durch zweifache serielle Verdünnungen des S1-Standards erstellt, dann wurden die Proben (100 μL/Bohrloch) hinzugefügt und 2 Stunden bei 400 U/min inkubiert. Nach fünffacher Spülung wurde der Nachweisantikörper (100 μL/Bohrloch) hinzugefügt und 1 Stunde bei 400 U/min inkubiert, gefolgt von einer Enzymlösung (100 μL/Brunnen) und 30 Minuten Inkubation bei 400 U/min. Die Proben wurden mit TMB-Substrat entwickelt (15–30 min, RT). Die Reaktion endete mit Säure (100 μL/Brunnen), und die Absorptionskraft wurde bei 450 nm (620 nm Referenzoption) gemessen. Wichtige Schritte umfassen strenges Waschen, zeitgesteuerte Inkubationen und standardisierte Verdünnungen zur Gewährleistung der Reproduzierbarkeit.

Medikamenten-Neupositionierung

Therapeutische Verbindungen wurden mit folgender Plattform vorhergesagt: LINCS L1000 Characteristic Direction Signatures Search Engine (L1000CDS2; https://maayanlab.cloud/L1000CDS2). Diese Plattform verwendet die MODZ-Methode und die charakteristische Richtungsanalyse, um kleine Moleküle oder Verbindungskombinationen zu identifizieren, die in der Lage sind, Eingabe-Genexpressionssignaturen umzukehren oder nachzuahmen. Kandidaten für Medikamente wurden identifiziert, die die Dysregulation differenziell exprimierter Nierengene mit dieser Plattform umkehren. Die Verbindungen wurden anhand ihrer Umkehrwerte in Nierenzelllinien nach ausgewählter Niere in der Gewebesäule bewertet, und die bestplatzierten Kandidaten wurden molekularer Docking unterzogen, um ihre Bindungsaffinitäten zu den wichtigsten Proteinzielen zu bewerten.

Koregulatorisches Transkriptionsfaktor-Screening

Die hTFtarget-Datenbank wurde auf co-regulatorische TF-Bindung an den Gensatz abgerufen. Die hTFtarget-Datenbank wurde analysiert, um die Beziehungen zwischen menschlichen Transkriptionsfaktoren (TF) und Zielgenen durch computergestützte Analyse groß angelegter ChIP-Seq-Datensätze über verschiedene Zellen, Gewebe und Bedingungen hinweg zu identifizieren. Die integrative Pipeline kombinierte ChIP-Seq-Peak-Signale mit epigenetischen Kontexten, um die TF-Bindung in Promotoren/Enhancern genau zu bestimmen und dabei explizit die raumzeitliche regulatorische Dynamik zu berücksichtigen. Wie von Zhang et al. gezeigt, diente es als multidimensionale Plattform, die die Erforschung von TF-Zielen oder Genregulatoren, die Visualisierung von ChIP-Seq-Daten, die Untersuchung der TF-Kooperationativität und die Vorhersage von Bindungsstellenermöglichte 17.

Berechenbare Pipeline und Analyse für das Andocken von Kleinmolekülproteinen

AutoDock Vina 1.2.018 wurde verwendet, um molekulare Docking-Analysen von Bindungsinteraktionen zwischen Aktivstoffen und den Transkriptionsfaktoren BRD4, CTCF, EP300 und SPI1 durchzuführen. Die Kristallstrukturen von BRD4 (PDB ID: 7REK), CTCF (PDB ID: 5K5I), EP300 (PDB ID: 5NU5) und SPI1 (PDB ID: 8E3K) wurden aus der Protein Data Bank (https://www.rcsb.org/)19,20 gewonnen. Kleinmolekülstrukturen im SDF-Format wurden aus der PubChem-Datenbank heruntergeladen (https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/ 21), mit Open Babel 2.4.1 in MOL2-Format konvertiert und mit PyRx 0.8 energieminimiert. Die Proteinvorverarbeitung erfolgte durch Entfernung von Wassermolekülen, das Hinzufügen von Wasserstoffatomen, die Berechnung der Gasteiger-Ladungen und deren Umwandlung in das PDBQT-Format (erforderlich für AutoDock Vina). Eine halbflexible Andockstrategie wurde angewandt, bei der die Position und die Dimensionen des Andockgitters anhand der Bindungsstellen der kokristallisierten Liganden in jedem Protein definiert wurden. MA9-086 dient als positiver Kontrollligand für BRD4 und XDM-CBP für EP300. Für CTCF und SPI1 (ohne bekannte positive Liganden) wurden potenzielle Bindungstaschen mittels Strukturanalyse mit der Online-Plattform Proteins Plus (https://proteins.plus/) identifiziert. Die Andockgitterparameter wurden wie folgt gesetzt (Koordinaten und Abmessungen in Å entlang der x-, y- und z-Achsen): BRD4-Zentrum bei (-11,907, -8,617, -3,973) mit einer Boxgröße von (18,387, 18,387, 18,387); CTCF-Zentrum bei (15,165, 4,854, 6,388) und Boxgröße (17,25, 20,25, 9,75); EP300 in der Mitte (39,781, 5,326, 9,998) und Kastengröße (16,516, 16,516, 16,516); SPI1 in der Mitte bei (3,155, -3,853, 0,668) und Boxgröße (17,25, 25,5, 10,5). Während des Andockens wurde der Energiebereich auf 3 gesetzt, der Exhaustivitätsparameter auf 8 und der Gitterabstand auf 0,375 Å. Die Bindungsstabilität wurde anhand der Bindungsenergie bewertet, wobei niedrigere Werte auf stabilere Konformationen und eine höhere Wechselwirkungswahrscheinlichkeit hinweisen, mit einem Schwellenwert von <–5 kcal/mol, definiert als starke Bindungsaktivität22,23. Schließlich wurden mit PyMOL Interaktionsmodi zwischen Verbindungen und Rezeptoren identifiziert.

Statistische Analyse

Die Daten werden als Mittelwert ± SEM präsentiert. Statistische Tests wurden basierend auf Normalität (Shapiro-Wilk) und Varianzhomogenität (Levene-Test) ausgewählt. Ungepaarte T-Tests (zwei Gruppen) oder Einweg-ANOVA mit LSD-Post-hoc-Tests (≥3 Gruppen) wurden für Gruppenvergleiche verwendet. Ein p < 0,05 wurde als Signifikanzschwelle definiert. Graphen wurden mit GraphPad Prism 9.0 generiert.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Demonstration des pathogenen Einflusses des hyperglykämischen endothelialen Sekretoms auf die Nierentubuli

Diese Studie begann mit der Validierung des pathogenen Effekts des hyperglykämischen endothelialen Sekretoms. Konditioniertes Medium aus hyperglykämischen menschlichen glomerularen Endothelzellen (HG-CM) beeinträchtigte die Lebensfähigkeit der menschlichen proximalen Tubulusepithelzellen (HK-2) im Vergleich...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Diese Studie stellt durch hyperglykämie-induzierte Endothelsekretom-Dysfunktion als entscheidenden Treiber diabetischer Nierenschäden durch integrierte Multi-Omics und rechnergestützte Ansätze dar. Der Nachweis, dass sekretomvermittelte Zytotoxizität gegenüber Nierentubuli mit systematischer Dysregulation von 534 endothelial-abgeleiteten Faktoren zusammenfällt, die sich auf Matrixremodellierung, oxidativen Stress und Entzündungskernwege in der DKD-Pathogenese konvergen. Die Identifikatio...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Die Autoren haben nichts offenzulegen.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Diese Arbeit wurde von der National Natural Science Foundation of China (32200644), dem Science and Technology Program Project von Hebei (246W2501D, 252W7716D) und der Yanzhao Golden Platform (A20240022) unterstützt.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
CCL2 ELISA-KitThermo Fisher Scientific#88-7399-88
CCR2-InhibitorMerck Millipore#227016
Zellviabilitäts-Assay-KitSieben BiotechnologienCCK-8, SC119-01
DNA-SequenziererIlluminaNovaSeq 6000
Hochleistungs-FlüssigchromatographiesystemThermo Fisher ScientificUltiMate 3000 Binär-RSLC
Kulturmedium HRGECsShanghai Ziao Xin Zhou Biotechnology Co., Ltd.1001
Menschliche renale glomeruläre Endothelzellen (HRGECs)Shanghai Zhongqiao Xinzhou BiotechnologiePRI-H-00038
Menschliche Nierentubuläre Epithelzelle Vollständiges Medium ProcellCM-H193
Menschliche Nierentubulare Epithelzellen (HK2)ProcellCP-H193
Männliche db/db- und db/m-Mäuse (4 Wochen alt)Hangzhou Ziyuan Biotech Co., Ltd.SCXK 20190004
MassenspektrometerThermo Fisher ScientificAstral
Mikroplatten-AbsorptionsleserMolekulare BauelementeSpectraMax iD5
Protease-Inhibitor-Cocktail (EDTA-frei)RochecOmplete, #5056489001
RNA-ExtraktionsreagenzThermo Fisher ScientificTRIzol, #15596026
RNA-QualitätsanalysatorAgilent Technologien5300 Fragmentanalysator, M5311AA
RNA-QuantifizierungsinstrumentThermo Fisher ScientificQubit 3.0, Q33216
ROS-DetektionskitThermo Fisher Scientific#EEA019
Ultrafiltrations-Zentrifugalbauelemente (3 kDa MWCO)Merck MilliporeAmicon Ultra-4

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Tuttle, K. R., et al. Diabetic kidney disease: a report from an ADA Consensus Conference. Diabetes Care. 37 (10), 2864-2883 (2014).
  2. Gu, H. F. Genetic and Epigenetic Studies in Diabetic Kidney Disease. Front Genet. 10, 507(2019).
  3. Młynarska, E., et al. Novel Insights into Diabetic Kidney Disease. Int J Mol Sci. 25 (18), (2024).
  4. Tanase, D. M., et al. Oxidative Stress and NRF2/KEAP1/ARE Pathway in Diabetic Kidney Disease (DKD): New Perspectives. Biomolecules. 12 (9), (2022).
  5. Li, S., et al. Research progress on extracellular vesicles in the renal tubular injury of diabetic kidney disease. Front Endocrinol (Lausanne). 14, 1257430(2023).
  6. Chen, Y., et al. ANGPT2/CAV1 regulates albumin transcytosis of glomerular endothelial cells under high glucose exposure and is impaired by losartan. Nefrologia (Engl Ed). 44 (1), 50-60 (2024).
  7. Chae, S. Y., Kim, Y., Park, C. W. Oxidative Stress Induced by Lipotoxicity and Renal Hypoxia in Diabetic Kidney Disease and Possible Therapeutic Interventions: Targeting the Lipid Metabolism and Hypoxia. Antioxidants. 12 (12), (2023).
  8. Wang, X., et al. CERS6-derived ceramides aggravate kidney fibrosis by inhibiting PINK1-mediated mitophagy in diabetic kidney disease. Am J Physiol Cell Physiol. 325 (2), C538-C549 (2023).
  9. Zou, Y., et al. Development and internal validation of machine learning algorithms for end-stage renal disease risk prediction model of people with type 2 diabetes mellitus and diabetic kidney disease. Ren Fail. 44 (1), 562-570 (2022).
  10. Ma, L., et al. Baicalin Alleviates Oxidative Stress and Inflammation in Diabetic Nephropathy via Nrf2 and MAPK Signaling Pathway. Drug Des Devel Ther. 15, 3207-3221 (2021).
  11. Du, L., et al. Inhibition of S100A8/A9 ameliorates renal interstitial fibrosis in diabetic nephropathy. Metabolism. 144, 155376(2023).
  12. Imafuku, T., et al. Cysteinylated Albumin as a Potential Biomarker for the Progression of Kidney Disease in Patients With Type 2 Diabetes. Diabetes Care. 44 (6), e115-e117 (2021).
  13. Ochoa, D., et al. The next-generation Open Targets Platform: reimagined, redesigned, rebuilt. Nuc Acids Res. 51 (D1), D1353-D1359 (2023).
  14. Safran, M., et al. GeneCards Version 3: the human gene integrator. Database (Oxford). 2010, baq020(2010).
  15. Davis, A. P., et al. Comparative Toxicogenomics Database (CTD): update 2023. Nucl Acids Res. 51 (D1), D1257-D2126 (2023).
  16. Duan, Q., et al. L1000CDS2: LINCS L1000 characteristic direction signatures search engine. NPJ Syst Biol Appl. 2 (1), (2016).
  17. Zhang, Q., et al. hTFtarget: A Comprehensive Database for Regulations of Human Transcription Factors and Their Targets. Genom Proteo Bioinfo. 18 (2), 120-128 (2020).
  18. Trott, O., Olson, A. J. AutoDock Vina: Improving the speed and accuracy of docking with a new scoring function, efficient optimization, and multithreading. J Comp Chem. 31 (2), 455-461 (2009).
  19. Karuppasamy, M. P., Venkateswaran, S., Subbiah, P. PDB-2-PBv3.0: An updated protein block database. J Bioinfo Comp Biol. 18 (02), (2020).
  20. O'Boyle, N. M., et al. Open Babel: An open chemical toolbox. J Cheminfo. 3 (1), (2011).
  21. Kim, S., et al. PubChem Substance and Compound databases. Nuc Acids Res. 44 (D1), D1202-D1213 (2016).
  22. Li, B., Rui, J., Ding, X., Yang, X. Exploring the multicomponent synergy mechanism of Banxia Xiexin Decoction on irritable bowel syndrome by a systems pharmacology strategy. J Ethnopharmacol. 233, 158-168 (2019).
  23. Xue, B., et al. A System-Level Investigation into the Mechanisms of Chinese Traditional Medicine: Compound Danshen Formula for Cardiovascular Disease Treatment. PLoS ONE. 7 (9), (2012).
  24. Kasiske, B. L., et al. Response to Bui et al, "Patient Functional Status at Transplant and Its Impact on Posttransplant Survival of Adult Deceased-donor Kidney Recipients". Transplantation. 104 (2), e59(2020).
  25. Kawecki, C., Lenting, P. J., Denis, C. V. von Willebrand factor and inflammation. J Thromb Haemost. 15 (7), 1285-1294 (2017).
  26. Wilkening, A., et al. C-C chemokine receptor type 2 mediates glomerular injury and interstitial fibrosis in focal segmental glomerulosclerosis. Nephrol Dial Transplant. 35 (2), 227-239 (2020).
  27. Karasek, D., et al. Association of pigment epithelium derived factor with von Willebrand factor and plasminogen activator inhibitor 1 in patients with type 2 diabetes. Physiol Res. 68 (3), 409-418 (2019).
  28. Liu, J., et al. Single-Cell Spatial Transcriptomics Unveils Platelet-Fueled Cycling Macrophages for Kidney Fibrosis. Adv Sci (Weinh). 11 (29), e2308505(2024).
  29. Passi, I., Salwan, S., Kumar, B. US-FDA Approved Drugs in 2020 and 2021: A Review. Mini Rev Med Chem. 23 (12), 1273-1297 (2023).
  30. Das, P., Delost, M. D., Qureshi, M. H., Smith, D. T., Njardarson, J. T. A Survey of the Structures of US FDA Approved Combination Drugs. J Med Chem. 62 (9), 4265-4311 (2019).
  31. Zhou, L., et al. Brefeldin A inhibits colorectal cancer growth by triggering Bip/Akt-regulated autophagy. Faseb J. 33 (4), 5520-5534 (2019).
  32. Issa, M. E., Berndt, S., Carpentier, G., Pezzuto, J. M., Cuendet, M. Bruceantin inhibits multiple myeloma cancer stem cell proliferation. Cancer Biol Ther. 17 (9), 966-975 (2016).
  33. Guzzi, F., Cirillo, L., Roperto, R. M., Romagnani, P., Lazzeri, E. Molecular Mechanisms of the Acute Kidney Injury to Chronic Kidney Disease Transition: An Updated View. Int J Mol Sci. 20 (19), (2019).
  34. Tesch, G. H. MCP-1/CCL2: a new diagnostic marker and therapeutic target for progressive renal injury in diabetic nephropathy. Am J Physiol Renal Physiol. 294 (4), F697-F701 (2008).
  35. Wu, F., Sun, C. The Role of Chemokine Receptors in Renal Fibrosis. Rev Physiol Biochem Pharmacol. 177, 1-24 (2020).
  36. Davids, M. S., et al. An Integrated Safety Analysis of the Next Generation PI3Kδ Inhibitor Umbralisib (TGR-1202) in Patients with Relapsed/Refractory Lymphoid Malignancies. blood. 130, 4037(2017).
  37. Marar, P. V., Kumar, A., Swami, R., Shrivastava, S., Jeengar, M. K. Unlocking the Potential of Brusatol as an Antitumoral Agent: Molecular Mechanisms and Therapeutic Benefits. Rev Brasileira Farmaco. 34, 250-260 (2024).
  38. Seifert, S. A., et al. Acute hepatotoxicity associated with therapeutic doses of intravenous acetaminophen. Clin Toxicol. 54 (3), 282-285 (2016).
  39. Bolesta, S., Haber, S. L. Hepatotoxicity Associated with Chronic Acetaminophen Administration in Patients without Risk Factors. Ann Pharmacother. 36 (2), 331-333 (2002).
  40. Zhao, L., Zou, Y., Liu, F. Transforming Growth Factor-Beta1 in Diabetic Kidney Disease. Front Cell Dev Biol. 8, 187(2020).
  41. Matoba, K., et al. Unraveling the Role of Inflammation in the Pathogenesis of Diabetic Kidney Disease. Int J Mol Sci. 20 (14), (2019).
  42. Ezzo, M., Hinz, B. Novel approaches to target fibroblast mechanotransduction in fibroproliferative diseases. Pharmacol Ther. 250, 108528(2023).
  43. Giarratana, A. O., Prendergast, C. M., Salvatore, M. M., Capaccione, K. M. TGF-β signaling: critical nexus of fibrogenesis and cancer. J Transl Med. 22 (1), 594(2024).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Endothelial DysfunctionDiabetic Kidney DiseaseMulti Omics AnalysisTranscriptomic ProfilingSecretome ProteomicsHyperglycemic Endothelial CellsProtein Interaction NetworkDrug RepurposingNetwork PharmacologyMolecular Docking

Related Articles