Methodenartikel

Verbesserung von CRISPR-Cas9-Bildschirmen in CAR-T-Zellen: Eine verfeinerte Methode zur Bibliotheksvorbereitung

DOI:

10.3791/69721

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2. Januar 2026

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Hemato-Oncology Program, Cima Universidad de Navarra, IdiSNA, 2Centro de Investigacion Biomedica en Red de Cancer (CIBERONC), 3Computational Biology and Translational Genomics Program, Cima Universidad de Navarra, IdiSNA, 4Cancer Center Clinica Universidad de Navarra (CCUN), 5Data Science and Artificial Intelligence Institute (DATAI), Universidad de Navarra, 6Hematology and Cell Therapy Department, Clinica Universidad de Navarra, IdiSNA

* These authors contributed equally

In diesem Artikel

Zusammenfassung

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Wir entwickelten ein optimiertes CRISPR-Cas9-Knockout-Screening-Protokoll für primäre CAR-T-Zellen. Durch die Reduzierung der gDNA-Übertragung durch enzymatische Verdauung und sgRNA-Kassettenpulldown minimiert dieser Ansatz PCR-Artefakte und gewährleistet eine genaue SGRNA-Detektion sowie eine robuste Identifikation funktioneller Genziele.

Zusammenfassung

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Chimerische Antigenrezeptor-(CAR)-T-Zelltherapien haben bei mehreren hämatologischen Malignitäten eine bemerkenswerte Wirksamkeit gezeigt, doch ihr Erfolg wurde bei soliden Tumoren nicht vollständig nachgebildet. Darüber hinaus beeinträchtigt selbst bei hämatologischen Krebserkrankungen der Rückfall nach einer CAR-T-Zellinfusion weiterhin die langfristigen Ergebnisse. Diese Herausforderungen unterstreichen die dringende Notwendigkeit, Strategien zu entwickeln, die die Wirksamkeit, Persistenz von CAR-T-Zellen und die Überwindung von Tumor- und Mikroumgebungs-vermittelten Resistenzen verbessern. Clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR)-Cas9-basierte Screening-Plattformen bieten einen leistungsstarken Ansatz, um Gene systematisch zu identifizieren, die die Funktion der CAR-T-Zellen regulieren. Durch die Verknüpfung genetischer Störungen mit phänotypischen Ergebnissen ermöglichen diese Assays die Entdeckung von Wegen, die Aktivierung, Proliferation, Gedächtnisbildung und Zytotoxizität steuern. Standard-Arbeitsabläufe beinhalten die Transduktion erheblicher Zellzahlen mit einer einzigen Guide-RNA (sgRNA)-Bibliothek, Cas9-vermittelte Editierung, Auswahl bearbeiteter Zellen und PCR-Amplifikation von sgRNA-Kassetten aus genomischer DNA (gDNA) vor der Sequenzierung. Die PCR-Amplifikation mit großen Mengen gDNA stellt jedoch erhebliche Herausforderungen dar und gelingt es oft nicht, selektiv sgRNAs zu amplifizieren und abzugewinnen. Hier beschreiben wir ein optimiertes CRISPR-Cas9-Knockout-Screening-Protokoll, das wir an primären menschlichen CAR-T-Zellen getestet haben. Die Methode beinhaltet hier einen Zwischenschritt während der Vorbereitung der sgRNA-Bibliothek, der die gDNA-Übertragung durch enzymatische Verdauung und selektiven Pulldown der sgRNA-Kassette reduziert und so die Effizienz der ersten PCR-Amplifikation erhöht. Diese Modifikation ermöglichte es uns, sgRNA-Informationen über unsere CAR-T-Zell-Screens abzurufen, die bei unseren früheren Versuchen mit traditionellen 1- und 2-Schritt-PCR-Amplifikationsprotokollen schwer fassbar blieben. Zusammenfassend erleichtert dieser optimierte Arbeitsablauf die Vorbereitung von CRISPR-Screening-Bibliotheken in schwierigen Proben und ermöglicht die Identifizierung wichtiger genetischer Determinanten, die gezielt zur Verbesserung der therapeutischen Wirksamkeit eingesetzt werden können.

Einleitung

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Die Immuntherapie hat die Krebsbehandlung revolutioniert und bietet neuartige Strategien zur Nutzung und Modulation des Immunsystems. Unter diesen hat sich die T-Zelltherapie mit chimerischem Antigenrezeptor (CAR) als einer der transformativsten Ansätze herauskristallisiert. Diese Therapie beinhaltet die genetische Manipulation der T-Zellen eines Patienten ex vivo mit einem synthetischen Rezeptor, der ein spezifisches Tumorantigen erkennt und so die Antitumoraktivitäterhöht. CAR-T-Zellen haben bemerkenswerte Erfolge bei hämatologischen Malignitäten gezeigt, mit Ergebnissen von kurzzeitigen Remissionen bis hin zu verlängertem krankheitsfreiem Überleben mit minimaler Toxizität bei Patienten, die CD19- oder BCMA-gezielte Therapien erhaltenhaben 2. Bis heute hat die FDA sieben CAR-T-Zellprodukte für hämatologische Krebserkrankungenzugelassen. Trotz dieser Fortschritte bleiben erhebliche Einschränkungen bestehen. Herausforderungen entstehen durch das CAR-T-Zellprodukt selbst, oft beeinflusst durch den Herstellungsprozess oder die Fitness der T-Zellen des Patienten, die durch Krankheitsverlauf, vorherige Therapien oder Alter beeinträchtigt sein können. Tumor-intrinsische Resistenzmechanismen, wie die Antigen-Downregulation, können ebenfalls die Wirksamkeit beeinträchtigen4. Darüber hinaus stellt die immunsuppressive Tumormikroumgebung eine zusätzliche Barriere dar, die die Persistenz und Funktion der CAR-T-Zellen stark einschränkt, insbesondere bei Patienten mit solider Tumor5. Daher besteht ein dringender Bedarf, sowohl die anfängliche als auch die langfristige Wirksamkeit von CAR-T-Zelltherapien zu verbessern.

Die Einführung der CRISPR-Cas9-Geneditierung hat leistungsstarke Werkzeuge bereitgestellt, um Genfunktionen durch groß angelegte Screening-Ansätze zu analysieren. In diesen Assays werden die Zellen mit einer Single-Guide-RNA (sgRNA)-Bibliothek transduziert, die typischerweise durch lentivirale Vektoren geliefert wird, was eine sgRNA pro Zelle und eine stabile genomische Integration gewährleistet. Nach Cas9-vermittelter Editierung und Auswahl transduzierter Zellen wird genomische DNA (gDNA) extrahiert und sgRNA-Kassetten durch PCR zur Bibliotheksvorbereitung amplifiziert. Hochdurchsatzsequenzierung ermöglicht dann die Quantifizierung von sgRNA-Verteilungen über verschiedene Phänotypen hinweg und identifiziert so Gene, die den untersuchten Prozesspositiv oder negativ regulieren.

CRISPR-Screening wurde weit verbreitet eingesetzt, um die T-Zellbiologie zu erforschen und neuerdings die Leistung von CAR-T-Zellen zu verbessern. Genomweite Screenings haben Regulatoren fundamentaler T-Zellprozesse identifiziert, einschließlich Aktivierung, Proliferation und Differenzierung. Beispielsweise wurde FAM49B als Regulator der T-Zell-Rezeptor-Signalübertragung7 identifiziert, während SOCS1, TCEB2, RASA2 und CBLB als essentiell für die Proliferation nach Stimulation8 erwiesen wurden. Über diese Kernwege hinaus hat das CRISPR-Screening auch Gene aufgeklärt, die an T-Zell-Gedächtnis und -Erschöpfung beteiligt sind. In-vivo-Studien identifizierten Fli1 als Kandidaten zur Verstärkung der Effektorantworten ohne Unterbrechung von Gedächtnis- oder Erschöpfungsvorläufern9, und den Chromatin-Remodeler Arid1a als Regulator, dessen Verlust die T-Zell-Erschöpfung10 reduziert. Regulatoren der T-Helfer-Typ-2 (Th2)-Differenzierung wurden ebenfalls mit diesem Ansatzcharakterisiert. Mit einer eigenen sgRNA-Bibliothek, die auf 25 Kinasen abzielt, wurde festgestellt, dass p38 die Expansion, Gedächtnisbildung und den Schutz vor oxidativem und genomischem Stress12 fördert. Ähnlich verlieh der REGNASE-1-Knockout in CD8+- T-Zellen einen langlebigen Effektor-Phänotyp, der die Tumorkontrolle bei Melanom- und Leukämiemodellen13 verbesserte. Weitere genomweite Screens identifizierten Dhx37 als Regulator der T-Zellaktivierung und Zytotoxizität14, während LTBR und andere Gene als Förderer der T-Zellfunktion in CAR-T- und γδ-T-Zellen15 validiert wurden. In jüngerer Zeit wurde das CRISPR-Screening direkt in CAR-T-Zellen angewendet, wodurch neuartige Ziele wie PRODH2, ein Enzym, das am Prolinstoffwechsel beteiligt ist und die Antitumoraktivität von CAR T16 erhöht, sowie TLE4 und IKZF2, deren Inaktivierung die Wirksamkeit von CAR T in Glioblastom-Modellen17 verbesserte, aufgedeckt wurden.

Ein entscheidender Schritt bei CRISPR-Screens ist gerade die selektive Amplifikation von sgRNA-Kassetten aus äußerst großen Mengen gDNA, eine Herausforderung, die angesichts der großen Anzahl an Zellen, die bei CRISPR-Screenings verwendet werden, schwer zu umgehen ist. Die PCR-Amplifikation aus so großen Mengen an DNA-Übertragung bringt mehrere technische Herausforderungen mit sich, darunter molekulare Überfüllung, die die physikalische Diffusion von DNA- und Polymerasemolekülen einschränkt, vorübergehende nicht-spezifische Bindung der Primer und der Polymerase an den DNA-Hintergrund, eine Off-Target-Amplifikation, die zu Primer-Depletion führt, oderMg-2+-Sequestrierung durch das DNA-Phosphat-Rückgrat, neben weiteren Herausforderungen18. 19, 20, 21. Diese führen oft zu PCR-Versagen und/oder Verzerrungen. Um diese Probleme zu mildern, wurden verschiedene Strategien vorgeschlagen, darunter die Trennung der sgRNA-Amplifikation von der Adaptoraddition in zwei PCR-Schritte22, die Verwendung der Zielanreicherung mit biotinylierten Oligos und magnetischer Perlenfang23,24 oder die Entwicklung von Plasmiden mit Restriktionsstellen flankiert an der sgRNA-Kassette für die Fragmentanreicherung25.

In dieser Studie präsentieren wir ein optimiertes CRISPR-Cas9-Knockout-Screening-Protokoll für primäre menschliche CAR-T-Zellen. Die verwendete CRISPR-Bibliothek ist Brunello Kinome 1, eine Bibliothek, die 3052 einzigartige 20 nt lange sgRNAs enthält, die 763 menschliche Kinase-Gene (4 sgRNAs pro Ziel) anvisieren. T-Zellen wurden durch CD4+- und CD8+- magnetische positive Selektion aus den peripheren mononuklearen Blutzellen (PBMC)-angereicherten Fraktionen von Blutproben gesunder Spender isoliert. Nach der Aktivierung mit Anti-CD3 und Anti-CD28 wurden T-Zellen mit der CRISPR-Screening-Bibliothek gesinfiziert und anschließend mit dem CAR-Lentivirus transduziert. Die Zellen wurden erweitert und dann nukleofektiert, um das Cas9-Protein einzuführen. CRISPR-tragende Zellen wurden mit Puromycin ausgewählt, und CAR-positive T-Zellen wurden sortiert. Nach der Extraktion wurde genomische DNA mit Restriktionsenzymen (RE) verdaut, und die sgRNA-enthaltenden Fragmente wurden durch Biotin-Probe-Streptavidin-Fang nach unten gezogen. Anschließend wurden sgRNA selektiv amplifiziert und über zwei aufeinanderfolgende PCRs indexiert, und die resultierenden Bibliotheken wurden sequenziert. Durch die Einbindung eines Zwischenschritts zur Reduzierung des gDNA-Übertragungsprozesses konnten wir unsere interessierende sgRNA selektiv abgewinnen und amplifizieren, was es uns ermöglicht, die Rolle der Kinasen in CAR-T-Zellen zu untersuchen.

Protokoll

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Dieses Protokoll wurde gemäß den Richtlinien der Universidad de Navarra durchgeführt. Alle Probanden gaben schriftliche informierte Einwilligung. Die in dieser Studie verwendeten Reagenzien und Ausrüstung sind in der Materialtabelle aufgeführt.

1. T-Zell-Isolation und -Aktivierung

  1. PBMC-Isolation
    1. Sammeln Sie Blutproben von Spendern auf Ethylendiamintetraessigsäure-(EDTA)-Tuben, übertragen Sie Blutproben in 50-ml-Kegelröhrchen und verdünnen Sie das Blut mit PBS (Verdünnung 1:1).
    2. Fügen Sie 15 ml Dichtegradientmedium an den Boden eines 50-mL konischen Rohrs hinzu (Dichte für PBMCs: 1,07). Anschließend geben Sie vorsichtig 25 ml verdünntes Blut über die Dichtegradienten-Mittelschicht (langsamste Geschwindigkeit des Pipettenreglers). Zentrifugiere 30 Minuten bei 800 × g ohne Bremse.
    3. Sammle PBMCs mit einer Pasteur-Pipette in ein 50-mL-konisches Rohr und gib PBS zu einem Gesamtvolumen von 50 mL zum Waschen. Zentrifugiere bei 650 × g für 8 Minuten. Entsorge das Supernatant.
      HINWEIS: Überprüfen Sie die Trübung des Supernatans, um sicherzugehen, dass keine Zellen vorhanden sind. Im Zweifelsfall teilen Sie die Suspension in doppelt so viele 50 mL konische Röhren wie ursprünglich auf, geben Sie PBS bis 50 mL und zentrifugieren Sie erneut.
    4. Wieder in 50 ml PBS suspendieren. Zählen Sie mit Acridin-Orangen-Propidiumiodid (AOPI) in einem Zellzähler. Zentrifugiere bei 650 × g für 8 Minuten.
  2. CD4- und CD8-Magnetauswahl
    1. Bereiten Sie fluoreszenzaktivierte Zellsortierpuffer (FACS) vor: PBS, EDTA 2,5 μM, BSA 0,5 % und filtern Sie durch 0,2 μm.
    2. Suspendiere PBMCs in 80 μL FACS puffersteril pro 10 × 106Zellen und füge 10 μL Mikroperlen CD4 und 10 μL Mikroperlen CD8 pro 10 × 106Zellen hinzu . 20 Minuten bei 4 °C inkubieren.
    3. Fügen Sie 10 ml FACS-Puffer hinzu und zentrifugieren Sie 8 Minuten bei 650 × g. Entsorge das Supernatant komplett.
    4. Resuspendieren Sie in 500 μL pro 1 × 108 Zellen des FACS-Puffers in einem 15 mL konischen Rohr.
      HINWEIS: Ein Lauf kann 200 x 10Zellen aufnehmen .
    5. Verwenden Sie das Possel-Programm für AutoMacs (High-Speed Magnetic Cell Sorter) Isolierung.
    6. Fügen Sie bis zu 10 ml PBS hinzu, zählen Sie mit AOPI in einem fluoreszierenden Zähler und zentrifugieren Sie mit 650 × g für 8 Minuten.
    7. Resuspendiere Zellen 1 x 106/mL in einem T-Zellwachstumsmedium, das 3 % menschliches Serum (HS), 1 % Penicillin/Streptomycin (P/S), 625 IU/mL Interleukin (IL)-7, 85 IU/mL IL-15 enthält. Fügen Sie 10 μL T-Zell-Stimulationsreagenz pro 1 ml hinzu und mischen Sie gut. Platten Sie 2 ml pro Bohrloch in einer 24-Bohrloch-Platte (p24 W) und inkubieren Sie 24 Stunden bei 37 °C.

2. CAR-T-Zellproduktion und CRISPR-Screening

  1. Bibliotheks-Spinfektion und CAR-Transduktion
    1. Fügen Sie die entsprechende Menge der Lentivirus-CRISPR-Bibliothek hinzu (z. B. Brunello Kinome 1-Bibliothek). Siehe Ergänzende Tabelle 1), in einer Titrationsanalyse bestimmt, und 8 μg/mL Polybrene.
    2. Spritzen Sie durch Zentrifugation bei 700 x g für 1 Stunde 30 Minuten bei 32 °C.
    3. Ersetzen Sie Medien durch ein frisches T-Zell-Wachstumsmedium mit 3 % HS, 1 % P/S, 625 IU/mL IL-7, 85 IU/mL IL-15 (Endzelle = 106 Zellen/mL).
    4. Nach 6 Stunden wird die entsprechende Menge des CAR-lentiviralen Vektors zu einer Infektionsmultiplizität (MOI) von 3 hinzugefügt und 4 Tage inkubiert.
  2. Cas-9-Elektroporation
    1. Sammeln Sie CAR-T-Zellen, waschen Sie einmal mit PBS und zählen Sie Zellen mit AOPI in einem Fluoreszierungszähler.
    2. Bereiten Sie 4 μM Cas9 im Elektroporationspuffer vor.
    3. Resuspendieren Sie CAR-T-Zellen in 50 μL pro 5 × 106 Zellen. Mischen Sie und fügen Sie vorsichtig 50 μL Zellsuspension in jede Mulde eines Mehrwellen-Cuvette-Streifens hinzu, ohne dass Blasen entstehen. Dann entferne mit einer Pipettspitze alle möglichen Blasen und führe die Spitze entlang der Ränder des Brunnens.
      HINWEIS: Wenn in einer Cuvette ein Brunnen ohne Probe übrig bleibt, fügen Sie das gleiche Volumen des Elektroporationspuffers hinzu. Dies ist ein entscheidender Schritt: Wenn die Maschine eine Blase oder einen Volumenunterschied erkennt, liefert sie einen Fehler.
    4. Verwenden Sie das Programm EXPAND T CELL 3 , um CAR-T-Zellen zu nukleofektieren.
    5. Lassen Sie die Zellen in den Cuvetten 40 Minuten in einem Inkubator bei 37 °C stehen.
    6. Die nukleofektierten Zellen in einem T-Zell-Wachstumsmedium mit 3 % HS, 1 % P/S, 625 IU/mL IL-7, 85 IU/mL IL-15 (Endzelle = 106 Zellen/mL) wieder suspendieren und 3 Tage lang bei 37 °C inkubieren.
  3. Puromycin-Auswahl
    1. Zähle mit AOPI in einem fluoreszierenden Zellzähler.
    2. Passen Sie auf 1 x 106 Zellen /mL mit T-Zellwachstumsmedium ein, das IL7 und IL15 enthält.
    3. Fügen Sie dem Medium Puromycin (2,5 μg/mL) hinzu.
    4. Zähle die Zellen alle 2 Tage für 6 Tage und passe sie auf 1 x 106 Zellen /ml an, wobei ein Zellwachstumsmedium 3 % HS, 1 % P/S, 625 IU/mL IL-7, 85 IU/mL IL-15 und 2,5 μg/mL Puromycin enthält.
    5. Check % AUTO.
  4. Sortiere CAR-T-Zellpopulationen und lagere Proben (Trockenzellpellet) bei -80 °C.

3. Isolierung der gDNA

HINWEIS: Vermeiden Sie Zell- oder gDNA-Verluste während des Prozesses, da dies die Repräsentativität der sgRNAs beeinträchtigen kann. Strebe eine sgRNA-Abdeckung von mindestens 500x an.

  1. Extrahiere gDNA aus Proben mit Hilfe des Zell- und Gewebe-DNA-Extraktionskits. Zweimal elutieren, um die gDNA-Wiederherstellung zu maximieren.
    HINWEIS: Verwenden Sie nicht mehr als 4 x 106 Zellen pro Spalte, um die gDNA effizienter wiederherzustellen.
  2. Misse die gDNA-Konzentration mit dem dsDNA-Quantifizierungskit.
    HINWEIS: Wenn die Konzentration für die folgenden Schritte des Protokolls zu niedrig ist, verwenden Sie Festphasen-Reversible Immobilisation (SPRI)-Perlen-basierte Reinigungsreagenz, um die DNA zu konzentrieren.

4. Anreicherung der sgRNA-Kassette (und Eliminierung der gDNA-Übertragung)

  1. Verdauung von Restriktionsenzymen
    1. Man verdaut maximal 5 μg gDNA mit 20 U des Enzyms/s (z. B. für lentiGuide-puro Backbone für Brunello Kinome 1 Bibliothek verwenden Sie die Kombination NdeI und PspXI) in einem Gesamtvolumen von 50 μL. Skalieren Sie die Anzahl der Reaktionen, um die gewünschte sgRNA-Repräsentativität zu erreichen.
      HINWEIS: Wählen Sie die Restriktionsenzyme aus, um die Flankenbereiche der Kassette zu durchschneiden, aber beachten Sie, dass einige der sgRNAs möglicherweise eine Restriktionsstelle enthalten. Diese sgRNAs gehen in diesem Schritt verloren und tauchen in der Sequenzierung nicht auf. Das Fehlen dieses Leitfadens dient als Kontrolle der Verdauung. Ergänzende Tabelle 1 zeigt eine Liste von Kinom-1-sgRNAs, die von PspXI und NdeI gespalten sind.
    2. Über Nacht bei 37 °C in einem Thermocycler inkubieren.
    3. Führen Sie eine 2x-SPRI-Reinigung durch.
      1. Bereiten Sie 10 mL Elutionspuffer (EB) (10 mM Tris-HCl, pH 8,0) und 50 mL frisches 70%iges Ethanol vor.
      2. Wirbeln die Perlen ein Vortex und fügen Sie 100 μL zum Produkt der Verdauung hinzu.
      3. Gründlich durch Pipette mischen und 5 Minuten inkubieren. Magnetisieren für weitere 5 Minuten.
      4. Während Sie am Magneten sind, fügen Sie 200 μL 70 % Ethanol hinzu, ohne das Pellet zu stören. Warte 30 Sekunden und entsorge dann das Supernatantant.
      5. Wiederholen Sie Schritt 4.1.3.3 für insgesamt 2 Waschen. Lass die Perlen 2 Minuten trocknen.
      6. Entferne sie aus dem Magneten, füge 40 μL Elutionspuffer hinzu und suspendiere die Perlen durch Pipettern wieder. 2 Minuten inkubieren.
      7. Magnetisieren Sie für 2 Minuten und übertragen Sie das Supernatant in ein neues Rohr.
        HINWEIS: Wenn Sie dieses Protokoll zum ersten Mal einrichten, überprüfen Sie die Verdauung durch (kapillare) Elektrophorese. Stellen Sie sicher, dass ein Abstrich beobachtet wird.
  2. Herunterziehen der sgRNA-Kassette.
    1. Herstellung von Streptavidin-Magnetperlen.
      1. Bereite einen Wasch-/Bindungspuffer 2x vor: 10 mM Tris-HCl pH 7,5, 2 M NaCl, 1 mM EDTA. Verdünne die Hälfte des Volumens mit H2O auf 1x.
      2. Wirbel die Perlen 1 Minute lang.
      3. Fülle das gewünschte Volumen Perlen in ein Rohr (typischerweise reicht 1 mg aus), gib ein gleiches Volumen Wash/Binding Buffer 1x oder mindestens 1 ml hinzu und suspendiere es erneut.
      4. Lege das Rohr für eine Minute auf einen Magneten und entsorge das Supernatant.
      5. Entferne das Rohr vom Magneten und lasse die gewaschenen Perlen im gleichen Volumen 1x Wasch-/Bindungspuffer wieder aufhängen wie das ursprüngliche Volumen der Perlen aus dem Fläschchen.
      6. Wiederholen Sie das für insgesamt 3 Waschen.
      7. Perlen in 2x Wash/Binding Buffer wieder aufhängen.
    2. Fügen Sie 5 μL 10 μM Pulldown-Primer, die in Tabelle 1 aufgeführt sind, zur gereinigten Verdauung aus Schritt 4.1.3.6 hinzu.
    3. Inkubieren Sie 5 Minuten in einem trockenen Bad bei 96 °C und bringen Sie sie dann sofort 5 Minuten zum Eis.
    4. Gib 1 mg vorgewaschene Streptavidin-Magnetperlen dazu.
      HINWEIS: Biotin-Streptavidin-Bindung wirkt am besten bei 1 M NaCl. Achten Sie darauf, gleiche Mengen an Perlen und biotinylierter DNA zu mischen.
    5. Inkubiere 20 Minuten, während du die Mischung alle 4 Minuten neu suspendiere.
    6. Magnetisieren für 5 Minuten.
    7. Wasche die Perlen dreimal mit 1× Wash/Binding Buffer.
    8. Die Perlen in 50 μL EB 8,0 wieder aufhalten.
      HINWEIS: Die hier verwendeten sgRNA-Kassetten sind an die Streptavidin-Perlen gebunden. Wirf sie nicht weg.

5. sgRNA-Bibliotheksvorbereitung

  1. PCR1
    1. Bereiten Sie eine PCR1-Mischung mit 20 μL Herculase-5x-Puffer, 1 μL dNTP (100 mM), 1 μL DNA-Polymerase, 2,5 μL 10 μM PCR1-Vorwärts- und Rückwärtsprimern sowie 23 μL PCR-Qualitätswasser vor. Pipettenmischung und PCR1-Mischung zu den Perlen aus Schritt 4.2.8 hinzufügen.
      HINWEIS: Tabelle 1 listet PCR1-Primer auf, die für die Brunello Kinome Library 1 entwickelt wurden.
    2. Setze die Röhren in einen Thermocycler und führe das in Tabelle 2 beschriebene Programm für PCR1 aus.
      HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass der Thermocycler 100 μL-Reaktionen aufnehmen kann. Andernfalls aliquot in 50-μL-Reaktionen. Skaliere nach Bedarf.
    3. Sammeln Sie alle PCR1 aus denselben Proben in einem einzigen Röhrchen.
    4. SPRI-Cleanup PCR1 mit 150 μL (1,5x) Perlen (folgen Sie den Schritten 4.1.3.3-4.1.3.7). Jede PCR-Reaktion wird in 100 μL EB 8,0 erneut suspendiert.
      HINWEIS: Wenn Sie dieses Protokoll erstmals einrichten, überprüfen Sie Größe und Qualität des PCR-Produkts, indem Sie 2 μL eines 30-Takt-PCR-Produkts in einem Kapillarelektrophoresesystem (z. B. Agilents TapeStation Systems) ausführen.
  2. PCR2
    1. Bereiten Sie eine PCR2-Mischung mit 10 μL des Produkts von PCR1, 10 μL 5X-Puffer, 0,5 μL dNTP (100 mM), 1 μL DNA-Polymerase, 1,25 μL 10 μM PCR2-Primern vorwärts und rückwärts vor, wie in Tabelle 1 aufgeführt (verwenden Sie für jede Probe eine andere Kombination rP7-i7-BC und P5-i5-BC) sowie 26 μL PCR-Qualitätswasser für ein Gesamtvolumen von 50 μL.
      HINWEIS: Um die Bibliotheksrepräsentation aufrechtzuerhalten, führen Sie eine PCR2-Reaktion pro 10 oder4 Konstrukte in der Bibliothek durch.
    2. Setze die Röhrchen in einen Thermocycler und führe das in Tabelle 2 beschriebene Programm für PCR2 aus.
    3. SPRI-Cleanup PCR2 mit 75 μL (1,5x) Perlen (Befolge Schritte 4.1.3.3-4.1.3.7). Suspendiere jede PCR-Reaktion in 50 μL EB 8,0 erneut.
  3. Quantifizieren Sie PCR2 (d. h. die sgRNA-Bibliothek) mit dem dsDNA-Quantifizierungskit und überprüfen Sie die Amplikonnengröße mittels Kapillarelektrophorese (z. B. TapeStation-Systeme). Sammelt die Proben.
  4. Sequenzierung auf einem Illumina-Instrument.
    HINWEIS: Für die 3052 sgRNA Brunello Kinome 1 Bibliothek hier reicht eine Sequenzierungstiefe von 100–200 Millionen Lesungen pro Probe typischerweise aus.

6. Analyse

  1. Demultiplex-Samples mit bcl2fastq.
  2. Überprüfen Sie die Qualität der mit FastQC generierten Fastq-Dateien.
  3. Extrahieren Sie die Sequenz der sgRNA unter Verwendung als Muster der Kassettensequenzen, die die sgRNA flankieren, sowie der Länge des Leiters (20 nt).
  4. Richten Sie die extrahierte Sequenz mit Bowtie2 auf die Bibliotheksreferenz aus, um zu prüfen, wie viele der hypothetischen Guides authentische sgRNA aus der Bibliothek sind. Verwenden Sie Samtools, um die SAM-Datei mit Informationen über die Ausrichtung in das BAM-Format zu konvertieren und Zusammenfassungsdateien zu generieren.
  5. Zählen und normalisieren Sie die Anzahl der Lesungen für jede sgRNA in den bearbeiteten und kontrollierten Proben mit der Zählfunktion der MAGecK-Software.
  6. Vergleichen Sie die Zählungen mit der Testfunktion von MAGecK, um die RRA-Werte und die Liste der Kandidatengene zu erhalten.

Ergebnisse

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Wie im Protokollabschnitt beschrieben, wurden CAR-T-Zellen nach unserem festgelegten Protokoll26 erzeugt. Für das CRISPR-Screening haben wir den von Wang et al.17 entwickelten Arbeitsablauf angepasst (Abbildung 1A). Kurz gesagt wurden T-Zellen von zwei unabhängigen Spendern isoliert und 24 Stunden lang aktiviert, bevor sie aufeinanderfolgende Transduktion mit sowohl der CRISPR-sgRNA-Bibliothek als auch mit dem CAR-lentiviralen Vektor durchgeführt wurden, wobei am 5. Tag 67 bzw. 72 % CAR-positive Zellen erreicht wurden. Ein Teil der Zellen wurde mit Cas9-Protein nukleofektiert, um Knockouts zu induzieren, während die übrigen Zellen als Basis für die sgRNA-Darstellung dienten. Transduzierte Zellen wurden mit Antibiotika selektiert, und anschließend wurden unterschiedliche Populationen nach den untersuchten Phänotypen sortiert. Die CAR-T-Zellproliferation wurde während des gesamten Screenings mittels AOPI-basierter Zellzählungen überwacht und als Faltenänderung ausgedrückt (Abbildung 1B). Nach der Puromycin-Supplementierung an den Tagen 8, 10 und 12 bestätigten wir die erfolgreiche Anreicherung der CAR-T-Zellen, die mit der CRISPR-Bibliothek in beiden Spendern transduziert wurden, was sich durch fortgesetztes Überleben und Proliferation zeigt. Untransduzierte T-Zellen (UTD) und CAR-T-Zellen ohne CRISPR-Bibliothekstransduktion wurden als Kontrollmechanismen für die Antibiotikaauswahl verwendet.

Nach der genomischen DNA-Extraktion wurden sgRNA-Bibliotheken mittels PCR-Amplifikation hergestellt. Um Probleme durch übermäßige gDNA-Übertragung zu überwinden, haben wir ein Protokoll implementiert, das die Verdauung von Restriktionsenzymen und den Biotin-Streptavidin-Pulldown der sgRNA-Kassette integriert (Abbildung 2A,B). gDNA wurde mit den Restriktionsenzymen NdeI und PspXI, die die sgRNA-Kassette flankieren, verdaut (Abbildung 2C). Biotinylierte Oligos, die dazu entwickelt wurden, stromaufwärts an PCR1-Primer-Annealing-Stellen zu binden, wurden verwendet, um sgRNA-Kassettenfragmente einzufangen und dann mit Streptavidinperlen nach unten gezogen zu werden, um überlagerte gDNA zu eliminieren. Fragmente mit sgRNA wurden dann selektiv amplifiziert (Abbildung 2D) und durch zwei aufeinanderfolgende PCRs indexiert.

Bibliotheken aus jeder Probe wurden mit Next Generation Sequencing (NGS) sequenziert. Nach Demultiplexing, Qualitätskontrolle und sgRNA-Identifikation wurden die Daten mit der MAGeCK-Pipeline analysiert. Zuerst quantifizierte und normalisierte der Zählbefehl sgRNA-Lesezählungen in Kontroll- (basal) und Cas9-editierten Proben (Abbildung 3A,B). Die Korrelationen zwischen Pearson und Spearman zeigen, dass die Repräsentativität der sgRNA während des Experiments (Spender-gDNA) im Vergleich zur plasmidischen Bibliothek erhalten wurde (Abbildung 3C). Anschließend verglich der Testbefehl beide Bedingungen und vergab jedem Gen robuste Rangaggregationswerte (RRA) (Abbildung 3D). Signifikant angereicherte oder depleierte Gene wurden mit Schwellenwerten von p < 0,05 und logaritamischer Faltenänderung (LFC) > 0,5 identifiziert (Abbildung 3E). Schließlich wurde die Analyse der Pfadanreicherung von Kandidatengenen mit Metascape durchgeführt, wobei die wichtigsten Genontologie-Begriffe mit den identifizierten Regulatoren enthüllt wurden (Abbildung 3F).

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Abbildung 1: CRISPR-Screening in CAR-T-Zellen. (A) Schema des CRISPR-Screenings in CAR-T-Zellen. (B) Selektion transduzierter Zellen mit Puromycin (P). Plasmidische Bibliotheken enthalten ein Puromycin-Resistenzgen für positive Selektion. Antibiotikum wurde am 8. Tag in nicht transduzierte Proben von untransducierten (UTD) und CAR-T-Zellen ins Medium gegeben und transduzierte CAR-T-Zellen. Proben ohne Puromycin wurden zur Kontrolle der Proliferation verwendet. Daten von zwei unabhängigen Spendern werden gezeigt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.

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Abbildung 2: Bibliotheksvorbereitung für die sgRNA-Anreicherungsanalyse. (A) Schema des Protokolls zur Bibliotheksvorbereitung. (B) Schema der relativen Lokalisierung der Schnittgrößen des Restriktionsenzyms (Schere) und der Annealing-Bereiche von PCR1-Primern (Pfeil) und biotinylierten Primern (Pfeil mit grünem Punkt). (C) Elektrophorese der gDNA vor und nach der RE-Verdauung. (D) Selektive Anreicherung von sgRNA-Kassetten nach PCR1. Daten von zwei unabhängigen Spendern aus basalen und Cas9-Proben der beiden Phänotypen werden gezeigt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.

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Abbildung 3: Leitende Anreicherungsanalyse mit MAGeCK. (A) Zusammenfassung der Ausgabe der MAGeCK-Zählfunktion. (B) Verteilung der Leseanzahl. (C) Pearson-und-Spearman-Koeffizienten für die Korrelation zwischen Spender-gDNA und Plasmidbibliothekszählungen. (D) Potenziell angereicherte/erschöpfte Gene, die durch eine modifizierte robuste Ranking-Aggregation (RRA-Score) gerankt werden. (E) Vulkandiagramm zeigt signifikante Gene (p-Wert < 0,05, LFC > 0,5) in Rot. (F) Top-Genontologie-(GO)-Begriffe nach der Metascape-Pathway-Analyse der angereicherten signifikanten Gene. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.

Tabelle 1: Abfolge der Primer. Bitte klicken Sie hier, um diese Tabelle herunterzuladen.

Tabelle 2: PCR-Bedingungen. Bitte klicken Sie hier, um diese Tabelle herunterzuladen.

Ergänzende Tabelle 1: Liste der sgRNA in der Kinome-1-Bibliothek und sgRNAs, die während der Verdauung mit NdeI und PspXI verloren gingen. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Diskussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Das CRISPR-Screening basiert auf dem Prinzip der Single-Guide-Störung, was bedeutet, dass pro Zelle nur eine sgRNA integriert werden sollte. Um dies zu erreichen, werden sgRNAs typischerweise über lentivirale Vektoren abgegeben, und die Multiplizität der Infektion (MOI) muss sorgfältig kontrolliert werden. Ein MOI von ca. 0,3 wird allgemein empfohlen, was dazu führt, dass 25 % bis 30 % der Zellen mit einem einzelnen viralen Partikel6 transduziert werden. Eine genaue Titration ist daher unerlässlich, um das benötigte Volumen der viralen Partikel zu bestimmen. Ein weiterer entscheidender Schritt ist der Verlust der sgRNA-Abdeckung während des Protokolls. Zellverlust während der Ernte, Ineffizienzen bei der gDNA-Extraktion (insbesondere Säulenüberlastung und unvollständige DNA-Eluation) oder übermäßige Schablone während der PCR-Amplifikation können zu diesem Verlust beitragen und daher unsere sgRNA-Analyse verzerren. Bezüglich der biotinylierten Oligos ist es am besten, wenn sie HPLC-gereinigt sind, um zu vermeiden, dass das freie Biotin, das bei der Synthese verwendet wird, die Streptavidinperlen sättigt. Außerdem wird ein 3'-Aminomodifikator stark empfohlen, um eine Amplifikation durch die biotinylierten Primer bei nachfolgenden PCRs zu verhindern. Außerdem sollte bei der Konstruktion dieser Oligos jegliche Überlappung mit PCR1-Primern vermieden werden, um Konkurrenz während der Amplifikation zu vermeiden. Darüber hinaus erfordert bioinformatische Analysen sorgfältige Aufmerksamkeit: Extraktionsmuster von sgRNA hängen vom Plasmid-Rückgrat ab (z. B. lentiGuide-puro oder lentiCRISPR v2), und die Ausrichtungsstringenz kann von exakter Übereinstimmung bis zu einer gewissen Toleranz gegenüber Fehlanpassungen reichen. Außerdem können einige sgRNAs mit Restriktionsstellen verloren gehen, da dieses Protokoll einen Verdauungsschritt beinhaltet, was eine Anpassung der Referenzbibliothek erforderlich macht.

In dieser Studie schlagen wir ein optimiertes CRISPR-Screening-Bibliotheksvorbereitungsprotokoll vor, das sgRNA-enthaltende Fragmente durch Verdauung und – noch wichtiger – durch einen Pulldown-Schritt anreichert. Die Verdauung von Restriktionsenzymen wurde zuvor als Strategie vorgeschlagen, um den gDNA-Input zu reduzieren und für sgRNA-Kassetten27 anzureichern. Ähnlich wurden biotinylierte Sonden in der Molekularbiologie weit verbreitet eingesetzt, um spezifische Nukleinsäuren oder Protein-Nukleinsäure-Komplexe 28,29,30,31 zu erfassen.

Unser Protokoll baut auf diesen Prinzipien auf und passt sie für das CRISPR-Screening in primären CAR-T-Zellen an, obwohl einige Einschränkungen anerkannt werden sollten. Erstens stellen primäre CAR-T-Zellen Einschränkungen für die Screening-Skala, da ihre Ausdehnungskapazität begrenzt ist. Um eine angemessene Abdeckung und sgRNA-Repräsentation zu gewährleisten, sind große Anzahl von Startzellen erforderlich. Wenn dies nicht möglich ist, können kleinere benutzerdefinierte Bibliothekenverwendet werden, was jedoch die Breite der genetischen Abfrage verringert. Biologische Variabilität ist eine weitere Herausforderung; Unterschiede zwischen den Spendern werden erwartet, und die Überschneidung signifikanter Treffer beträgt oft bescheiden17. Zweitens beruht die Anreicherungsstrategie auf dem Vorhandensein und der Position von Schnittstellen des Restriktionsenzyms. In seltenen Fällen können diese Stellen innerhalb von sgRNA-Sequenzen auftreten, was für kleine Bibliotheken mit begrenzter Redundanz problematischer ist. Die meisten Bibliotheken, insbesondere genomweite Designs, enthalten jedoch mehrere sgRNAs pro Ziel, was die Gesamtauswirkung des Führungsverlusts minimiert. Schließlich können alternative fragmentierungsbasierte Anreicherungsstrategien, wie Sonikation in Kombination mit Sonenfang24, in Fällen eine gewisse Flexibilität bieten, in denen die Verdauung von Restriktionsenzymen nicht geeignet ist.

Insgesamt stellt die sgRNA-Kassette nur einen winzigen Bruchteil der gesamten genomischen DNA in CRISPR-bearbeiteten Zellen dar, was eine effiziente Anreicherung für eine erfolgreiche Bibliotheksvorbereitung unerlässlich macht. Im Vergleich zu Standardprotokollen reduziert unser optimierter Arbeitsablauf die gDNA-Übertragung und begünstigt die PCR-Amplifikation der interessierten sgRNA. Obwohl die Kombination aus gDNA-Fragmentierung und biotinyliertem Probe-Pulldown mit Streptavidinperlen konzeptionell nicht neu ist, vermeidet ihre Integration in das CRISPR-Screening häufige PCR-Fallstricke und erhöht die Reproduzierbarkeit des CRISPR-Screens. Darüber hinaus würde die Integration standardisierter QC-Metriken in jedem Schlüsselschritt (wie die Reinheit der T-Zellen nach der Sortierung, der Anteil puromycinresistenter Zellen, die gDNA-Integrität und die CAR-Transduktionseffizienz) die Robustheit und Reproduzierbarkeit des Arbeitsablaufs weiter verbessern. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass dieses optimierte Protokoll, obwohl es im Kontext primärer CAR-T-Zellen und nur mit zwei Spendern entwickelt wurde (was eine Einschränkung darstellen kann, obwohl mehrere Proben pro Spender verwendet wurden), breit auf andere CRISPR-Screenings und NGS-Workflows mit großen gDNA-Übertragungen anwendbar sein kann.

Offenlegungen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Die Autoren haben keine Interessenkonflikte.

Danksagungen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Diese Studie wurde vom Projekt PID2022-137914OB-I00 unterstützt, das von MICIU/AEI /10.13039/501100011033 und von FEDER, UE, finanziert wurde. Diese Studie wurde vom Instituto de Salud Carlos III (ISCIII) über Red de Terapias Avanzadas TERAV und TERAV+ (RD21/0017/0009 und RD24/0014/0010) sowie vom Centro de Investigacion Biomedica en Red de Cancer CIBERONC (CB16/12/00489) unterstützt. Diese Studie wurde von Gobierno de Navarra Salud (GN2023/08 und GN2024/04) und Proyectos Estratégicos (DIAMANTE 0011-1411-2023-000105 und 0011-1411-2023-000074) unterstützt. Abbildung 1B und Abbildung 2A wurden mit BioRender.com erstellt

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
4200 TapeStationAgilentG2991A
Acridine OrangeInvitrogenA1301
AMPure XP Beckman CoulterA63881
autoMACS NEO SeparatorMiltenyi130-120-327Hochgeschwindigkeitsmagnetzellsortierer
Biotinylierte OligosIDT
BSASigmaA9647
Cellometer K2 FluoreszierenzzellzählerRevvityCMT-K2-MX-150Fluoreszierender Zellzähler
CHT4 ZählkammernRevvityCHT4-SD100-002
CytoSinct CD4 NanoperlenGenScriptL00863-1
CytoSinct CD8 NanoperlenGenScriptL00864-1
dNTPAgilent200418-51
Dynabeads M-280 StreptavidinInvitrogen11206D
DynaMag-2-MagnetInvitrogen12321D
EDTA 0,5 M pH 8,0Invitrogen15575-038
EthanolMerck1,00,98,31,000
ExPERT ATX ElektroporatorMaxCyteExPERT ATx
Ficoll-PaqueCytiva17544203
Filtropur S 0.2 & mikro; mSarstedt83,18,26,001
GenCRISPR Ultra NLS-Cas9-ResearchGenScriptZ03621-1
Herculase-Puffer 5XAgilent600675-525X-Puffer
Herculase-II-FusionsenzymAgilent600679-51DNA-Polymerase
IL-15Miltenyi130-095-765
IL-7Miltenyi130-095-362
Mastercycler X50aEppendorf6313HG006059
MaxCyte-ElektroporationspufferCytivaEPB1
NdeINew England BiolabsR0111L
Nukleospin-GewebeMacherey-Nagel74,09,52,250
PBSGibco14190-094
PolybreneMerckTR-1003-6
GrundbücherThermoFisher
PropidiumjodSigmaP4864
PspXINew England BiolabsR0656S
PuromycinGibcoA11138-03
Qubit 3.0 FluorometerInvitrogenQ33216
Qubit HS DNA-AssayInvitrogenQ32851
R-50x3 Sterile BrunnenverarbeitungseinheitMaxCyteLM243882
T-Zell-Transact menschlichMiltenyi130-111-160T-Zell-Stimulationsreagenz
Bandstation HSD1000Agilent5067-5585
TEXMACSMiltenyi130-097-196T-Zell-Wachstumsmedium
Tris Puffer, 1,0 m, pH 8,0, molekularbiologische QualitätEMD Milipore648314
Wasser, für Molekularbiologie, DNAse-, RNAse- und Protease-freiThermoScientific327390010

Referenzen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
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CRISPR ScreeningCas9 EditingsgRNA BibliothekDurchflusszytometrieExtraktion genomischer DNARestriktionsenzymverdauSignalweg AnreicherungGenontologie

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