Forschungsartikel

Lange, nicht-kodierende RNA IRAIN treibt die immunmetabolische Umprogrammierung im Gliom über die IGF1R-JAK-STAT-BIRC5-Achse an

327 Ansichten

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DOI:

10.3791/69711

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12. Dezember 2025

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Neurosurgery, Zhangzhou Municipal Hospital of Fujian Province and Zhangzhou Affiliated Hospital of Fujian Medical University, 2The School of Clinical Medicine, Fujian Medical University, Zhangzhou Affiliated Hospital of Fujian Medical University

* These authors contributed equally

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Mit integriertem maschinellem Lernen über mehrere Kohorten hinweg haben wir eine robuste IMRG-Prognosesignatur für das Gliom aufgebaut. IRAIN ist deutlich herunterreguliert, umgekehrt mit Grad und Überleben verknüpft und unterdrückt die Signalübertragung von IGF1R-JAK2-STAT3-BIRC5, bremst Proliferation, Migration und Angiogenese. Die Ergebnisse nennen IRAIN und IMRGs als Biomarker und therapeutische Ziele.

Zusammenfassung

Gliom ist ein aggressives Malignum mit begrenzten therapeutischen Möglichkeiten und einer schlechten Prognose. Ihr Verlauf ist eng mit der metabolischen Umprogrammierung und der Immunumgehung verbunden, was die Notwendigkeit unterstreicht, molekulare Regulatoren zu identifizieren, die diese Prozesse integrieren. Hier etablierten wir eine robuste, immunmetabolisch bezogene Gensignatur (IMRG) und erläuterten die Rolle der langen nicht-kodierenden RNA IRAIN bei der Regulation des Gliom-Immunstoffwechsels über die IGF1R-JAK-STAT-BIRC5-Achse. Transkriptomische und klinische Daten der TCGA-, CGGA- (693/325) und GEO-Kohorten (GSE43378) wurden analysiert. Die Analyse des Netzwerks für differentielle Expression und gewichtete Gen-Koexpressionsnetzwerke (β = 8) sicherte eine skalenfreie Topologie, und ein Leave-One-Out-Kreuzvalidierungsrahmen, der zehn maschinelle Lernalgorithmen kombinierte, ergab 101 prognostische Modelle. Die optimale 17-Gen-IMRG-Signatur wurde über alle Kohorten hinweg validiert und sagte unabhängig das Gesamtüberleben vorher. Funktionelle Assays zeigten, dass die IRAIN-Überexpression IGF1R hemmte, die Phosphorylierung von JAK2/STAT3 unterdrückte und BIRC5 herunterregulierte, wodurch die Apoptose gefördert und die Angiogenese reduziert wurde. Eine niedrige IRAIN-Expression korrelierte mit immunsuppressiven Tregs- und M2-Makrophagen sowie mit erhöhten Tumor-Mikro-Environment-Scores, was auf einen immunausweichenden Phänotyp hindeutet. Diese Ergebnisse belegen IRAIN als wichtigen Regulator der immunometabolischen Umprogrammierung des Glioms und validieren die IMRG-Signatur als zuverlässiges prognostisches Werkzeug, wobei sie den IRAIN-IGF1R-JAK-STAT-BIRC5-Weg als mechanistische Brücke hervorheben, die Immun- und Stoffwechseldysregulation im Gliom verbindet und potenzielle Ziele für die Präzisionstherapie bietet.

Einleitung

Gliom stellt die häufigste primäre Malignität des zentralen Nervensystems dar und gehört trotz Fortschritten in der Neurochirurgie, Strahlentherapie und Chemotherapie zu den tödlichsten menschlichen Krebsarten. Hochgradige Gliome, insbesondere Glioblastoma multiforme (GBM), zeichnen sich durch schnelle Proliferation, diffuse Infiltration und unvermeidliches Rezidiv 1,2 aus. Kürzlich sind eine Reihe wirksamer therapeutischer Ansätze entstanden, wie chirurgische Eingriffe, Immuntherapie und Chemothermie3. Das mediane Überleben bleibt bei etwa 14 bis 18 Monaten, selbst bei maximaler Therapie, was die Notwendigkeit neuartiger therapeutischer Strategien und prognostischer Biomarker unterstreicht4.

Das Zusammenspiel zwischen der Tumormikroumgebung (TME) und den Krebszellen treibt maßgeblich das aggressive Wachstum und die molekulare Heterogenität von Gliomen maßgeblich an. Zahlreiche Immunbestandteile, darunter Mikroglia, neuronale Vorläuferzellen, Gefäßzellen und adaptive Immunzellen, sind maßgeblich an der Gestaltung des TME 5,6,7 beteiligt. In den letzten Jahren gab es bemerkenswerte Fortschritte in der Immuntherapie, die eine transformative Ära in der Onkologie einläuteten. Dennoch haben die Immuncheckpoint-Blockade (ICB) und andere immuntherapeutische Ansätze nur begrenzten Erfolg bei Gliom8 gezeigt. Das Scheitern der Immuntherapie in diesem Zusammenhang resultiert aus mehreren intrinsischen Merkmalen des Gliom-Mikroumfelds – nämlich geringer Tumormutationslast, ausgeprägter intratumoraler Heterogenität, geringer Durchlässigkeit der Blut-Hirn-Schranke, Herunterregulierung wichtiger Histokompatibilitätskomplexe und spärlicher T-Zell-Infiltration 9,10,11,12.

Zunehmende Belege deuten darauf hin, dass das Tumormikroumfeld (TME), das metabolische Dysfunktionen aufweist, durch saure Zustände, Nährstoffmangel und die Ansammlung von Metaboliten gekennzeichnet ist, die die Immunreaktionen unterdrücken. Diese Erkrankung führt anschließend zu einer Funktionsstörung von Immunzellen, die in die Tumore eindringen, und verringert die Wirksamkeit derImmuntherapie. Gleichzeitig durchlaufen Immunzellen innerhalb des TME kontextabhängige Stoffwechselverschiebungen, die ihre Differenzierung und Effektorfunktionen bestimmen. Beispielsweise sind aktivierte T-Zellen für eine schnelle Vermehrung auf Glykolyse angewiesen, während regulatorische T-Zellen (Tregs) und tumorassoziierte Makrophagen (TAMs), insbesondere der M2-Subtyp, auf oxidative Phosphorylierung und Fettsäurestoffwechsel angewiesen sind, um ihre immunsuppressive Aktivitätaufrechtzuerhalten.

Daher bietet die Integration von Immun- und Stoffwechselsignaturen einen rationalen Rahmen, um Gliome besser zu klassifizieren und die Patientenprognose vorherzusagen. Lange nichtkodierende RNAs (lncRNAs) haben sich kürzlich als vielseitige Regulatoren der Chromatinarchitektur, der Gentranskription und der posttranskriptionellen Modifikation etabliert. Mehrere lncRNAs wurden mit der Pathogenese des Glioms in Verbindung gebracht und beeinflussen Proliferation, Invasion und Immunmodulation16. Dazu gehört das prägte Antisense-Transkript IRAIN (IGF1R-Antisense-imprinte, nicht-proteinkodierende RNA) hat für seine Rolle bei der Regulierung des insulinähnlichen Wachstumsfaktor-1-Rezeptors (IGF1R)-Gens durch cis-wirkende Chromatin-Interaktionen Aufmerksamkeit erregt, was nachweislich eine Downregulation und eine verringerte Kontrolle der cis-Konkurrenz erwiesen hat, insbesondere in Krebszellen wie Brustkrebs- und Leukämiezelllinien. Kehlkopfkrebs und akute myeloide Leukämie, die direkt zur Hochregulierung von IGF1R 17,18,19 führt. Da die IGF1R-Signalübertragung nachgeschaltete JAK-STAT- und PI3K-AKT-Signalwege aktiviert – beide zentral für Tumorwachstum und Immunregulation20,21 – können Veränderungen in der IRAIN-Expression den Tumor-Immunstoffwechsel kritisch beeinflussen. Die Rolle von IRAIN beim Gliom und seine potenzielle Wirkung auf die immunmetabolische Landschaft sind jedoch bisher nicht aufgeklärt. Die Schließung dieser Wissenslücke könnte mechanistische Einblicke darin liefern, wie nicht-kodierende RNAs die metabolische Anpassung und Immunausweichung im Gliom koordinieren.

In dieser Studie kombinierten wir multikohorten-transkriptomische Daten mit experimenteller Validierung, um die immunmetabolische Regulation im Gliom zu erforschen. Mit integrierten Machine-Learning-Frameworks in den TCGA-, CGGA- (693/325) und GEO-(GSE43378)-Kohorten identifizierten wir eine robuste 17-Gen-Prognosesignatur mit immunmetabolisch-bezogenem Gen (IMRG), die in der Lage ist, das Überleben von Patienten über Datensätze hinweg zu stratifizieren. Anschließend konzentrierten wir uns auf IRAIN als potenziellen Upstream-Regulator dieses Netzwerks, angesichts seiner prognostizierten Wechselwirkung mit der IGF1R-JAK-STAT-Signalachse. Funktionelle Tests zeigten, dass die IRAIN-Überexpression die Proliferation und Angiogenese des Glioms unterdrückt, indem sie die IGF1R-Expression hemmt und die nachgelagerte STAT3-Phosphorylierung hemmt, was zu einer reduzierten Expression des anti-apoptotischen Proteins BIRC5 (auch bekannt als Survivin) führt. Zusammen unterstützen diese Ergebnisse ein funktionierendes Modell, in dem IRAIN als mechanistische Brücke fungiert, die Immunregulation und metabolische Umprogrammierung im Gliom verbindet. Wir vermuten, dass dysregulierte IRAIN-Expression das Tumorprogression fördert, indem sie dieses Gleichgewicht stört, wodurch ein immunsuppressives Mikroumfeld entsteht und Therapieresistenz entsteht.

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Protokoll

Alle Verfahren mit menschlichem Gewebe entsprachen den institutionellen Richtlinien und der Erklärung von Helsinki und wurden vom Institutional Review Board der Fujian Medical University genehmigt (Genehmigungsnr. 2021KYB089). Vor der Gewebebeschaffung wurde von allen Teilnehmern eine schriftliche informierte Zustimmung eingeholt.

Genexpression und Überlebensanalyse
RNA-Sequenzierungsdaten und entsprechende klinische Informationen wurden aus mehreren öffentlichen Datenbanken bezogen. 1) TCGA-Kohorte: RNA-seq (FPKM)-Daten für 175 Glioblastom-Multiforme- (GBM)- und 534 Low-Grade-Gliom-(LGG)-Proben wurden aus dem Cancer Genome Atlas (https://portal.gdc.cancer.gov/) heruntergeladen; 2) Normale Kontrollgruppen: Expressionsprofile von 211 normalen Hirngeweben und 662 Gliomgeweben wurden aus der UCSC Xena-Datenbank heruntergeladen (https://xenabrowser.net/datapages/); 3) Externe Validierung: Daten aus CGGA693 und CGGA325 Kohorten wurden aus dem Chinese Glioma Genome Atlas (http://www.cgga.org.cn) gewonnen; 4) GEO-Datensatz: Der GSE43378-Datensatz, der Expressions- und klinische Daten für 50 Gliomproben enthält, wurde aus dem Gene Expression Omnibus (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/) heruntergeladen. Alle Rohzähldaten wurden in Transkripte pro Million (TPM) umgewandelt und log2 transformiert. Für bereits normalisierte Datensätze wurden Expressionsmatrizen untersucht, um vergleichbare Verteilungen sicherzustellen. Gene mit TPM-Werten < 1 von mehr als 80 % der Proben wurden ausgeschlossen. Fehlende klinische Informationen (Alter, IDH-Status, 1p/19q-Codeletion, MGMT-Methylierung) wurden mittels vollständiger Fall-Filterung entfernt. Batch-Effekte in Datensätzen wurden mit dem ComBat-Algorithmus angepasst, der im R-Paket sva implementiert wurde. Die Ausdruckswerte wurden durch die Z-Score-Transformation innerhalb jedes Datensatzes standardisiert. Überlebensanalysen wurden mit den R-Paketen survival und survminer durchgeführt. Die Patienten wurden entsprechend dem medianen Expressionsniveau von IRAIN in Hoch- und Niedrigausdrucksgruppen eingeteilt. Kaplan-Meier-Überlebenskurven wurden generiert, und die statistische Signifikanz wurde durch den Log-Rank-Test bewertet. Hazard-Verhältnisse (HRs) und 95%-Konfidenzintervalle (KI) wurden mittels Cox-Proportionalhazard-Regressionsmodellen geschätzt.

Definition von Immun- und Stoffwechselgensets
Immunbezogene Gene (IRGs, n = 2.483) wurden aus der ImmPort-Datenbank (https://www.immport.org/shared/) gewonnen, und metabolisch verwandte Gene (MRGs, n = 948) wurden aus der Molecular Signatures Database (MSigDB, https://www.gsea-msigdb.org/) gewonnen. Der kombinierte Satz dieser Gene wurde als immunmetabolisch verwandte Gene (IMRGs) definiert. Diese Genlisten dienten als Referenzen für nachfolgende differentielle Expressions- und Netzwerkanalysen.

Analyse des differentiellen Expressionsnetzwerks und des gewichteten Gen-Koexpressionsnetzwerks
Differenziell exprimierte Gene (DEGs) zwischen normalem Gehirn- und Gliomgewebe wurden mit dem R-Paket-Limma identifiziert. Die Expressionsdaten wurden mit einem linearen Modell ausgestattet, gefolgt von empirischer Bayes-Moderation. Gene mit |log₂ Faltenänderung| > 1,5 und eine False Discovery Rate (FDR) < 0,05 wurden als signifikant unterschiedlich ausgedrückt angesehen. Die Analyse des gewichteten Gen-Koexpressionsnetzwerks (WGCNA) wurde mit dem R-Paket WGCNA durchgeführt. Ausreißerstichproben wurden durch hierarchische Clusterung ausgeschlossen. Die Soft-Thresholding-Potenz wurde auf β = 8 gesetzt, um einen skalenfreien Topologie-Fit-Index (R2 ≥ 0,85) zu erreichen, während eine ausreichende mittlere Konnektivität erhalten bleibt. Topologische Überlappungsmatrizen (TOM) wurden konstruiert, und Gene wurden mithilfe des dynamischen Baumschnitt-Algorithmus in Module mit einer Mindestgröße von 50 Modulen gruppiert. Die Eigengene des Moduls korrelierten mit klinischen Merkmalen, und das am stärksten mit Gliom assoziierte Modul (Pearsons r > 0,7, P < 1×10-10) wurde für die Hubgen-Identifikation ausgewählt.

Maschinell-Learning-basierte prognostische Modellkonstruktion
Ein umfassendes Leave-One-out Cross-Validation (LOOCV)-Framework, das zehn maschinelle Lernalgorithmen integriert, wurde angewandt, um prognostische Modelle zu erstellen und zu evaluieren. Insgesamt wurden 101 kombinatorische Workflows unter Verwendung der TCGA-Kohorte als Trainingsdatensatz implementiert. Prognosassoziierte immunmetabolisch bezogene Gene (IMRGs) wurden erstmals durch eine univariate Cox-Regression (P < 0,05) identifiziert. Das optimale Modell wurde ermittelt, indem der mittlere Harrell-Konkordanzindex (C-Index) über drei Validierungsdatensätze (CGGA693, CGGA325 und GSE43378) maximiert wurde. Das daraus resultierende RSF-Enet-Modell (α = 0,3) zeigte die höchste prädiktive Leistung und bewahrte eine robuste Generalisierbarkeit über unabhängige Kohortenhinweg 22.

TME und Immuninfiltration
Um die immunogenomische Landschaft umfassend zu charakterisieren, haben wir einen mehrstufigen analytischen Ansatz angewandt. Zunächst wurden die Immun- und Strominfiltrationsniveaus mit dem ESTIMATE-Algorithmus23 quantifiziert. Die differenzielle Expression wichtiger Immunkontrollpunktmoleküle, darunter PDCD1, CTLA4 und LAG3, wurde anschließend mittels Limma-basierter Analyse bewertet, und die Korrelationen zwischen Kontrollpunktgenen wurden mithilfe von Korrelationsmatrizen visualisiert. Somatische Mutationsprofile aus 903 Gliomproben der TCGA-Kohorte wurden verwendet, um Tumormutationslast (TMB), Mikrosatelliteninstabilität (MSI) sowie Tumor-Immunfunktionsstörungen und -ausschlusswerte (TIDE) zu berechnen, um potenzielle Reaktionen auf Immuntherapie vorherzusagen. Die Patienten wurden anschließend in vier prognostische Gruppen nach kombiniertem TMB-Status (hoch/niedrig) und Risikowerten (hoch/niedrig) eingeteilt, und die Überlebensergebnisse wurden mittels der Kaplan-Meier-Analyse verglichen.

Funktionale Anreicherungsanalyse
Gene Ontology (GO) und Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG) Signalweganreicherungsanalysen wurden mit dem R-Paket clusterProfiler durchgeführt. Anreicherungsergebnisse mit bereinigten P-Werten < 0,05 wurden als statistisch signifikant angesehen. Überrepräsentierte biologische Prozesse, zelluläre Komponenten und molekulare Funktionen wurden mithilfe von Punktdiagrammen und Balkendiagrammen visualisiert. Protein-Protein-Interaktionsnetzwerke (PPI) wurden mit der STRING-Datenbank (≥ 0.4) konstruiert und in Cytoscape visualisiert. Funktionale Module innerhalb des PPI-Netzwerks wurden mithilfe des MCODE-Algorithmus identifiziert. Gen-Gen-Interaktions- und Koexpressionsnetzwerke wurden mit GeneMANIA (https://string-db.org; Konfidenzwert ≥ 0,4) weiter analysiert und in Cytoscape visualisiert. Funktionale Module innerhalb des PPI-Netzwerks wurden mithilfe des MCODE-Algorithmus identifiziert. Gen-Gen-Interaktions- und Koexpressionsnetzwerke wurden mit GeneMANIA (https://genemania.org) weiter analysiert, das Informationen über physische und genetische Interaktionen, gemeinsame Signalwege und Koexpressionsmuster integriert, um potenzielle funktionelle Assoziationen abzuleiten.

Klinische Proben
Frisches Gliomgewebe (n = 6) und gepaarte benachbarte nicht-tumoröse Hirngewebe (n = 6; mindestens 3 cm vom Tumorrand entfernt und histologisch als tumorfrei bestätigt) wurden von Patienten entnommen, die sich einer primären Gliomresektion im Zhangzhou Affiliated Hospital der Fujian Medical University unterzogen. Keiner der Patienten hatte vor der Operation eine Chemo- oder Strahlentherapie erhalten. Alle pathologischen Diagnosen wurden unabhängig von zwei Neuropathologen gemäß der Klassifikation von Tumoren im zentralen Nervensystem der Weltgesundheitsorganisation (WHO) 2021 bestätigt. Unmittelbar nach der chirurgischen Exzision wurden Gewebeproben mit eiskaltem phosphatgepuffertem Kochsalzlösungslösungszustand (PBS) abgespült, um Restblut zu entfernen, in flüssigem Stickstoff (-196 °C) gelassen und bei -80 °C bis zur RNA-Extraktion gelagert.

Zelllinien und Zellkultur
Die humanen Glioblastomzelllinien SHG44, U251, A172 und T98G sowie normale humane Gliazellen (HEB) wurden aus authentifizierten Repositorien gewonnen und vor der Anwendung als frei von Mycoplasma-Kontamination bestätigt. Die Zellen wurden in Dulbeccos Modified Eagle's Medium (DMEM, hoher Blutzucker) mit 10 % fetalem Rinderserum (FBS), 2 mM L-Glutamin und 1 % Penicillin-Streptomycin bei 37 °C in einem befeuchteten Inkubator mit 5 % CO₂ erhalten. Die Zellen wurden alle 4-5 Tage nach 80-90 % Konfluenz durchführt. Um IRAIN-überexpressive und Kontrollzelllinien zu etablieren, wurden Zellen mit lentiviralen Vektoren transduziert, die das vollständige IRAIN-Transkript oder einen leeren Vektor als Kontrollvektor trugen. Stabile Klone wurden 14 Tage lang mit Puromycin (2 μg/mL) ausgewählt. Die Überexpressionseffizienz wurde durch quantitative Reverse-Transkriptions-PCR (qRT-PCR) vor den nachgelagerten Tests bestätigt.

3- (4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-Diphenyltetrazoliumbromid (MTT) Zellproliferationstest
Die Zellen wurden in 96-Well-Platten mit einer Dichte von 1 × 104 Zellen pro Bohrloch in 100 μL vollständigem Kulturmedium ausgesaat. Nach 24, 48 und 72 Stunden nach der Aussaat wurden 20 μL MTT-Lösung (5 mg/ml in phosphatgepufferter Kochsalzlösung) zu jedem Brunnen hinzugefügt und 4 Stunden bei 37 °C inkubiert. Anschließend wurde das Supernatant entfernt, und 150 μL Dimethylsulfoxid (DMSO) wurden hinzugefügt, um die Formazankristalle zu lösen. Der Teller wurde 10 Minuten lang vorsichtig bewegt, um eine vollständige Lösungslösung sicherzustellen. Die Absorption wurde bei 490 nm mit einem Mikroplattenspektrophotometer gemessen. Hintergrundmessungen aus leeren Quellen wurden abgezogen. Die Zelllebensfähigkeit wurde relativ zur 24-Stunden- oder Kontrollgruppe berechnet (gesetzt als 1,0). Alle Experimente wurden mit sechs technischen Replikaten und drei unabhängigen biologischen Replikaten durchgeführt. Die Daten werden als Mittelwert ± Standardabweichung (SD) angegeben, und die statistische Signifikanz wurde mit einem zweiseitigen t-Test bestimmt.

Durchflusszytometrie für Apoptose (Annexin V - FITC/PI-Färbung)
Die Zellen wurden bei 60–70 % Konfluenz ausgesät und unter den angegebenen Bedingungen 24 Stunden lang behandelt. Schwimmende und haftende Zellen wurden mit EDTA-freiem Trypsin gesammelt, kombiniert und zweimal mit eiskalten PBS gewaschen. Zellpellets wurden im Annexin-V-Bindungspuffer (10 mM HEPES pH 7,4, 140 mM NaCl, 2,5 mM CaCl2) bei 1 × 106 Zellen/ml wieder suspendiert. Für jede Probe wurden 100 μL Suspension mit 5 μL Annexin V-FITC und 5 μL Propidiumiodid (PI; 50 μg/mL Stock) im Dunkeln für 15 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. Nach der Zugabe von 400 μL Bindungspuffer wurden die Proben auf Eis gelegt und innerhalb von 1 Stunde auf einem Durchflusszytometer analysiert (488 nm Anregung; 530/30 nm für FITC und >585 nm für PI). Geeignete Einzelfärbungs- und Fluoreszenz-minus-eins-Kontrollen wurden zur Kompensation einbezogen. Mindestens 10.000 Ereignisse pro Stichprobe wurden aufgezeichnet. Die Daten wurden nach Quadrantengating analysiert: lebende (Annexin V⁻/PI⁻), frühe apoptotische (Annexin V⁺/PI⁻), spätapoptotische (Annexin V⁺/PI⁺) und nekrotische (Annexin V⁻/PI⁺) Populationen. Prozentsätze früher + später apoptotischer Zellen wurden berichtet (Mittelwert ± SD, n = 3).

Quantitative Echtzeit-PCR (qRT-PCR)
Total RNA wurde gemäß dem Protokoll des Herstellers mit einem sauren Phenol-Guanidinium-Reagenz isoliert. Die RNA-Reinheit wurde durch Spektrophotometrie (A₂₆₀/A₂₈₀ = 1,8-2,1) bestätigt, und die Integrität wurde durch Gelelektrophorese bestätigt (RNA-Integritätsnummer ≥ 7). Ein Mikrogramm Gesamt-RNA wurde mit DNase I behandelt und in einer 20-μL-Reaktion mit zufälligen Hexamern und Oligo(dT)-Primern rückwärts transkribiert. Die Reaktion erfolgte bei 25 °C für 10 Minuten, 50 °C für 30 Minuten und 85 °C für 5 Minuten. Die quantitative PCR wurde in einem 10-μL-System durchgeführt, das 5 μL 2× SYBR Green Master Mix, je 0,3 μM Primer und 1 μL cDNA (≈ 20 ng RNA-Äquivalent) enthielt. Die thermischen Zyklusbedingungen betrugen 95 °C für 5 Minuten, gefolgt von 40 Zyklen mit 95 °C für 15 Sekunden und 60 °C für 30 Sekunden, gefolgt von einer Schmelzkurvenanalyse von 65 °C bis 95 °C in 0,3 °C-Schritten. Alle Reaktionen wurden dreifach durchgeführt, zusammen mit No-Template- und Minus-RT-Steuerungen. CT-Werte > 35 oder technisch replikierte SD > 0,5 wurden ausgeschlossen. Die relative Expression wurde mit der 2⁻ΔΔCt-Methode berechnet, wobei GAPDH die interne Kontrolle war. Mittlere ± SD-Werte von drei unabhängigen biologischen Replikaten wurden berichtet, und Gruppenunterschiede wurden mit einem zweiseitigen t-Test analysiert.

Western-Blot-Analyse
Die Zellen wurden auf Eis im RIPA-Puffer (50 mM Tris-HCl, pH 7,4, 150 mM NaCl, 1 % NP-40, 0,5 % Natriumdeoxycholat, 0,1 % SDS) mit Protease- und Phosphataseinhibitoren aufgewertet. Lysate wurden 30 Minuten auf Eis mit intermittierendem Vortex inkubiert und durch Zentrifugation bei 12.000 × g für 15 Minuten bei 4 °C beseitigt. Die Proteinkonzentrationen wurden durch einen BCA-Test gemessen, angepasst auf 1-2 μg/μL und 1:3 mit dem 4× Laemmli-Puffer (der letzte 1×-Puffer mit 100 mM DTT) gemischt. Die Proben wurden bei 95 °C für 5 Minuten denaturiert. Gleiche Mengen an Protein (50 μg) wurden durch 12 % SDS-PAGE bei 100 V für 90 Minuten aufgelöst und für 90 Minuten auf PVDF-Membranen bei 250 mA elektrotransferiert. Die Membranen wurden mit 5 % fettfreier Milch in TBST (0,1 % Tween-20) für 1 Stunde bei Raumtemperatur (oder 5 % BSA für Phosphoproteine) blockiert und über Nacht bei 4 °C mit primären Antikörpern gegen IGF1, IGF1R, JAK2, p-JAK2 (Y1007/1008), STAT3, p-STAT3 (Y705), BIRC5 und β-Aktin (typische Verdünnung 1:1000, β-Aktin 1:5000) inkubiert. Nach drei 10-minütigen Waschen in TBST wurden die Membranen mit HRP-konjugierten Sekundärantikörpern (1:5000) bei Raumtemperatur für 1 Stunde inkubiert, erneut gewaschen und mit chemilumineszentem Substrat entwickelt. Die Bandintensitäten wurden mit ImageJ quantifiziert, auf β-Aktin oder Gesamtprotein normalisiert und als Mittelwert ± SD aus drei unabhängigen Experimenten ausgedrückt.

Immunzytochemie
Zellen, die auf sterilen Glasdeckfolien gezüchtet wurden, wurden zweimal mit PBS ausgespült und bei Zimmertemperatur 15 Minuten lang in 4 % Paraformaldehyd fixiert. Nach drei PBS-Waschungen wurden die Zellen mit 0,2 % Triton X-100 für 10 Minuten permeabilisiert, 1 Stunde lang mit 5 % Rinderserumalbumin (BSA) blockiert und über Nacht bei 4 °C mit dem primären Anti-CD31-Antikörper (1:200 Verdünnung in 1 % BSA) inkubiert. Nach drei PBS-Waschverfahren wurden die Zellen mit Alexa-fluor-konjugiertem Sekundärantikörper (1:500-Verdünnung) für 1 Stunde im Dunkeln inkubiert, mit DAPI (1 μg/mL, 5 Min) gekonnt gefärbt und in Antifade-Medium montiert. Die Bilder wurden mit einem Fluoreszenzmikroskop unter identischen Belichtungs- und Verstärkungseinstellungen aufgenommen. Der Prozentsatz der CD31-positiven Fläche wurde in fünf zufällig ausgewählten, nicht überlappenden Feldern pro Stichprobe mit der ImageJ-Software quantifiziert. Dieser Test wurde in Zellmodellen statt in Gewebeschnitten durchgeführt.

Statistische Analyse
Statistische Analysen wurden unter Verwendung von R-Version 4.3.0 sowie den zugehörigen Paketen durchgeführt. Um kategorische Variablen zu vergleichen, wurde der Chi-Quadrat-Test verwendet, während kontinuierliche Variablen entweder mit dem Wilcoxon-Rangsummentest oder dem T-Test bewertet wurden. Die Bewertung kontinuierlicher Variablen erfolgte über den Pearsonschen Korrelationskoeffizienten. Überlebensanalysen wurden mit dem Überlebenspaket durchgeführt, das Cox-Proportionalgefahrmodellierungen und die Generierung von Kaplan-Meier-Kurven umfasste, wobei optimale Stratifikationsschwellenwerte durch das Survminer-Paket und die Formel Riskscore = Gleichung 1festgelegt wurden. Das CompareC-Paket wurde verwendet, um die C-Indizes verschiedener Variablen zu bewerten. Die Empfänger-Betriebscharakteristiekkurve (ROC), die darauf abzielt, binäre Kategorienvariablen vorherzusagen, wurde mit dem pROC-Paket generiert. Zusätzlich wurde die zeitabhängige Fläche unter der ROC-Kurve (AUC) für Überlebensmetriken mit dem timeROC-Paket analysiert. Alle statistischen Tests wurden mit einem zweiseitigen Ansatz durchgeführt. Ein Signifikanzniveau von P < 0,05 wurde als statistisch signifikant angesehen.

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Ergebnisse

IRAIN ist im Gliom herunterreguliert und mit unerwünschten klinisch-pathologischen Merkmalen assoziiert
Der Analyseprozess ist in Abbildung 1 dargestellt. Die IRAIN-Expression wurde zunächst mittels qRT-PCR in primären Astrozyten, Gliomgeweben und Gliomzelllinien untersucht. Die IRAIN-Spiegel waren sowohl in niedriggradigen als auch hochgradigen Gliomgeweben sowie in allen vier Gliomzelllinien (SHG44, A172, U251 und T98G) im Vergleich zu normalen Astrozyten (

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Diskussion

Das Gliom bleibt eine der tödlichsten Malignitäten des zentralen Nervensystems, gekennzeichnet durch eine tiefgreifende intratumorale Heterogenität und Resistenz gegenüber konventioneller Therapie. Trotz chirurgischer Resektion in Kombination mit Chemoradiotherapie bleiben Rückfälle und Sterblichkeit hoch, und das mediane Überleben von Patienten, insbesondere solchen mit Glioblastom, hat in den letzten Jahrzehnten nur begrenzte Verbesserungen gezeigt 4,24

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Offenlegungen

Die Autoren haben nichts offenzulegen.

Danksagungen

Wir danken allen Teilnehmern und Forschern, die am Genotype-Tissue Expression (GTEx)-Projekt und den TCGA- und CGGA-Datenbanken beteiligt sind, für den Austausch verfügbarer Daten. Diese Arbeit wurde durch das Fujian Provincial Health Technology Project (2024GG01010154) und das Doctoral Workstation Climbing Project des Zhangzhou Hospital (PDA202306) unterstützt. Der Geldgeber stellte Mittel für unsere Forschung bereit.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
Annexin V-PI Apoptose-Kit  Southern Biotechnology, Birmingham, AL, USANAZur Bewertung der Apoptose verwendet
AnnexinV-PI Apoptose-KitSüdliche Biotechnologie10010-02Verwendet zur Apoptose-Beurteilung mittels Durchflusszytometrie.
Anti-IGF1, Anti-IGF1R, Anti-JAK2, Anti-STAT3, Anti-Survivin, Anti-β-AktinAbcamab182408, ab108596, ab109085, ab76424, ab8227Antikörper, die für die Western-Blot-Analyse der Signalwege verwendet werden.
BiocManagerCRAN1.30.25Installieren und verwalten Sie Bioconductor-Pakete in R & Ge; 3.6.
Bio-Rad Cfx96-SystemBioleiter1.5.1Programmatischer Zugriff auf STRING protein– Proteinwechselwirkungen.
CaretCRAN0.4Zeitabhängiges ROC/AUC für Überlebensmodelle.
Chinesischer Gliom-Genomatlas (CGGA)NACGGA693 und CGGA325 Verwendet für Modellzusammenstellung und Validierung
ClusterprofilerBioleiter2.18.0MAF-Dateien analysieren; Berechnen Sie die Tumormutationslast (TMB) und die Mutationslandschaft.
CorrplotCRAN3.5.0Allgemeiner Plotting (Boxplots, Violin-Plots, Scatter, Trendlinien).
CoxboostCRAN7.3-60stepAIC für die schrittweise Cox-Modellauswahl.
Data.TableCRANreadr2.1.5Schnelles Lesen von getrennten Dateien; robustes UTF-8-Handling.
DosisBioleiter3.17.0Menschliche Genannotation (Entrez, Ensembl, SYMBOL-Abbildungen).
DynamictreecutCRAN1.73Analyse des gewichteten Gen-Koexpressionsnetzwerks; pickSoftThreshold, TOM, Modulerkennung.
EdgerBioleiter3.56.2Differentialausdruck (Voom/lineare Modelle); Wilcoxon/empirische Bayes; Vulkan-/Heatmap-Eingaben.
EnrichplotBioleiter3.26.2Anreicherung der Krankheitsontologie und GSEA-Helfer (verwendet mit clusterProfiler).
FlashclustCRAN1.63-1Adaptiver Astschnitt für die WGCNA-Modulerkennung.
GBMCRAN1.12Überwachte Hauptkomponenten für die Überlebensanalyse.
Genexpressions-Omnibus (GEO)NAGSE43378Verwendet für Modellzusammenstellung und Validierung
GEOqueryBioleiterNALaden Sie GEO-Datensätze herunter und analysieren Sie.
Ggplot2CRAN1.0.12Veröffentlichungsbereite Heatmaps der Ausdruckssignaturen.
GlmnetCRAN3.3.1Zufälliger Überlebenswald für richtig zensierte Ergebnisse.
Meerrettich-Peroxidase-markierte Anti-Kaninchen-SekundärantikörperAbcamab6721Sekundäre Antikörper zur Detektion bei Western Blot.
Humane Glioblastomzelllinien (SHG44, U251, A172, T98G)Amerikanische GewebekultursammlungNAMenschliche Glioblastomzelllinien für die Gliomforschung. Die Zellen wurden in DMEM + 10 % FBS, 2 mM L-Glutamin kultiviert.
IgraphCRAN10.0.1Zugang zu MSigDB-Gensets (z. B. metabolische MRGs); praktische, ordentliche Rahmen.
Image J Software  Medienkybernetik, USA152Zur Visualisierung verwendet
Lentiviraler Vektor, der lncRNA-IRAIN codiertGeneChem, Shanghai, China NALentivirale Vektoren, die zur Transfektion von Gliomzellen und HEB-Zellen verwendet werden, um stabile Klone zu etablieren.
LimmaBioleiter3.48.0Batch-Korrektur (ComBat) und Surrogat-Variablenanalyse.
MaftoolsBioleiter1.52.0Harrell' s Konkordanzindex (C-Index) und Überlebensvergleichswerkzeuge.
MesseCRAN4.1-8Bestrafte Cox-Modelle: Lasso, Ridge und Elastic Net.
MsigdbrCRAN0.0.5Unterstützung von Vektormaschinenmethoden für Überlebensdaten.
MTTSigma-AldrichM2128Verwendet für Zellproliferationstests.
Normale Gliazellen (HEB)Amerikanische GewebekultursammlungNANormale menschliche Gliazelllinie für Vergleichsstudien. Kultiviert in DMEM + 10 % FBS.
Org.Hs.Eg.DbBioleiter4.8.3GO/KEGG-Anreicherung und GSEA; unterstützt mehrere ID-Typen.
PheatmapCRAN2.0.0Grammatik der Datenwissenschaft; Enthält DPLYR, Tidyr, Purrr, GGPLOT2 für Wrangling und Plot.
PlsrcoxCRAN1.5Likelihood-basiertes Boosting für Cox-Modelle.
PVDF-MembranenMilliporeIPVH00010Membranen, die für den Proteintransfer nach SDS-PAGE verwendet werden.
RandomforestsrcCRAN6.0-94Vereinheitlichtes Resampling (einschließlich LOOCV), Tuning-Gitter und Modellpipelines.
ReadrCRANNAAbrufe Matrizen/Phänotypen von UCSC Xena (z. B. TCGA/GTEx-Hubs).
SDS-Page Gel (12 %)Bio-Rad185-5096System für quantitative PCR verwendet.
StringdbBioleiter1.20.3Visualisierung für Anreicherungsergebnisse (Dotplot, Cnetplot, Ridgeplot).
SuperpcCRAN1.7.7Partielle Kleinste-Quadrat-Regression, angepasst an Cox-Modelle.
SurvcompBioleiter3.42.4Zählt, Normalisierung und Dispersionsschätzung, wenn nötig (optional, ergänzt limma voom).
ÜberlebenCRAN1.01-2Schnelles hierarchisches Clustering, das von WGCNA verwendet wird (optional).
SurvivalsvmCRAN2.2.2Generalisierte boosted regressive Modellierung (Gradient Boosting).
SurvminerCRAN3.8-3Cox-Proportionalgefahrmodelle; Kaplan– Meier krümmt sich.
TCGAbiolinksBioleiterT9039Programmatischer Zugriff auf TCGA-Daten; Bereiten Sie Expressions- und klinische Daten herunter und bereiten Sie diese vor.
Das Cancer Genome Atlas Programm (TCGA)NAhttps://www.cancer.gov/tcga; 175 GBM und 534 LGGVerwendet für Modellzusammenstellung und Validierung
TidyverseCRAN1.17.6Hochleistungs-Datenmanipulation für große Matrizen/Tabellen.
TimerocCRAN0.5.0KM-Visualisierung und Rendering von Risikotabellen.
TRIzolInvitrogen15596026Reagenz zur RNA-Extraktion aus Zellen.
UCSC XenaNAhttps://xenabrowser.net/datapages/Verwendet für Modellzusammenstellung und Validierung
UcscxenatoolsBio-Rad4561044Verwendet zur Proteintrennung in der Western Blot-Analyse.
WgcnaCRAN0.95Korrelationsmatrizen für Checkpoint-Gene und Merkmalsbeziehungen.

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