Methodenartikel

Charakterisierung der von Adipozyten abgeleiteten extrazellulären Vesikelsekretion mittels eines CD63-GFP-Reporter-Mausmodells in vivo und in vitro

DOI:

10.3791/69670

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5. Dezember 2025

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1Department of Medicine, Albert Einstein College of Medicine, 2Fleischer Institute for Diabetes and Metabolism, Albert Einstein College of Medicine, 3Department of Molecular Pharmacology, Albert Einstein College of Medicine, 4Department of Microbiology and Immunology, Albert Einstein College of Medicine, 5Division of Infectious Diseases, Department of Medicine, Albert Einstein College of Medicine, 6Department of Developmental and Molecular Biology, Albert Einstein College of Medicine

In diesem Artikel

Zusammenfassung

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Das Protokoll verwendet eine adipozytenspezifische CD63-GFP-Reporter-Mauslinie, um die Sekretion von adipozytenabgeleiteten extrazellulären Vesikeln (EVs) zu visualisieren und zu quantifizieren und deren Aufnahme durch Vorläuferzellen zu demonstrieren, wodurch ein parakriner Weg im Fettgewebe sichtbar wird.

Zusammenfassung

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Adipozyten werden zunehmend als aktive endokrine Zellen anerkannt, die erhebliche Mengen an EVs absondern, die in Proteinen, Lipiden und Nukleinsäuren angereichert sind. Die Mechanismen, die die EV-Sekretion und die Dynamik der EV-Freisetzung in verschiedenen biologischen Kontexten steuern, sind jedoch nicht vollständig verstanden. Um diese Lücke zu schließen, entwickelten wir eine neuartige, adipozytenspezifische CD63-GFP-Reporter-Mauslinie, bei der die Expression von GFP-markierten CD63 durch den Adiponectin-Promotor gesteuert wird, was selektive Markierung und Verfolgung von AdEVs in vivo ermöglicht. Mit diesem Reporter-Modell untersuchten wir die Sekretion von AdEVs und deren Abgabe an APCs im Fettgewebe. Konfokale Bildgebung und Durchflusszytometrie zeigten, dass AdEVs aktiv von APCs aufgenommen werden, was einen zuvor unterschätzten Mechanismus der parakrinen Kommunikation innerhalb der fetten Mikroumgebung hervorhebt.

Zur Ergänzung der in-vivo-Studien wurde ein in-vitro-System eingerichtet, das eine direkte Überwachung der EV-Sekretion aus differenzierten Adipozyten ermöglicht. APCs wurden aus subkutanen weißen Fettgeweben der Reportermäuse isoliert und zur Differenzierung zu reifen Adipozyten induziert. In diesen Zellen wurden CD63-GFP-Signale als diskrete Puncta beobachtet und angereichert an der Plasmamembran, wenn die EV-Sekretion gehemmt wurde, was mit einer Vesikelansammlung bei blockierter Freisetzung übereinstimmt. Unter normalen Wachstumsbedingungen wurden EVs, die in das Kulturmedium absondert wurden, konzentriert und anschließend mittels Größenausschlusschromatographie gereinigt, was nachgelagerte funktionelle und biochemische Analysen ermöglichte.

Diese Plattform kann auf APCs angewendet werden, die aus anderen Fettdepots stammen, wie z. B. weißem und braunem Epiposgewebe, oder indem man sie in depotspezifische Adipozyten differenziert, wodurch Vergleiche der EV-Sekretion zwischen verschiedenen Adipozytentypen ermöglicht werden können.

Gemeinsam führen diese Ansätze ein robustes genetisches Werkzeug und ein komplementäres In-vitro-System ein, um die Dynamik der AdEV-Sekretion und Zielsetzung zu analysieren. Diese Fortschritte werfen ein Licht auf die intra-fette zelluläre Kommunikation und legen die Grundlage für das Verständnis des umfassenderen metabolischen Einflusses von AdEVs auf Gesundheit und Krankheit.

Einleitung

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Fettgewebe wird zunehmend als dynamisches endokrines Organ mit Schlüsselrollen in der Ganzkörperenergie-Homöostase 1,2,3,4,5 anerkannt. Über ihre klassische Funktion als Lipidspeicher hinaus regulieren Adipozyten die systemische Insulinsensitivität, und Störungen der Fettmasse – ob Überschuss oder Mangel – stehen in Verbindung mit Insulinresistenz und metabolischen Erkrankungen 6,7,8,9. Ein vorgeschlagener Mechanismus, der zu dieser regulatorischen Kapazität beiträgt, ist die interzelluläre Kommunikation über ausgeschiedene Faktoren. Während Adipokine als wichtige endokrine Signale aus Fettgewebe 10,11,12,13,14,15,16,17,18 gut etabliert sind, setzen Adipozyten auch eine beträchtliche Anzahl extrazellulärer Vesikel (EVs) frei, membrangebundene Partikel mit Lipiden, Proteinen, Nukleinsäuren und Metaboliten. Ob von Adipozyten ausgeschiedene EVs (AdEVs) wie andere EV-Arten auch Glykane tragen, ist nochunklar. Es wurde nachgewiesen, dass Adipozyten eine wichtige Quelle für EVs sind, da etwa 80 % der zirkulierenden exosomalen MikroRNAs aus Adipozyten in Mausmodellen stammen, wie mit adipozytenspezifischen Dicer-Knockout-Mäusen unter Ausgangsbedingungen25 demonstriert wurde. Die Rolle von AdEVs bei Stoffwechsel, Entzündung, Insulinsensitivität und Adipogenese wurde berichtet, ist aber noch unvollständig verstanden(26,27,28,29). Weitere potenzielle Funktionen, insbesondere bei der Vermittlung von Übersprechen mit anderen Zelltypen und Organen, sind noch weitgehend unbekannt. Die Häufigkeitvon 26 EVs legt nahe, dass sie wichtige Rollen sowohl in der lokalen als auch in der systemischen Signalübertragung spielen könnten, doch die biologische Bedeutung und Wirkmechanismen von AdEVs sind weitgehend unerforscht. Diese Wissenslücke unterstreicht die Notwendigkeit robuster und spezialisierter Methoden zur Untersuchung der AdEV-Sekretion und -Funktion.

Um diese Lücke zu schließen, erzeugten wir adipozytenspezifische CD63-GFP-Mäuse (AdipCD63-GFP), indem wir Adiponectin-Cre-Mäuse mit Stopfl/fl/CD63-GFP-Mäusen (Stamm#:036865, JAX) kreuzten. Stopfl/fl/CD63-GFP-Wurfgeschwister, die CD63-GFP in Abwesenheit von Cre nicht ausdrückten, wurden als Kontrolle verwendet. Der CD63-GFP-Reporterstamm wurde erfolgreich eingesetzt, um zelltypspezifische EVs in vivo nachzuverfolgen, einschließlich endothelialer und neuronal-abgeleiteter EVs30,31. Da Adiponektin nur in reifen Adipozyten und nicht in Adipozyten-Vorläuferzellen (APCs) exprimiert wird und CD63 ein Marker für EVs34 ist, können die im Kreislauf und im Gewebe nachgewiesenen GFP+-EVs speziell als AdEVs identifiziert werden. Daher werden in dieser Studie GFP+-EVs, die in APCs nachgewiesen wurden, als AdEVs interpretiert, die von diesen Vorläuferzellen aufgenommen wurden. Dieses Reporter-System ermöglicht eine direkte Überwachung der Vesikelfreisetzung und potenzieller Zielinteraktionen in vivo und in vitro und ermöglicht so die Untersuchung von AdEVs in anderen Zelltypen von Fettgewebe. Wichtig ist, dass AdEVs im Vergleich zu EVs anderer Zelltypen besonders fettreich sind, was sie auftriebskräftiger, zerbrechlicher und schwieriger macht, mit traditionellen Ultrazentrifugationsmethodenwiederherzustellen. Hohe Zentrifugalkräfte können diese Vesikel beschädigen oder zu erheblichem Probenverlust und Kontamination führen, was die nachgelagerte Analyse erschwert. Um diese Einschränkungen zu überwinden, haben wir einen Arbeitsablauf optimiert, der mehrere Zentrifugationsschritte mit niedriger Geschwindigkeit mit Größenausschlusschromatographie kombiniert, was die Scherspannung minimiert, die Integrität der Vesikel erhält und Reinheit sowie Ertrag verbessert, was eine genaue Quantifizierung und Funktionsstudien ermöglicht. Zusammen bieten das CD63-GFP-System und diese optimierte Isolationspipeline einen zugänglichen und reproduzierbaren Ansatz zur Untersuchung der AdEV-Sekretion und -Funktion im Fettgewebe-Crosstalk und der systemischen Stoffwechselregulation.

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Protokoll

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Gemäß den Tierpflege- und Nutzungsrichtlinien des Albert Einstein College of Medicine wurden männliche Mäuse bei 22 °C mit 30–70 % relativer Luftfeuchtigkeit in einem 12-Stunden-Licht/12-Stunden-Dunkelzyklus untergebracht, erhielten ad libitum Zugang zu Nahrung und Wasser und wurden auf einem C57BL/6J-Hintergrund gehalten.

1. In-vivo-Erkennung von abgesonderten AdEVs durch Aufnahme durch APCs

  1. Puffervorbereitung
    1. Verdauungspuffer: Bereiten Sie HEPES-gepuffertes DMEM vor, indem Sie 0,5 ml 1 M HEPES und 0,5 g fettsäurearmes Rinderserumalbumin (BSA) zu 50 mL DMEM hinzufügen. Mischen Sie, bis es sich aufgelöst hat.
    2. Waschpuffer: Bereite PBS mit 2,5 mM Ethylendiaminetetraessigsäure (EDTA) und 4% fetalem Rinderserum (FBS) vor.
    3. Bereite Liberase- und DNase-1-Fond mit 5 mg/mL und 5 KU/mL vor. Lagern Sie bei -20 °C. Tauen Sie sofort vor der Anwendung auf.
  2. Sammlung und Verdauung von inguinalem Fettgewebe
    HINWEIS: Vier Monate alte AdipCD63-GFP- und CD63-GFP-Kontrollmäuse wurden mittels Kohlendioxidinhalation eingeschläfert.
    1. Fettgewebe wird mit steriler Technik entfernt und 1 g Gewebe in 0,5 ml Verdauungspuffer gegeben und das Gewebe mit steriler Schere fein in Stücke von höchstens 1 mm gehackt.
    2. Das gehackte Gewebe in 10 ml verdauten Puffer suspendieren, der 0,5 mg/mL Liberase und 50 U/mL DNase 1 enthält.
    3. Inkubieren Sie bei 37 °C auf einem Orbitalshaker (100 U/min) für 30–60 Minuten. Mischen Sie das Gewebe vorsichtig, indem Sie den Tubus während der Inkubation mehrmals umkehren. Wenn die Lösung trüb erscheint und keine sichtbaren Gewebefragmente mehr übrig sind, gilt die Verdauung als abgeschlossen.
  3. Isolierung von APCs
    1. Verdünnen Sie die Suspension mit zwei Volumen des Verdauungspuffers und wenden Sie das Rohr vorsichtig 3-4 Mal um.
    2. Führen Sie einen sterilen 100-μm-Filter durch, um unverdautes Gewebe zu entfernen.
    3. Zentrifugiere das Filtrat bei 300 × g für 5 Minuten bei 4 °C.
    4. Entsorge den überlagernden Adipozytenteil und kennze das Pellet als stromale Gefäßfraktion (SVF).
    5. Bereiten Sie frischen 1× roten Blutkörperchen (RBC) Lysepuffer mit sterilem Wasser vor. Lyseere die roten Blutkörperchen im SVF, indem du 5 Minuten auf Eis inkubierst, geschützt vor Licht.
    6. Geben Sie zwei Bände Waschpuffer hinzu und zentrifugieren Sie dann das Filtrat mit 400 × g für 5 Minuten bei 4 °C.
    7. Folgen Sie dem Protokoll des Fettgewebe-Progenitor-Isolationskits (Maus) und suspendieren Sie die SVF in 80 μL Puffer (PBS, pH 7,2, 0,5 % BSA, 2 mM EDTA) pro Gramm Gewebe.
    8. Fügen Sie pro Gramm Gewebe 20 μL Nicht-Adipozyten-Progenitor-Depletionscocktail hinzu.
    9. Rühren und 15 Minuten bei 2-8 °C im Dunkeln inkubieren.
    10. Führen Sie die Probe durch die LS-Säule und sammeln Sie den Durchfluss.
    11. Zentrifugiere den Durchfluss (negativ für CD31, CD45, Ter119) bei 300 × g für 5 Minuten bei 4 °C, um die APCs für die Studie zu erhalten.
  4. Nachweis von absonderten AdEVs durch APC-Aufnahme mittels konfokaler Mikroskopie
    1. Same 250 μL isolierter APCs (1 × 104 Zellen/mL) von AdipCD63-GFP- oder CD63-GFP-Mäusen auf kollagenbeschichtete 8-Well-Kammerobjektträger und ermöglichen es den Zellen, sich etwa 6 Stunden lang anzuheften.
    2. Fixieren Sie die Zellen mit 4 % Paraformaldehyd für 10 Minuten, um zelluläre und EV-Strukturen für die Bildgebung zu erhalten.
      HINWEIS: In diesen Tests markieren GFP-Signale AdEVs, und ihr Nachweis in APCs mittels Konfokalmikroskopie zeigt eine Aufnahme von AdEVs durch diese Vorläuferzellen.
    3. Reinigen Sie die Objektträger dreimal mit PBS, montieren Sie sie mit Antifade-Medium und erfassen Sie GFP-Signale mit einem Konfokalmikroskop mit einem 63× Ölimmersionsobjektiv. Aufnahme von Bildern als Z-Serien-Stacks mit einer Schrittlänge von 0,5 μm, wobei ein 488-nm-Laser zur GFP-Anregung und zur Erkennung von Emissionen bei 500–550 nm verwendet wird.
  5. Detektion sezerner AdEVs durch APC-Aufnahme durch Durchflusszytometrie
    1. Zähle APCs und verdünne den Viabilitätsfarbstoff (z. B. Zombie) 1:1000 in 1X PBS. Zellen bei 1 × 106 pro 100 μL suspendieren. 20 Minuten auf Eis inkubieren, vor Licht geschützt.
    2. Wasche die Zellen einmal mit einem Waschpuffer. Zentrifugiere bei 300 × g für 5 Minuten bei 4 °C.
    3. Zellen in einem brillanten Färbepuffer mit 1 × 106 Zellen pro 100 μL suspendieren.
    4. Blocke die unspezifische Bindung mit einem Fc-Rezeptor-Blockierungsreagenz (z. B. Anti-CD16/CD32) 1:100 Minuten auf Eis.
    5. Pre-Spin-Sca-1-Antikörper bei 6.000 × g für 10 Minuten bei 4 °C. Dann gib 1 μL des Sca-1-Antikörpers in die APC-Tube und inkubiere 20 Minuten auf Eis, wobei das Rohr mit Folie bedeckt bleibt.
    6. Waschen Sie zweimal mit 1 ml Waschpuffer, zentrifugieren Sie bei 300 × g für 5 Minuten bei 4 °C.
    7. Cellen im Waschpuffer mit etwa 1 × 106 Zellen pro 500 μL suspendieren, um die Durchflusszytometrie zu sortieren. Daten für Sca1+- und GFP+- Zellen werden auf einem spektralen Flusszytometer erfasst, das mit einem 405 nm violetten Laser (450/50 nm Filter für Pacific Blue) und einem 488 nm blauen Laser (530/30 nm Filter für GFP) ausgestattet ist. Analysieren Sie die Proben mit der laufenden Software des Instruments, wobei Sca1+- Zellen gesperrt sind und die GFP+- Teilmenge innerhalb dieser Population analysiert wird, wie in Abbildung 2 dargestellt.

2. Nachweis und Analyse der sekretierten AdEVs in vitro

  1. Differenzierung von APCs in reife Adipozyten
    HINWEIS: Alle Kulturen werden bei 37 °C gehalten, 8 % CO2, sofern nicht anders angegeben.
    1. Tag 0: Schichten mit 0,2 % Gelatine für 30 Minuten bei Zimmertemperatur (RT), aspiratiert und frisch isolierte APCs in DMEM/F12 + 15 % FBS + 1 % Penicillin/Streptomycin (P/S) + 0,1 % Primocin beschichtet, um vor der Differenzierung eine 100 % Konfluenz zu erreichen.
    2. Tag 1-8: Ersetzen durch MesenCult adipogenes Differenzierungsmedium (insgesamt 50 mL: 45 mL Base + 5 mL Supplement + 0,5 mL GlutaMAX + 50 μL Primocin), Wechsel zu einem frischen Differenzierungsmedium am Tag 4.
    3. Tag 9: Adipozyten zweimal mit PBS waschen, dann durch ausgereiftes Adipozytenkulturmedium (DMEM +1 % BSA + 0,2 % Primocin) ersetzen und 16 Stunden aufrechterhalten.
  2. AdEV-Isolierung und -Reinigung
    1. Führen Sie eine oben erzeugte Adipozytenkultur von 15 ml durch einen 40 μm-Filter und dann einen 30-μm-Filter.
    2. Zentrifugiere das Filtrat bei 500 × g für 5 Minuten, dann 2.000 g × g für 10 Minuten, um Restzellen und Ablagerungen zu entfernen.
    3. Führen Sie das Filtrat durch einen 0,8 μm-Filter und konzentrieren Sie das Medium dann von 15 mL auf 0,5 mL mit einer 100 kDa Cutoff-Ultrafiltrationseinheit (15 mL Probenvolumen) durch Zentrifugierung bei 4.000 × g für 15 Minuten.
    4. Laden Sie die Probe mit einem automatischen Fraktionskollektor auf Größenausschlusschromatographie (SEC) und sammeln Sie die Fraktionen F1-8.
    5. Konzentrieren Sie die gesammelten EV-Fraktionen mit einer 100-kDa-Cutoff-Ultrafiltrationseinheit (4 mL Probenvolumen) und führen Sie die Überprüfung des EV-Gehalts jeder Fraktion mittels Western Blot, Nanopartikel-Tracking-Analyseinstrument und Transmissionselektronenmikroskopie (TEM).
  3. AdEV-Validierung, Quantifizierung und Größe/Morphologie-Bewertung
    1. Western-Blot-Analyse von EV-Markern
      1. Jede Fraktion wird von 400 μL bis 25 μL konzentriert und dann 50 μL Puffer des Radioimmunpräzipitationstests (RIPA) hinzugefügt, ergänzt mit Protease- und Phosphataseinhibitoren. Denaturieren Sie die Proben, indem Sie 2× Natriumdodecylsulfat (SDS) Ladepuffer hinzufügen und Proteine auf einem 4–12%igen Trisglycin-Gel auflösen.
    2. Analyse der Größe, Konzentration und Qualität von Elektrofahrzeugen mit einem Nanopartikel-Tracking-Analyseinstrument.
      1. Vor der Analyse werden die EV-Proben mit sterilem, 0,1 μm gefiltertem PBS im Verhältnis 1:1000 verdünnt, um sicherzustellen, dass die Partikelkonzentration im optimalen Detektionsbereich liegt (etwa 107–109 Partikel /ml). Mischen Sie die verdünnten Proben vorsichtig, um Blasenbildung zu vermeiden.
      2. Laden Sie die Probe in das Instrument, das mit einer hochempfindlichen wissenschaftlichen komplementären Metalloxid-Halbleiterkamera (sCMOS), einem 532-nm-grünen Lasermodul und einer Detektionsschwelle von 10 nm (bis zu 1.000 nm)/106bis 109Partikeln /mL ausgestattet ist.
      3. Führen Sie Bildgebung und Quantifizierung mit der NS Xplorer-Softwaresuite durch, die einen dynamischen, auf Beobachtungsvolumen basierenden Konzentrationsalgorithmus anwendet.
    3. Untersuchung der EV-Morphologie mittels Transmissionselektronenmikroskopie (TEM)
      1. Geben Sie 50 μL EVs, die vor der Konzentration gesammelt wurden, an die Kernanlage zur negativen Färbung der EVs ein. Wenden Sie Elektrofahrzeuge auf Carbon-Only-Kupfergitter mit 400 Mesh an, die mit einem Plasmareiniger plasmagereinigt wurden.
      2. Nach kurzer Adsorption spülen Sie die Gitter mit destilliertem Wasser, färben Sie negativ mit 1% (mit W/V) Uranylacetat und entfernen Sie den überschüssigen Fleck mit Filterpapier vor dem Lufttrocknen. Anschließend werden die Gitter mit einem Transmissionselektronenmikroskop abgebildet, das mit 120 kV betrieben wird.

3. Sicherheits- und Abfallinformationen

  1. Behandle Paraformaldehyd und Uranylacetat in einer Abzugshaube mit persönlicher Schutzausrüstung (PSA), da beide giftig sind. Sammeln Sie Uranylacetat-Abfälle in gekennzeichneten gefährlichen Behältern.
  2. Behandeln Sie alle biologischen Proben als potenziell ansteckend und entsorgen Sie Materialien gemäß institutionellen Biosicherheitsrichtlinien und -protokollen, die vom Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) genehmigt wurden.

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Ergebnisse

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Mit diesem Protokoll zur AdEV-Erkennung durch APC-Aufnahme mittels Konfokalmikroskopie isolierten wir APCs aus den inguinalen Fettgeweben von AdipCD63-GFP und Stopfl/fl/CD63-GFP-Mäusen und färbten sie mit DAPI zur Visualisierung der Kerne. Bei der Untersuchung durch eine konfokale Mikroskopie zeigten APCs von Stopfl/fl/CD63-GFP-Mäusen keine nachweisbaren GFP-Puncta (Abbildung 1A). Im Gegensatz dazu wiesen APCs, die von AdipCD63-GFP-Mäusen isoliert wurden, zahlreiche unt...

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Diskussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Das beschriebene Protokoll schließt eine wichtige methodologische Lücke, indem es ein robustes und reproduzierbares System bereitstellt, um AdEVs und deren Aufnahme durch APCs zu isolieren und zu charakterisieren. Im Vergleich zu EVs aus anderen Quellen sind AdEVs lipidreicher und auftriebsfähiger, was die klassischen ultrazentrifugationsbasierten EV-Isolationstechnikenweniger effizient macht. Die meisten veröffentlichten Protokolle zur AdEV-Reinigung basieren jed...

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Offenlegungen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Die Autoren haben kein finanzielles Interesse anzugeben.

Danksagungen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wir danken dem Einstein Flow Cytometry Core für FACS und der Analytical Imaging Facility für die gesamte Bildanalyse. Diese Arbeit wurde teilweise durch Fördermittel des National Institutes of Health DK128839 und durch NCI-Krebszentrum-Unterstützungszuschüsse P30CA013330.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
0,5 M EDTA, pH 8,0FisherAM9260G500-fache Verdünnung
10x PBSFisher Scientific70-013-0321000-fache Verdünnung mit Wasser
1 M HEPESGibco156300801000-fache Verdünnung
Fettgewebe-Vorläufer-Isolationsset, MausMiltenyi Biotec30-106-639Gebrauchsfertig
Amicon Ultra-Zentrifugalfilter, 100 kDa MWCOSigmaUFC910015 mL Abtastvolumen
Amicon Ultra-Zentrifugalfilter, 100 kDa MWCOSigmaUFC91004 mL Abtastvolumen
BSASigmaA6003Gebrauchsfertig
Calnexin-AntikörperCalnexinab225951000-fache Verdünnung
CD63-Antikörperabcamab217345500-fache Verdünnung
CD81Zellsignaltechnik10037er500-fache Verdünnung
Corning  BioCoat  Kollagen-I-KulturfolieSigmaCLS354630Gebrauchsfertig
Corning  ZellsiebSigmaCLS43175040 μ m Porengröße
Corning  ZellsiebSigmaCLS431752100 & mu; m Porengröße
COX IV AntikörperZell-Signaltechnik48441000-fache Verdünnung
DMEMGibco11965092Gebrauchsfertig
DMEM/F-12, GlutaMAX-SupplementThermofisher10565018Gebrauchsfertig
Dnase 1SigmaD4513Serienmäßig 5 KU/mL bei -20 °F & Grad; C
GlutaMAX-ErgänzungsmittelGibco35050061100-fache Verdünnung
Halt™ Protease- und Phosphataseinhibitor-Cocktail (100X)Thermofisher78444Gebrauchsfertig
HSP70-Antikörperabcamab1816061000-fache Verdünnung
Invitrogen eBioscience 10X RBC-Lysepuffer (Multi-Species)Fisher Scientific50-112-974310-fache Verdünnung im Wasser
Izon Science Usa Ltd QEVORIGINAL 70NMGEN2 5/PK SDPFisher ScientificNC2042225Gebrauchsfertig
LEICA STELLARIS 8 KonfokalmikroskopLeica-MikroskopeN/A
Liberase TM ForschungsbewertungSigmaLIBTM-ROLagere 5 mg/mL bei -20 °C; C
Millex MCE-SpritzenfilterSigmaSLAA0250,8 μ m Porengröße
NanoSight ProMalvern PanalyticalN/A
Novex Tris-Glycin Mini Protein Gels, 4– 12%,ThermofisherXP04120BOXGebrauchsfertig
Novex Tris-Glycin SDS Probenpuffer (2x)ThermofisherLC2676Gebrauchsfertig
Pazifikblauer Anti-Maus-Antikörper Ly-6A/E (Sca-1)BioLegend10811925-fache Verdünnung
Paraformaldehydlösung (16 %)Fisher Scientific50-980-487mit PBS auf 4 % verdünnen
pluriStrainer S / 30 µ m (Zell-Sieb)Fisher ScientificNC092245930 μ m Porengröße
Ponceau-S-LösungSigmaP7170-1LGebrauchsfertig
PrimocinInvivogenNC9141851500-fache Verdünnung
ProLong-Gold-Antifade-Reagenz mit DAPIZell-Signaltechnik8961SGebrauchsfertig
Gereinigter Antimaus-Antikörper CD16/32BioLegend101301100-fache Verdünnung
RIPA buffer Fisher ScientificPI8990010-fache Verdünnung im Wasser
Spektrales Flusszytometer (Aurora 3)Cytek BiosciencesN/A
Syntaxin-4-AntikörperSynaptische Systeme1100425000-fache Verdünnung
Tecnai 20 (Transmissionselektronenmikroskop)FEIN/A
Tergeo-EMPIE Scientific LLCN/A
Vinculin-Antikörperabcamab185085000-fache Verdünnung

Referenzen

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