Forschungsartikel
Ein kollagenase-induziertes Mausmodell der intrazerebralen Blutung (ICH) wurde mit Lansoprazol behandelt. Lansoprazol linderte nicht nur durch ICH verursachte Darmschäden und senkte die Lipopolysaccharidspiegel (LPS) und IL-1β, sondern hemmte auch Hirnentzündungen. Lansoprazol verbesserte das Lernen und das Gedächtnis (langfristige neurologische Funktion) von ICH-Mäusen.
Eine intrazerebrale Blutung (ICH) kann den Magen-Darm-Trakt beeinträchtigen und eine Darmverletzung auslösen, was zu schlechten klinischen Ergebnissen führt. Diese Studie untersuchte die Auswirkungen von Lansoprazol auf Darmverletzungen und neurologische Funktionen bei Mäusen mit ICH. Mäuse wurden stereotaktisch mit Kollagenase injiziert, um ein ICH-Modell zu etablieren. Neurologische Funktionen, Wassergehalt im Gehirn, Durchlässigkeit der Blut-Hirn-Schranke, Darmverletzungen und Darmdurchlässigkeit wurden untersucht. Auch die Werte von LPS und IL-1β im Blut und Gehirn wurden untersucht. Die Behandlung mit Lansoprazol war mit einer Linderung von Darmschädigungen, einem reduzierten LPS- und IL-1-1β-Spiegel im Blut und Gehirn, einem geringeren Wassergehalt im Gehirn und einer gehemmten Entzündung im Gehirn bei ICH-Mäusen assoziiert. Während die Verabreichung von Lansoprazol bei den Garcia-, Vordergliedmaßen-Platzierungs- und Rotarod-Tests (Kurzzeit-neurologische Funktion) nicht zu einer verbesserten Leistung führte, verbesserte sie das Lernen und das Gedächtnis (Langzeit-Neurofunktion) signifikant. Diese Ergebnisse zeigten, dass die Behandlung mit Lansoprazol mit verbesserten langfristigen neurologischen Ergebnissen und einer reduzierten Darmverletzung bei ICH-Mäusen assoziiert war.
Hämorrhagischer Schlaganfall hat hohe Sterblichkeitsraten und Behinderungen. In letzter Zeit ist die Prävalenz von Schlaganfällen in China gestiegen, was sie zur führenden Todesursache macht. Obwohl seltener, ist intrazerebrale Blutung (ICH) deutlich tödlicher als ein ischämischer Schlaganfall. Studien berichten von einer Sterblichkeitsrate von 40 % innerhalb eines Monats nach ICH; Außerdem können etwa 75 % der Überlebenden ein Jahr späternicht mehr selbstständig leben.
Das Gehirn kommuniziert mit dem Magen-Darm-Trakt über mehrere Wege, darunter den Vagusnerv, das enterische Nervensystem und den Darmmikrobieller Stoffwechsel. Die Gehirn-Darm-Achse ist ein gut erkanntes und klinisch relevantesRegulationssystem. Die Darmschleimhaut reguliert die Aufnahme von Wasser, Elektrolyten und Nährstoffen und verhindert das Eindringen von Krankheitserregern und Toxinen in den Blutkreislauf. ICH kann diese Darmbarriere beschädigen und eine gastrointestinale Verletzung verursachen. Barrieredysfunktion trägt wiederum zu Mangelernährung, Immunsuppression und schlechten klinischen Ergebnissenbei 4. Durch ICH induzierte Erhöhungen der Darmdurchlässigkeit ermöglichen es schädlichen endogenen Substanzen, in den Blutkreislauf einzudringen, was systemische Entzündungsreaktionen und das Multiple-Organ-Dysfunktionssyndrom auslöst. Eine Schädigung der Darmschleimhaut nach ICH kann sogar dazu führen, dass Darmbakterien in den Blutkreislauf translokationieren, was potenziell zu systemischen Infektionen führenkann 5. Viele Patienten entwickeln Darmdysmotilität, mikrobielle Dysbiose, Schleimhautblutungen und Sepsis. Eine frühere Studie zeigte, dass ICH die Migration von Darmkrankheitserregern und Toxinen ins Gehirnverursacht.
Lansoprazol, ein Protonenpumpenhemmer (PPI), hemmt die Protonenpumpe irreversibel und reduziert dadurch die Magensäuresekretion. Es wird zur Behandlung von Magen- und Zwölffingerdarmgeschwüren, erosiver Ösophagitis, gastroösophagealer Refluxerkrankung sowie nichtsteroidalen, entzündungshemmenden Medikamenten assoziierten Magenulkuseingesetzt 7. Eine frühere Studie zeigte, dass PPI-Prophylaxe die Patientenergebnisse bei ischämischem Schlaganfall8 negativ beeinflusste. Weitere veröffentlichte Studien deuteten auf einen Zusammenhang zwischen PPI-Nutzung und kognitivem Abbau hin. Eine epidemiologische Studie zeigte, dass Patienten, die PPIs verabreicht wurden, ein erhöhtes Risiko hatten, an Demenz und Alzheimer zu erkranken9. Eine prospektive Kohortenstudie, die Langzeit-PPI-Konsumenten mit Nicht-Nutzern verglich, ergab, dass PPI-Konsum mit einem erhöhten Demenzrisiko assoziiert ist, und die Autoren rieten als präventiveMaßnahme 10 von der Verwendung von PPI bei gefährdeten Patienten ab. Die vorliegende Studie wurde durchgeführt, um die Auswirkungen von Lansoprazol auf Darmschäden sowie auf die kurz- und langfristige neurologische Funktion (insbesondere Lernen und Gedächtnis) bei Mäusen mit ICH zu untersuchen. Wir vermuten, dass Lansoprazol die Durchdringung von LPS durch seine darmbarriereschützenden Wirkung hemmen kann, systemische und neurologische Entzündungen lindert und somit die neurologische Funktion bei ICH-Mäusen verbessert.
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Die Experimente wurden gemäß dem Leitfaden für die Pflege und Nutzung von Labortieren der National Institutes of Health (NIH Publication Nr. 8023, überarbeitet 1978) durchgeführt. Das Protokoll wurde vom Ethikausschuss der Yantai-Universität genehmigt (Genehmigungsnummer YTDX20240526). Gefahrstoffe wurden gemäß institutionellen Protokollen für chemische Abfälle entsorgt. Abbildung 1 zeigt ein schematisches Diagramm des experimentellen Designs. Die Reagenzien und die verwendeten Geräte sind in der Materialtabelle aufgeführt.
1. Tierdetails
Männliche CD-1-Mäuse mit einem Gewicht von 22–25 g wurden in einem Raum mit einem 12/12-Stunden-Hell/Dunkel-Zyklus untergebracht. Die Tiere durften sich frei Futter und Wasser holen.
2. Vorbereitung des ICH-Mausmodells
Das Mausmodell von ICH wurde laut einem früheren Bericht11 festgelegt. Kurzzeitig wurden die Mäuse mit Xylazin (10 mg/kg) und Ketamin (90 mg/kg) betäubt und anschließend in einem stereotaxischen Rahmen positioniert. Ein kleines Gratloch wurde an der rechten koronalen Naht gebohrt (2,2 mm lateral zur Mittellinie, 0,2 mm hinter dem Bregma). Eine Mikrospritze wurde in die rechte Gehirnhälfte in einer Tiefe von 3,5 mm von der Schädeloberfläche eingebracht. Mit einer Mikroinfusionspumpe wurde bakterielle Kollagenase (0,075 U in 0,5 μL phosphatgepufferter Kochsalzlösung [PBS]) mit einer Geschwindigkeit von 0,15 μL/min infundiert. Die Nadel wurde nach 5 Minuten vorsichtig herausgezogen. Mäuse in der Scheingruppe erhielten eine entsprechende Menge PBS anstelle von Kollagenase. Das Gratloch wurde mit Knochenwachs versiegelt, und der Kopfhautschnitt wurde genäht. Die Körpertemperatur der Tiere wurde bis zum Erwachen bei 37 °C gehalten.
3. Versuchsdesign
Männliche CD-1-Mäuse wurden zufällig drei Gruppen zugeteilt: Sham, Model und Lansoprazol. Das ICH-Modell wurde wie oben beschrieben etabliert. Dreißig Minuten nach der ICH-Induktion erhielten Mäuse in der Lansoprazol-Gruppe Lansoprazol in einer Dosis von 30 mg/kg (die Dosis Lansoprazol wurde gemäß einem früheren Bericht12 gewählt), das einmal täglich für drei aufeinanderfolgende Tage verabreicht wurde. Mäuse in der Schein- und Modellgruppe erhielten intraperitoneale Injektionen von PBS. Drei Tage nach ICH wurde die kurzfristige neurologische Funktion mit dem Garcia-Test, dem Vordergliedmaßen-Placement-Test und dem Rotarod-Test bewertet. Am Tag 29 nach der ICH-Einleitung wurden die neuartigen Objekterkennungs- und Wasserlabyrinthtests durchgeführt, um die langfristige neurologische Funktion zu bewerten.
4. Garcia-Test
Zwei Forscher, die der Gruppe geblendet waren, führten den Garcia-Test gemäß einem zuvor berichteten Protokoll13 durch. Die neurologische Funktion wurde mit einem Bewertungssystem von 0 bis 21 bewertet. Die Bewertung besteht aus sieben Untertests, die jeweils von 0 bis 3 bewertet werden (0 = schlechteste, 3 = beste).
5. Platzierungstest der Vordergliedmaße
Nach dem Garcia-Test wurde der Vordergliedmaßen-Platzierungstest nach der zuvor beschriebenen Methode14 durchgeführt. Die Mäuse wurden vertikal gehalten, parallel zur Tischplatte, sodass ihre Vibrissen über die Oberfläche streichen konnten. Die Positionierung der Vordergliedmaßen wurde in 10 aufeinanderfolgenden Studien beobachtet. Der Prozentsatz der Platzierung der linken vorderen Gliedmaße wurde berechnet als: Platzierung der linken vorderen Gliedmaße / (Platzierung der linken vorderen Gliedmaße + Platzierung der rechten vorderen Gliedmaße) × 100 %.
6. Rotarod-Test
Nach dem Vorderglied-Platzierungstest wurden die Mäuse für 3 Minuten auf eine rotierende Stange bei 5 U/min zum Training gesetzt. Die Stange wurde innerhalb von 4 Minuten von 5 auf 30 U/min beschleunigt. Die Dauer, die jede Maus auf der Stange verweilte, wurde über einen Zeitraum von 5 Minuten aufgezeichnet, und die Fluchtlatenz wurde15 Minuten registriert.
7. Darmdurchlässigkeit und Hirnödem-Test
Nach dem Rotarod-Test wurden aus jeder Gruppe zufällig sechs Mäuse ausgewählt. Nach der vorherigen Methode16 wurde FITC-Dextran intragastrisch in einer Dosis von 300 mg/kg verabreicht. Drei Stunden später wurden die Mäuse mit Isofluran betäubt, und Blut wurde aus dem retro-orbitalen Venenplexus entnommen, das bei 4 °C und 11.000 × g für 5 Minuten zentrifugiert wurde. Der FITC-dextran-Gehalt wurde mit einem Fluoreszenzplattenmesser mit 485 nm Anregung und 528 nm Emissionswellenlängen untersucht. Die Tiere wurden dann enthauptet, und die rechte Gehirnhälfte wurde gesammelt und gewogen, um das Nassgewicht zu bestimmen. Das Gewebe wurde 24 Stunden lang bei 100 °C getrocknet, um das Trockengewicht zu bestimmen. Der Gehirnwassergehalt (%) wurde berechnet als: [(Nassgewicht − Trockengewicht) / Nassgewicht] × 100%.
8. Blut-Hirn-Schranke (BBB) Permeabilitätsuntersuchung
Nach dem Rotarod-Test wurden aus jeder Gruppe zufällig sechs Mäuse ausgewählt, um die BBB-Permeabilität zu bewerten. Eine 2%ige Evans-Blue-Lösung wurde intraperitoneal mit 4 mL/kg verabreicht. Drei Stunden später wurden die Mäuse mit Isofluran betäubt, und die transkardiale Perfusion wurde mit PBS durchgeführt. Die rechte Gehirnhälfte wurde in 50 % Trichloressigsäure im Verhältnis 3:1 homogenisiert (Hirngewebe: Trichloressigsäure). Das Homogenat wurde bei 15.000 × g und 4 °C für 20 Minuten zentrifugiert. Anschließend wurden 500 μL des Supernatanten mit 500 μL 70 % Ethanol gemischt und über Nacht bei 4 °C im Dunkeln inkubiert. Die Konzentration von Evans Blue wurde bei 610 nm gemessen und mit einer Standardkurve quantifiziert. Die Daten werden als μg Evans Blue pro mg Hirngewebe präsentiert.
9. Histopathologische Untersuchung von Darm und Gehirn
Nach dem Rotarod-Test wurden aus jeder Gruppe zufällig drei Mäuse ausgewählt. Die Mäuse wurden mit Isofluran betäubt. Das Jejunum, das Ileum und das Gehirn wurden gesammelt und in 10 % Formaldehyd fixiert. Die Gewebe wurden mit einer Dicke von 5 μm durchschnitten, und es wurde eine Hämatoxylin-Eosin (HE)-Färbung durchgeführt. Die histopathologische Untersuchung von Darm und Gehirn wurde mit einem Mikroskop von zwei Experimentatoren durchgeführt, die für die Gruppenzuweisungen blind waren. Die Anzahl der Mikroglia, die das Hämatom umgeben, wurde in repräsentativen Abschnitten gezählt. Zellzählungen wurden in fünf beliebigen Gesichtsfeldern über drei Abschnitte pro Tier durchgeführt.
10. Messung von LPS und IL-1β
Nach dem Rotarod-Test wurden aus jeder Gruppe zufällig sechs Mäuse ausgewählt. Die Mäuse wurden mit Isofluran betäubt, und Blut wurde entnommen. Blutproben wurden 10 Minuten lang bei 5.000 × g und 4 °C zentrifugiert, und es wurde Serum entnommen. Die rechte Gehirnhälfte wurde entnommen, und Hirnhomogenate wurden im Verhältnis 1:3 (Gehirngewicht in Gramm zum PBS-Volumen in Millilitern) hergestellt. Die Homogenate wurden bei 12.000 × g und 4 °C für 10 Minuten zentrifugiert. Die Proteinkonzentrationen im Supernatant wurden mit einem BCA-Kit bestimmt. Die Werte von LPS und IL-1β sowohl im Serum als auch im Gehirnhomogen wurden mit ELISA-Kits gemessen, wobei die Anweisungen des Herstellers folgten.
11. Transmissionselektronenmikroskopie
Für die elektronenmikroskopische Untersuchung wurden nach dem Rotarod-Test zufällig drei Tiere aus jeder Gruppe ausgewählt. Die Mäuse wurden mit Isofluran betäubt und erhielten eine transkardiale Perfusion mit 2 % Glutaraldehyd und 2,5 % Paraformaldehyd in 0,1 M PBS (nach institutionell genehmigten Protokollen). Das Gehirn, das Jejunum und das Ileum wurden dann entnommen und über Nacht in 2 % Glutaraldehyd in einem 0,1 M Kakodylatpuffer (pH 7,4) bei 4 °C platziert. Die Proben wurden anschließend für 1 Stunde bei Raumtemperatur auf 1 % Osmiumtetroxid übertragen. Das Gewebe wurde in ultradünne Abschnitte (50 nm) geschnitten. Nach der Dehydrierung wurden die Schnitte mit Uranylacetat und Bleicitrat gefärbt, um sie unter einem Transmissionselektronenmikroskop zu beobachten. Alle Schnitte wurden blind untersucht und mit einem Transmissionselektronenmikroskop fotografiert.
12. Neue Objekterkennung
29 Tage nach der ICH-Modellierung wurde der neuartige Objekterkennungstest durchgeführt, um die Lern- und Gedächtnisfunktion von Mäusen zu bewerten. Am ersten Tag wurden keine Objekte in die Ausrüstung gelegt (Länge: 40 cm, Breite: 40 cm, Höhe: 40 cm), sodass die Mäuse 5 Minuten lang frei erkunden konnten. Am zweiten Tag wurden zwei identische Gegenstände in das Gerät gelegt, und die Mäuse durften sie 5 Minuten lang erkunden. Vierundzwanzig Stunden später wurde eines der Objekte durch ein neuartiges Objekt ersetzt. Die Mäuse erkundeten die beiden Objekte erneut 5 Minuten lang. Die Erkundungszeit wurde aufgezeichnet, wenn die Nase der Maus ein Objekt berührte oder wenn ihr Kopf im Abstand von 1 cm zum Objekt ausgerichtet war. Die Zeit, die mit der Erforschung des neuartigen Objekts verbracht wurde, wurde gemessen und berechnet. Eine längere Erkundungszeit des neuen Objekts deutet auf besseres Lernen und Gedächtnis hin.
13. Morris-Wasserlabyrinth
32 Tage nach der ICH-Modellierung wurden Lern- und Gedächtnisfunktionen mit dem Morris-Wasserlabyrinth bewertet. Das Gerät bestand aus einem runden Becken (Durchmesser: 100 cm, Höhe: 40 cm), das mit Wasser gefüllt war (Tiefe: 25 cm), das bei 22 °C ± 1 °C gehalten wurde. Eine Fluchtplattform (Durchmesser: 9 cm) war 1 cm unter der Wasseroberfläche untergetaucht. Im Navigationstest wurden die Mäuse täglich vier Versuche durchgeführt. Die Zeit, die benötigt wurde, um die Plattform zu finden, wurde als Fluchtverzögerung aufgezeichnet. Mäuse, die die Plattform innerhalb von 60 Sekunden nicht fanden, wurden behutsam dorthin geführt. Am fünften Tag wurde ein 60-Sekunden-Sondentest durchgeführt. Die Speicherfunktion wurde durch Aufzeichnung der Fluchtlatenz, der Anzahl der Überquerungen der Plattform und der Zeit im Zielquadranten bewertet. Die Daten wurden mit Video-Tracking-Software analysiert.
14. Statistische Analyse
Die Daten wurden mit der GraphPad Prism Software Version 7.0 analysiert. Die Ergebnisse werden als Mittelwert ± Standardabweichung präsentiert. Der Shapiro-Wilk-Test wurde verwendet, um zu beurteilen, ob die Daten jeder Gruppe einer Normalverteilung folgten. Die Unterschiede zwischen den Gruppen wurden durch eine Einweg-ANOVA analysiert, gefolgt von Tukeys Post-hoc-Test. Für nichtparametrische Vergleiche wurde der Kruskal-Wallis-Test verwendet, der von Dunns Test gefolgt wird. Ein p-Wert von <0,05 galt als statistisch signifikant.
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Auswirkungen von Lansoprazol auf die kurzfristige neurologische Funktion bei ICH-Mäusen
Im Vergleich zur Scheingruppe zeigten Mäuse in der ICH-Gruppe signifikant niedrigere Ergebnisse im Garcia-Test (S. < 0,01). Mäuse in der Lansoprazol-Gruppe zeigten jedoch keine verbesserten Garcia-Werte im Vergleich zur ICH-Gruppe (p > 0,05) (Abbildung 2A). Ähnlich war der...
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Eine Darmverletzung ist eine häufige Komplikation bei Patienten mit ICH. Durch ICH verursachte Darmschäden können zu Mangelernährung, längeren Krankenhausaufenthalten, schlechten Ergebnissen und sogar zu einer Sterblichkeitführen. Mit einem ICH-Tiermodell zeigte diese Studie erstmals, dass Lansoprazol Darmschäden bei ICH-Mäusen abschwächt. Obwohl Lansoprazol keine positiven Effekte auf die kurzfristige neurologische Funktion zeigte, verbesserte es die langfristige...
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Die Autoren erklären, dass sie keine Interessenkonflikte haben.
Wir danken Angela Morben von Liwen Bianji (Edanz) (www.liwenbianji.cn/) für die Bearbeitung des englischen Textes eines Entwurfs dieses Manuskripts. Die vorliegende Studie wurde durch Fördermittel des Taishan Scholar Funding Project der Provinz Shandong unterstützt.
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| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| BCA-Trikot | Beyotime Biotechnologie | P0009 | |
| Kollagenase | Sigma-Aldrich | 128M4107v | |
| Evans Blue Farbstoff | Sigma-Aldrich | MKCG7507 | |
| FITC-dextran | Sigma-Aldrich | 46944 | |
| GraphPad Prism 7.0 | GraphPad Statistical Software, Boston, MA, USA, www.graphpad.com | Prism 7.0 | |
| Lansoprazol | Shandong Yuxin pharmaceutical Co., Ltd. | 524093053 | |
| LPS ELISA-Kit | Cusabio biotech Co., Ltd. | M25036407 | |
| Mäuse | Jinan Pengyue Experimental Animal Breeding Co., Ltd. | SCXK20220006 | |
| Mikroinfusionspumpe | Weltpräzisionsinstrumente | Micro 3 | |
| Mikrospritze | Hamilton Company | SYR 10 & mu; L | |
| Olympus-Mikroskop | Olympus Co., Ltd. | IX-70 | |
| Rotarod | Panlab Co., Ltd. | LE8205 | |
| Stereotaxischer Rahmen | Kopf-Instrumente | Modell 902-A | |
| TNF-α ELISA-Kit | Beyotime Biotechnologie | PI301 | |
| Transmissionselektronenmikroskop | JEOL Ltd. | JEM-100SX | |
| Video-Tracking-Software | Panlab Co., Ltd. | Smart 3.0 |
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