Wir präsentieren ein Protokoll zur Integration von Multiomics, Mendelscher Randomisierung, Einzelzell-Transkriptomik und strukturbasiertem Silico-Screening , um systematisch die Drebrin-Ähnliche (DBNL)-Makrophage-Achse bei Herzinsuffizienz zu definieren. Wir empfehlen DBNL als medikamentenfähiges immunmetabolisches Ziel.
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Forschungsartikel
Molekulare Mechanismen von DBNL bei Herzinsuffizienz: Vom Makrophagen-Immunstoffwechsel zu therapeutischen Implikationen
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Herzinsuffizienz (HF) bleibt eine große globale Gesundheitsherausforderung, mit begrenzten wirksamen Behandlungen, die auf die zentralen pathophysiologischen Mechanismen abzielen. In dieser Studie wurde ein integrierter Multiomics-Ansatz verwendet, der Mendelsche Randomisierung (MR) und Einzelzell-RNA-Sequenzierung (scRNA-seq) kombiniert, um potenzielle Biomarker und therapeutische Ziele für HF zu identifizieren. Wir nutzten Daten aus genomweiten Assoziationsstudien (GWASs), quantitativen Expressionsmerkmaleloci (eQTLs), methylierungsquantitativen Merkmalsloci (mQTLs) und quantitativen Proteinmerkmaleloci (pQTLs), um die genetischen Mechanismen von HF zu untersuchen. Eine Einzelzell-RNA-Sequenzierung wurde durchgeführt, um die Genexpression in kardialen Makrophagen zu analysieren, und Pseudozeitanalysen wurden verwendet, um die dynamische Regulation von DBNL während der Makrophagendifferenzierung zu untersuchen. Molekulare Andock- und Dynamiksimulationen identifizierten Pirinixsäure (WY-14643; PubChem CID: 4594; Synonyme: 50892-23-4; WY-14643) als potenziellen Regulator der DBNL. Die Multiomics-Analyse zeigte, dass DBNL (Drebrin-ähnlich) ein Schlüsselgen ist, das mit dem HF-Risiko assoziiert ist. Die Einzelzell-RNA-Sequenzierung zeigte, dass DBNL hauptsächlich in kardialen Makrophagen exprimiert wird und unter pathologischen Bedingungen hochreguliert wird. Die Expression von DBNL durch Makrophagen ist mit dem Immunstoffwechsel und profibrotischen Wegen verbunden, insbesondere mit den IL-6/JAK/STAT3-, PI3K/AKT/mTOR- und TGF-β-Signalwegen. Die Pseudozeitanalyse zeigte, dass DBNL einen dynamischen regulatorischen Effekt auf die Makrophagendifferenzierung hat, insbesondere bei chronischen Entzündungen. Molekulares Andocken und dynamische Simulationen haben gezeigt, dass Pyridinsäure eine potenzielle Rolle bei der Regulierung von DBNL spielt. Diese Studie erläutert die Rolle von DBNL im Fortschreiten der Herzinsuffizienz und legt ihr Potenzial als therapeutisches Ziel nahe. Wichtig ist, dass die therapeutische Relevanz aus rechnergestützten Vorhersagen abgeleitet wird. Diese Erkenntnisse bieten neuartige Einblicke in den Immunstoffwechsel und die makrophage-vermittelte interzelluläre Kommunikation und legen eine theoretische Grundlage für zukünftige Anwendungen bei der Optimierung von DBNL-gezielten Medikamenten und funktioneller Forschung. Dennoch sind weitere experimentelle Validierungen und präklinische Studien erforderlich, um die klinische Wirksamkeit von DBNL als therapeutisches Ziel zu belegen.
Einleitung
Herzinsuffizienz (HF) stellt eine bedeutende und wachsende globale Gesundheitsherausforderung dar, die Millionen von Menschen weltweit betrifft und erhebliche wirtschaftliche Belastungen für Gesundheitssysteme darstellt1. Daher besteht ein dringender Bedarf an wirksamen Interventionen bei der Behandlung von Herzinsuffizienz (HF).
Die komplexe Pathophysiologie der Herzinsuffizienz entsteht durch eine beeinträchtigte myokardiale Kontraktilität des linken Ventrikels, was zu einer Kaskade systemischer Komplikationen wie pulmonaler und peripherer Verstopfungführt. Die direkte Behandlung der grundlegenden pathophysiologischen Mechanismen, die dem Fortschreiten der Herzinsuffizienz zugrunde liegen, insbesondere der ungünstigen Myokardremodellierung, bleibt jedoch eine kritische und unerfüllte Herausforderung3. In den letzten Jahrzehnten hat das Gebiet der biomedizinischen Forschung einen erheblichen Paradigmenwechsel durchlaufen, der vor allem durch die Integration von Multiomik-Technologien und fortschrittlichen bioinformatischen Methoden ermöglicht wurde. Diese Werkzeuge bieten außergewöhnliche Möglichkeiten, neuartige Krankheitsbiomarker und therapeutische Ziele zu identifizieren. Mendelsche Randomisierung (MR), ein rigoroser genetisch-epidemiologischer Ansatz, verwendet Single-Nukleotid-Polymorphismen (SNPs) als instrumentelle Variablen, um kausale Zusammenhänge zwischen genetischer Exposition und klinischen Endpunktenzu schließen 4. Durch die Anwendung des methodischen Rahmens randomisierter kontrollierter Studien adressiert die Mendelsche Randomisierung (MR) effektiv die Probleme der Interferenz und der Umkehrkausalität, um robuste Belege für die Identifikation und Wiederverwendung von Arzneimittelzielen zu liefern. Parallel dazu zeigt die Einzelzell-RNA-Sequenzierung (scRNA-seq) Gewebeheterogenität mit unvergleichlicher Auflösung und bietet tiefgreifende Einblicke in zelltypspezifische Genexpression und interzelluläre Kommunikationsnetzwerke in komplexen Organen wiedem Herzen. Der Multiomics-Ansatz, der genetische, transkriptomische und proteomische Daten synthetisiert, bietet erhebliches Potenzial zur Aufklärung von Krankheitsmechanismen und zur Identifizierung therapeutischer Wege.
Trotz dieser technologischen Fortschritte bestehen erhebliche Wissenslücken hinsichtlich der spezifischen zellulären und molekularen Mechanismen, die Herzentzündungen und Umstrukturierungen bei Herzinsuffizienz antreiben. Zunehmende Belege deuten darauf hin, dass Immunzellen, insbesondere Makrophagen, entscheidend für die Koordination von Entzündungsreaktionen und der anschließenden Gewebeumbildung während der Myokardintumoren und chronischer Herzinsuffizienz sind, die wiederum für denKrankheitsverlauf entscheidend sind. Frühere Forschungen konzentrierten sich überwiegend auf breite entzündliche Mediatoren oder Zelloberflächenmarker, was zu einer erheblichen Lücke bei der Erforschung intrazellulärer regulatorischer Ziele innerhalb dieser entscheidenden Immunzellpopulationen führte. Darüber hinaus haben traditionelle genomweite Assoziationsstudien (GWASs) zahlreiche genetische Assoziationen im Zusammenhang mit Herzinsuffizienz identifiziert, sie stoßen häufig auf Schwierigkeiten, eindeutige kausale Beziehungen zu etablieren, was ihre Anwendbarkeit für direkte therapeutische Translation einschränkt7. Daher ist die Implementierung eines umfassenden multiomischen Mendelschen Randomisierungsrahmens (MR), der genetische Varianten einbezieht, die DNA-Methylierung (mQTLs), Genexpression (eQTLs) und Proteinhäufigkeit (pQTLs) beeinflussen, unerlässlich, um robustere kausale Inferenzen über mehrere biologische Regulationsschichten zu erzielen. Dieser Ansatz adressiert die inhärenten Einschränkungen von Single-Layer-QTL-Studien. Bemerkenswert ist, dass das Drebrin-ähnliche (DBNL) Protein Gegenstand umfangreicher Forschung im Kontext neuronaler Entwicklung und zytoskelettaler Dynamikist. Ihre funktionelle Bedeutung und therapeutisches Potenzial bei Herz-Kreislauf-Erkrankungen, insbesondere Herzinsuffizienz, sind jedoch weitgehend unerforscht. Diese erhebliche Lücke in unserem Verständnis erschwert die Betrachtung von DBNL als neuartiges und potenziell lebensfähiges Ziel für die Entwicklung von Medikamenten in der Behandlung von Herzinsuffizienz.
Um diese kritischen Wissenslücken zu schließen, zielt diese Studie darauf ab, Schlüsselgene, die kausal mit dem Herzinsuffizienzrisiko assoziiert sind, durch ein integriertes Multiomics-MR-Framework, das eQTL-, mQTL- und pQTL-Daten kombiniert, robust zu identifizieren. Diese Studie präsentiert einen neuartigen Ansatz, der die Integration von multiomischen Mendelschen Randomisierungsanalysen – einschließlich quantitativer Expressions-Loci (eQTLs), methylation-quantitative Trait-Loci (mQTLs) und Protein-quantitative Trait-Loci (pQTLs) – mit hochauflösenden Einzelzell-Transkriptomdaten (GSE161470) und Bulk-Transkriptomdaten (GSE161472) umfasst, um das DBNL-Gen systematisch als kritischen kausalen Risikofaktor für Herzinsuffizienz zu identifizieren. Diese Ergebnisse zeigen, dass DBNL überwiegend und spezifisch in kardialen Makrophagen exprimiert wird und dass sich seine Expression dynamisch im Verlauf ihres Differenzierungsprozesses verändert. Darüber hinaus verdeutlichen die Ergebnisse dieser Studie die entscheidende Rolle von DBNL bei der Modulation der kardialen Immunmikroumgebung und der Orchestrierung von herzinsuffizienzassoziierten immunmetabolischen Wegen wie der IL-6/JAK/STAT3-Signalkaskade sowie profibrotischen Signalwege. Darüber hinaus prognostiziert diese Forschung durch den Einsatz computergestützter biologischer Techniken, dass Pyridylsäure (WY-14643) ein Ligand mit hoher Affinität für DBNL ist, wodurch ein umfassender, multidimensionaler theoretischer Rahmen geschaffen wird, der die Einstufung von DBNL als neuartiges therapeutisches Ziel für Herzinsuffizienz unterstützt und die Entwicklung gezielter pharmakologischer Interventionen erleichtert. Mit Einzelzell-RNA-Sequenzierung charakterisierten wir die zellspezifische Expression und die funktionellen Wege des Schlüsselgens DBNL, das im kardialen Mikroumfeld identifiziert wurde, und untersuchten die Rolle von DBNL in immunmetabolischen und profibrotischen Signalwegen sowie in der Zell-Zell-Kommunikation zwischen kardialen Zelltypen. Potenzielle kleinmolekulare Liganden für DBNL wurden durch computergestütztes molekulares Andocken und molekulardynamische Simulationen identifiziert. Wir vermuten, dass DBNL, das hauptsächlich in kardialen Makrophagen exprimiert wird, einen kausalen Einfluss auf das Fortschreiten der Herzinsuffizienz hat, indem es immunmetabolische Signalwege und interzelluläres Crosstalk reguliert. Zusammenfassend haben wir durch die Integration fortschrittlicher multiomischer Mendelscher Randomisierung mit hochauflösender Einzelzellanalyse systematisch neuartige therapeutische Ziele für Herzinsuffizienz identifiziert und charakterisiert sowie potenzielle Kleinmolekülmodulatorziele erforscht.
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Protokoll
Datendownload
Genexpressionsdaten
Die in der vorliegenden Studie verwendeten Einzelzell-RNA-Sequenzierungsdaten (scRNA-seq) stammen aus dem Gene Expression Omnibus (GEO)-Repository, das vom National Center for Biotechnology Information (NCBI) (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/) betrieben wird, speziell aus dem Datensatz mit der Accessibilitätsnummer9 GSE161470 (menschliches Herzgewebe bestehend aus vier Kontrollproben und einer pathologischen Probe). Dieser Datensatz wurde ursprünglich 2022 von Zhang et al. veröffentlicht. Das Hauptziel der ursprünglichen Untersuchung war es, die zelluläre Heterogenität und molekulare Regulationsmechanismen im menschlichen Herzgewebe unter Herzinsuffizienzbedingungen zu untersuchen. Für die aktuelle Analyse wurden fünf Proben aus diesem Datensatz ausgewählt, die jeweils umfassende Einzelzellexpressionsprofile aus menschlichem Herzgewebe enthalten. Der andere in dieser Studie verwendete Datensatz wurde ebenfalls aus dem öffentlichen NCBI GEO-Repository bezogen, insbesondere die Series Matrix File mit der Zugangsnummer GSE161472, begleitet von der Annotationsdatei GPL11154. Das Expressionsprofil umfasst insgesamt 84 Proben, darunter 37 Kontrollproben und 47 Krankheitsproben. Diese Forschung umfasst eine integrative Multiomik-Analyse, bei der alle Untersuchungen mit öffentlich zugänglichen Daten durchgeführt werden.
eQTL-Daten
Die eQTL-Daten, die vom eQTLGen-Konsortium gewonnen wurden, konzentrieren sich darauf, den genetischen Rahmen der Genexpression im Blut und die genetischen Faktoren zu klären, die komplexe Merkmale beeinflussen3. Das Konsortium befindet sich derzeit in der zweiten Phase seines umfangreichen Projekts und führt Metaanalysen von genomweiten Daten zur Blutgenexpression durch.
Expositionsdaten – mQTLs
Die mQTL-Daten stammen aus einer veröffentlichten Metaanalyse der europäischen (EUR) Kohorte, die die Methylierung von Vollblut-DNA im genetischen Rahmen von 3.701 Proben aus Populationen europäischer Abstammung11 untersucht. Der Datensatz enthielt Informationen zu 426.636 mQTL-Merkmalen.
Expositionsdaten-pQTL
Plasma-pQTL-Daten wurden aus der deCODE-Datenbank (https://www.decode.com/summarydata/)4 gewonnen. Diese Studie nutzte die 2021 veröffentlichte Daten des deCODE pQTL-Datensatzes, der eine genomweite Assoziationsstudie (GWAS) der Plasmaproteinspiegel umfasste, gemessen mit 4.907 Aptamere in einer Kohorte von 35.559 Personen europäischer Abstammung.
Ergebnisdaten
Zusammenfassungsstatistiken für Herzinsuffizienz wurden aus einer groß angelegten genomweiten Assoziationsstudie (GWAS) gewonnen, die hauptsächlich Teilnehmer europäischer Abstammung einbezog und über die Datenbank des European Bioinformatics Institute (EBI) (GCST90162626) abgerufen wurde. Der Datensatz zur Herzinsuffizienz umfasste 115.150 Fälle und 1.550.331 Kontrollpersonen. Der GWAS-Katalog, der Publikationen, führende Verbände und detaillierte Zusammenfassungsstatistiken umfasst, bietet derzeit Daten, die auf die Genome Assembly und den dbSNP Build abgebildet sind.
Mendelsche Randomisierungsanalyse von mQTLs, eQTLs und pQTLs
Um systematisch die potenziellen kausalen Zusammenhänge zwischen Genexpression, Proteinhäufigkeit, DNA-Methylierungsniveaus und dem Risiko einer Herzinsuffizienz zu untersuchen, wurden Mendelsche Randomisierungsanalysen (MR) unter Verwendung von Expression quantitative Trait Loci (eQTLs), Protein quantitative Trait Loci (pQTLs) und methylation quantitative trait loci (mQTLs) durchgeführt. Während der Vorverarbeitungsphase der Expositionsdaten wurden Einzelnukleotid-Polymorphismen (SNPs), die mit jeder Expositionsvariable (Gen, Protein oder Methylierungsstätte) verbunden sind, mit einer genomweiten Signifikanzschwelle von P < 1 × 10⁻⁵ aus den jeweiligen Datenbanken extrahiert, um als initiale Kandidateninstrumentvariablen (IVs) zu dienen. Anschließend wurde für die IVs jedes Expositionsfaktors eine Linkage-Disequilibrium-(LD-Clumping) durchgeführt, wobei eine Fenstergröße von 10.000 Kilobasen (kb) und eine LD-R²-Schwelle von 0,001 verwendet wurde, um die Unabhängigkeit der Instrumente zu gewährleisten. Diese ausgewählten IVs wurden anschließend mit zusammenfassenden Statistiken aus einer Herzinsuffizienz-Genom-Assoziationsstudie (GWAS; ID: GCST90162626) durch Anwendung der read_outcome_data-Funktion, wobei nur jene SNPs behalten werden, die einen Assoziationswert P unter 5×10⁻⁵ im Ergebnisdatensatz aufweisen. Um schwache Instrumentenverzerrung zu mindern, wurde die F-Statistik für jede IV als F = (β_exposure/SE_exposure)² berechnet, und in die folgenden Analysen wurden nur Instrumente mit F > 10 einbezogen. Für die kausale Effektschätzung wurde die Allelausrichtung zwischen Expositions- und Ergebnisdatensätzen mit der harmonize_data-Funktion des TwoSampleMR-Pakets durchgeführt. MR-Analysen wurden anschließend mit vier komplementären statistischen Ansätzen durchgeführt: (1) der inversen Varianz-gewichteten (IVW)-Methode, die Metaanalysen von Wald-Ratio-Schätzungen über SNPs hinweg liefert; (2) MR-Egger-Regression, die die gerichtete Pleiotropie durch die Einbeziehung eines Interzeptionsterms unter der Annahme Instrument Strength Independent of Direct Effect (InSIDE) berücksichtigt; (3) die gewichtete Medianmethode, die konsistente kausale Schätzungen liefert, selbst wenn bis zu 50 % der Instrumente ungültig sind; und (4) die gewichtete Methode, die den häufigsten Cluster der kausalen Effektschätzung identifiziert und eine verbesserte statistische Stärke sowie einen reduzierten Typ-I-Fehler im Vergleich zu MR-Egger bietet. In Fällen, in denen nur eine einzige instrumentelle Variable verfügbar war, wurde ausschließlich die Wald-Verhältnis-Methode angewandt. Um die Robustheit der Ergebnisse zu bewerten, wurden umfassende Sensitivitätsanalysen durchgeführt, darunter Heterogenitätstests mittels der mr_heterogeneity-Funktion, Pleiotropiebewertung mit mr_pleiotropy_test und Leave-One-Out-Analysen, die über die mr_leaveoneout-Funktion implementiert werden, wobei jedes SNP iterativ ausgeschlossen wird, um den Einfluss einzelner Varianten auf die Gesamtergebnisse zu bestimmen. Bedeutende Assoziationen wurden mit grafischen Werkzeugen wie mr_scatter_plot und mr_forest_plot visualisiert. Diese analytische Pipeline wurde einheitlich über die eQTL-, pQTL- und mQTL-Datensätze angewendet, um während der gesamten Studie eine methodische Konsistenz zu gewährleisten.
Kolokalisierungsanalyse
Eine Kolokalisationsanalyse wurde mittels der Coloc-Methode, eQTL-Zusammenfassungsdaten und einer GWAS der Herzinsuffizienzdurchgeführt. Der Index-Single-Nukleotid-Polymorphismus (SNP) wurde verwendet, um die posteriore Wahrscheinlichkeit innerhalb eines 100-kb-Klumpingfensters zu berechnen. In der Kolokalisationsanalyse (Koloc) bezeichnet Hypothese H3 die posteriore Wahrscheinlichkeit, dass die beiden Merkmale, nämlich Genexpression und Herzinsuffizienz, korreliert, aber unterschiedliche kausale Varianten aufweisen. Umgekehrt zeigt die Hypothese H4 die posteriore Wahrscheinlichkeit an, dass die Verbindung zwischen den beiden Eigenschaften auf eine einzige, gemeinsame kausale Variante zurückzuführen ist. Eine Schwelle für SNP. PP. H4 größer als 0,90 wurde zur Bestimmung der Kolokalisation verwendet.
Immuninfiltration
Die CIBERSORT-Methode ist eine weit verbreitete Methode zur Bewertung von Immunzelltypen im Mikroumfeld12. Durch Anwendung von Unterstützungsvektorregressionsprinzipien kann eine Dekonvolutionsanalyse der Expressionsmatrix von Immunzellsubtypen durchgeführt werden. Durch die Einbeziehung von 547 Biomarkern kann CIBERSORT 22 Phänotypen menschlicher Immunzellen differenzieren, darunter T-Zellen, B-Zellen, Plasmazellen und verschiedene myeloide Zellsubpopulationen. Unter Verwendung des GSE161472-Datensatzes wurde eine Analyse durchgeführt, die den CIBERSORT-Algorithmus in Verbindung mit seiner integrierten LM22-Signaturmatrix verwendet, die die Genexpressionsprofile von 22 verschiedenen menschlichen Immunzelltypen charakterisiert. Die Infiltrationsniveaus dieser 22 Immunzellpopulationen wurden für jede einzelne Probe quantifiziert. Anschließend wurde die cor.test-Funktion angewandt, um die Korrelationen zwischen der Expression von Schlüsselgenen und den entsprechenden Infiltrationsniveaus der Immunzellen zu bewerten.
Datenverarbeitung und Qualitätskontrolle der Einzelzell-RNA-Sequenzierung
Die Einzelzell-Expressprofildaten wurden mit dem Seurat (V4.3.0)-Paket in der R (V4.3.0)-Umgebung6 verarbeitet. Diese Studie nutzte einen konventionellen Workflow zur Analyse von Einzelzell-RNA-Sequenzierungsdaten. Anfangs wurden die Ausdrucksprofile mit dem Seurat-Paket importiert. Die Zellen wurden anhand mehrerer Qualitätskennzahlen gefiltert, darunter die gesamte UMI-Anzahl jeder Zelle, die Anzahl der exprimierten Gene, der Anteil der mitochondrialen Lesungen und der Anteil der ribosomalen Lesungen. Ausreißer wurden als Werte identifiziert, die um mehr als drei mittlere absolute Abweichungen (MAD) vom Median abweichen. Die spezifischen Filterschwellenwerte waren wie folgt: nFeature_RNA ≥ 200, percent.mt ≤ 2,15718, nFeature_RNA ≤ 2840,941 und nCount_RNA ≤ 5194,27. Typischerweise wurden Zellen mit übermäßig hohen Gesamt-UMI-Zahlen und der Anzahl exprimierter Gene als Doublets klassifiziert, während Zellen mit erhöhten Prozentsätzen an mitochondrialen oder ribosomalen Werten als von geringer Qualität gelten und möglicherweise Apoptose oder Fragmentierung durchlaufen. Nach diesen Filterschritten wurde DoubletFinder (Version 2.0.4) eingesetzt, um Doublets aus jeder Probe einzeln zu identifizieren und zu entfernen, wodurch der Qualitätskontrollprozess der Zellen abgeschlossen wurde. Anfangs wurde die Datennormalisierung mit der Funktion normalizeData durchgeführt. Der Zellzyklusstatus wurde anschließend mittels der CellCycleScoring-Funktion bewertet, und hochvariable Gene wurden mit der FindVariableFeatures-Methode identifiziert. Der Datensatz wurde anschließend mit ScaleData skaliert, um die Daten zu standardisieren und den Einfluss von mitochondrialen Genen, Ribosomgenen und Effekten des Zellzyklus auf nachgelagerte Analysen abzumildern. Die Reduktion der linearen Dimensionalität wurde mittels Hauptkomponentenanalyse (PCA) mittels der RunPCA-Funktion durchgeführt, wobei bedeutende Hauptkomponenten für weitere Analyse ausgewählt wurden. Um Batch-Effekte über verschiedene Samples hinweg zu adressieren, wurde der Harmony-Algorithmus (Version 1.1.0) verwendet. Dieser Ansatz clustert iterativ ähnliche Zellen aus unterschiedlichen Chargen innerhalb des PCA-Raums, während die Batch-Diversität innerhalb der Cluster erhalten bleibt. Angesichts der relativ milden Batch-Effekte, die im Datensatz beobachtet wurden, wurden Standardparameter (θ = 2) angewendet. Die nichtlineare Dimensionsreduktion wurde anschließend mit RunUMAP durchgeführt, gefolgt von der Erstellung eines Zellnachbarschaftsgraphen über FindNeighbors und Zellclustering über FindClusters. Für die Annotation von Zelltypen wurde ein hierarchisches Annotationsrahmen implementiert: Die primäre manuelle Annotation basierte auf charakteristischen Genexpressionsmustern, die durch die CellMarker-Datenbank und die relevante Literatur beeinflusst wurden; dies wurde durch automatisierte Annotationsergebnisse ergänzt, die aus der SingleR-Software als Referenz gewonnen wurden. Um die Genauigkeit und Vollständigkeit der Zelltypidentifikation weiter zu erhöhen, wurden mehrere autoritative Datenbanken, darunter der Human Primary Cell Atlas (HPCA), BlueprintEncode, MonacoImmune, DatabaseImmuneCell und NovershternHaematopoietic, konsultiert. Die Zellannotation erfolgte durch Abfrage der CellMarker (http://117.50.127.228/CellMarker/CellMarkerBrowse.jsp)-Datenbank und die Überprüfung der Literatur, unterstützt durch automatisierte Annotationsunterstützung durch die SingleR (V2.4.0) Software13. Es zielt darauf ab, die Zelltypen im entsprechenden Gewebe und deren zugehörige Markergenezu identifizieren.
Analyse der Ligand-Rezeptor-Interaktionen
In dieser Studie wurde CellCall (Version 1.0.7) verwendet, um eine umfassende Analyse interzellulärer Kommunikationsnetzedurchzuführen. Durch die Verwendung von Zelltyp-Annotationen, die aus Seurat abgeleitet wurden, zusammen mit der Rohzählmatrix wurde ein normalisiertes Analyseobjekt mit Parametern konstruiert, die für das menschliche Genom konfiguriert sind. Die TransCommuProfile-Funktion wurde angewandt, um die Stärke von Zell-Zell-Interaktionen mittels eines gewichteten Algorithmus zu quantifizieren, wobei eine Signifikanzschwelle mit einem p-Wert < 0,05 implementiert wurde, um zuverlässige Liganden-Rezeptor-Paare zu identifizieren. Die signifikanten Interaktionspaare wurden anschließend einer KEGG-Signalweganreicherungsanalyse mittels der getHyperPathway-Funktion unterzogen, und die Beziehungen zwischen Zelltypen und Signalwegen wurden mit Blasendiagrammen illustriert. Das gesamte Kommunikationsnetzwerk wurde letztlich durch eine kreisförmige Darstellung dargestellt, in der acht verschiedene Farben verschiedene Zelltypen anzeigten. Wechselwirkungsstärke und -richtung wurden durch Pfeilmerkmale dargestellt, was eine detaillierte Charakterisierung der interzellulären Signaldynamik ermöglichte.
Pseudozeitanalyse
Um die dynamische transkriptionelle Regulation von Makrophagen während des Verlaufs der Herzinsuffizienz zu untersuchen, nutzte diese Studie den Monokel-Algorithmus, um Pseudozeitanalysen an Makrophagen-Subpopulationen durchzuführen. Die Genexpressionsmatrix, die den Zielzell-Subpopulationen entspricht, wurde extrahiert, um Einzelzell-Trajektorienanalyseobjekte zu konstruieren, bei denen hochvariable Gene als Ordnungsmerkmale ausgewählt werden. Durch Anwendung der DDRTree-Dimensionsreduktionstechnik wurden Zellen auf einen zweidimensionalen Raum abgebildet, um die Differenzierungsbahn zu rekonstruieren. Visualisierungsanalysen wurden durchgeführt, um die Verteilung der Zellen entlang der Pseudozeitachse zu bestimmen und Gene zu identifizieren, deren Expression sich über die Pseudozeit signifikant verändert hat. Nachfolgende Analysen konzentrierten sich auf das Schlüsselgen DBNL und charakterisierten dessen Expressionsdynamik entlang der Zelltrajektorie, wobei die transkriptionellen Reprogrammiermechanismen der Makrophagen während des Progressions der Herzinsuffizienz16 aufleuchteten.
Gen-Set-Anreicherungsanalyse (GSEA)
In dieser Studie wurde ein GSEA-Ansatz verwendet, um die regulatorischen Mechanismen zu erläutern, die mit Schlüsselgenen verbunden sind, die an Herzinsuffizienz beteiligt sind. Unter Verwendung zuvor identifizierter Schlüsselgene wurden die Proben anhand des medianen Expressionswerts in Hoch- und Niedrigexpressionskohorten stratifiziert. Eine differentielle Expressionsanalyse wurde unter Verwendung des Limma-Pakets durchgeführt, bei der eine gerankte Genliste entsprechend der Log-Fold-Veränderung (logFC) erstellt wurde. Die anschließende KEGG-Signalweganreicherungsanalyse wurde mit dem clusterProfiler-Tool durchgeführt, wobei Gensets aus der MsigDB-Datenbank als Referenzhintergrund dienten. Der GSEA-Algorithmus wurde dann angewandt, um Signalwege zu identifizieren, die zwischen den beiden Expressionsgruppen signifikant angereichert waren, und ein angepasster p-Wert-Schwellenwert von weniger als 0,05 wurde verwendet, um die statistische Signifikanz zu bestimmen. Um die regulatorischen Funktionen der Kerngene innerhalb kritischer Signalwege zu veranschaulichen, wurden verschiedene Visualisierungstechniken verwendet, darunter Multipathway-GSEA-Plots und kreisförmige Netzwerkdiagramme.
Gen-Satz-Variationsanalyse (GSVA)
GSVA ist ein nichtparametrischer, unüberwachter Ansatz, der zur Bewertung der Genanreicherung innerhalb von transkriptomischen Daten verwendet wird. Diese Methode verwandelt Gen-Niveau-Variationen in Weg-Niveau-Variationen, indem sie zusammengesetzte Werte für spezifische Gensätze berechnet und so die Bewertung biologischer funktioneller Veränderungen über verschiedene Proben erleichtert. In der vorliegenden Studie wurden Gensätze aus der Molecular Signatures Database bezogen. Der GSVA-Algorithmus wurde verwendet, um für jeden Gensatz zusammengesetzte Werte zu berechnen, was die Bewertung potenzieller biologischer funktioneller Veränderungen in verschiedenen Proben ermöglichte. Die Ergebnisse der GSVA-Anreicherungsanalyse sind im ergänzenden Material (ergänzende Tabelle 1) bereitgestellt.
CTD-Arzneimittelvorhersage
Das Zielgen (DBNL) wurde in das Suchfeld der Comparative Toxicogenomics Database (CTD) eingegeben, die Krankheitskategorie "Herz-Kreislauf-Erkrankung" ausgewählt und die Abfrage durchgeführt, um Arzneimittelvorhersagedaten für die Erkrankung "Herzinsuffizienz" abzurufen. Die erhaltenen Vorhersageergebnisse wurden anschließend in die Cytoscape-Software importiert, um die Datenvisualisierung zu erleichtern und den Aufbau einer Gen-chemischen Interaktionsnetzwerkkarte zu ermöglichen.
Molekulare Andockmethoden
Aufgrund der ungelösten dreidimensionalen Kristallstruktur des menschlichen DBNL-Proteins (UniProt ID: Q9UJU6) sagte diese Studie die dreidimensionale Struktur von DBNL auf Basis von AlphaFold317 voraus. Pirinixsäure (WY-14643) steht zum Download aus der PubChem-Datenbank (PubChem CID: 5694) zur Verfügung. Anschließend wurde die Proteinstruktur mit der MGLTools-Software (Version 1.5.7)18 vorverarbeitet, einschließlich Schritten wie der Zugabe von Wasserstoffatomen. Gleichzeitig wurden Proteine und kleine Moleküle in das für das Andocken erforderliche PDBQT-Format umgewandelt. Die AutoDock Vina-Software (Version 1.1.2)19 wurde für das globale molekulare Andocken (Exogenizität=16, num_modes=30) verwendet, um potenzielle Bindungsmodi zu erforschen. Nach Abschluss der Andockberechnungen sollte die komplexe Konformation mit der höchsten Affinität, angezeigt durch die niedrigste Bindungsfreienergie, als Anfangsstruktur für nachfolgende Molekulardynamik-Simulationen ausgewählt werden.
Methode der Molekulardynamik-Simulation
Um systematisch die Bindungsstabilität und Wechselwirkungsmechanismen zwischen Kandidatenverbindungen und Proteinen zu untersuchen, wurden konventionelle Molekulardynamik-(MD)-Simulationen mit dem GROMACS-Softwarepaket (Version 2024.03)20 durchgeführt. Die Proteinparameter wurden mit dem Amber14SB-Kraftfeld21 erzeugt, das Wassermolekülmodell mit dem TIP3P-Modell22, und die Ligandentopologieparameter wurden mit dem Antechamber Python Parser Interface (ACPYPE)-Tool generiert, das auf dem General Amber Force Field (GAFF) basiert. Das Liganden-Protein-Komplexsystem befand sich anschließend in einer periodischen Randoktaederbox, die mit TIP3P-Wassermolekülen gefüllt war. Natrium- (Na⁺) und Chloridionen (Cl⁻) wurden eingebracht, um eine Konzentration von 0,15 mol/L zu erreichen und die Gesamtladung des Systems zu neutralisieren. Nach Abschluss des Systembaus bestand der erste Schritt darin, die Energie mit der steilsten Abstiegsmethode auf 50.000 Stufen zu minimieren, mit dem Ziel, potenziell unangemessene Konformierungen innerhalb der Struktur zu eliminieren. Anschließend wurden zwei Phasen der Systemausgleichung durchgeführt: eine 100 ps NVT (konstante Partikelanzahl, Volumen und Temperatur) Simulation, gefolgt von einer 100 ps NPT (konstante Partikelanzahl, Druck und Temperatur) Simulation. Während dieser Simulationen wurden Positionsbeschränkungen auf die schweren Atome des Proteinrückgrats angewendet, um die strukturelle Integrität des Proteins zu erhalten. Die Temperatur wurde mit dem V-Rescale-Thermostat bei 300 K gehalten, und der Druck wurde durch den Einsatz des Parrinello-Rahman-Barostats für die Druckkupplung auf 1 bar geregelt. Nach Abschluss der Gleichgewichtsphase wurde eine Produktionsphasensimulation von 100 Nanosekunden durchgeführt, während der alle Positionsbeschränkungen beseitigt wurden. Die Trajektorie wurde mit einem Zeitschritt von 2 Femtosekunden integriert, und die Partikel-Mesh-Ewald-(PME)-Methode wurde eingesetzt, um die elektrostatische Wechselwirkungen über große Reichweite präzise zu steuern. Die Trajektorie wurde alle 10 PS gespeichert, und insgesamt wurden 10.000 Bilder für die spätere Analyse ausgegeben. Zusätzlich wurden stabile Trajektorien im 90-100-ns-Intervall aus der Simulation extrahiert, und die Bindungsfreienergie von Ligandenproteinkomplexen wurde mit dem GMX MMPBSA-Werkzeug23 berechnet.
Statistische Analyse
Die Validität dieser Mendelschen Randomisierungsanalyse (MR) hängt von drei grundlegenden Annahmen ab. (1) Relevanz: Die instrumentellen Variablen (IVs) müssen eine starke Verbindung zur Exposition aufweisen. (2) Unabhängigkeit: Die IVs müssen unabhängig von etwaigen Störfaktoren sein, die sowohl die Exposition als auch das Ergebnis beeinflussen. (3) Ausschlussbeschränkung: Die IVs sollten das Ergebnis ausschließlich durch ihren Einfluss auf die Exposition beeinflussen. Ein Verstoß gegen diese Annahme, bei dem ein IV das Ergebnis über Wege beeinflusst, die nicht die Exposition betreffen, wird als horizontale Pleiotropie bezeichnet. Alle statistischen Analysen wurden mit R-Version 4.3.0 durchgeführt, mit beidseitigen Tests, und ein p-Wert von weniger als 0,05 wurde allgemein als Indikator für statistische Signifikanz angesehen.
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Ergebnisse
Identifikation von DBNL als Gen, das mit dem Herzinsuffizienzrisiko assoziiert ist, durch Mendelsche Randomisierung und Kolokalisationsanalyse
Der Ergebnisbezeichner für herzinsuffizienzbezogene Stichproben, GCST90162626, wurde aus dem zusammenfassenden Statistikdatensatz gewonnen. Kausale Beziehungen zwischen 1.247 Paaren von quantitativen Expressionsmerkmaleloci (eQTLs) und Endergebnissen wurden unter Verwendung der Funktionen extract_instruments und extract_outcome_data bestimmt (Ergänzende...
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Diskussion
Obwohl Entzündungen einen grundlegenden Aspekt der Pathophysiologie der Herzinsuffizienz (HF) darstellen, konzentrierten sich frühere Untersuchungen überwiegend auf generalisierte Entzündungsmediatoren und Zelloberflächenmarker 17,18,24. Dieser Fokus hat die Aufklärung der spezifischen zellulären Mechanismen eingeschränkt. Um diese Einschränkungen zu überwinden, nutzten wir einen integrativen An...
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Offenlegungen
Die Autoren erklären, dass sie keine konkurrierenden Interessen haben.
Danksagungen
Dieses Forschungsprogramm wurde unterstützt von der Zhejiang Provincial Natural Science Foundation of China (LTGY24H020001), dem Projekt für Wissenschaft und Technologie zur traditionellen chinesischen Medizin in der Provinz Zhejiang (2023ZR131, 2023ZL158), dem Ningbo Public Welfare Key Project (2024S030), dem Key Technology F&E-Programm von Ningbo (2022Z149), dem Key Laboratory of Precision Medicine for Atherosclerotic Diseases der Provinz Zhejiang (2022E10026), und das Sonderfondsprojekt für klinische medizinische Forschung der Zhejiang Medical Association (2021ZYC-A11).
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Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| CellMarker-Datenbank | Harbin Medizinische Universität (CellMarker 2.0) | http://bio-bigdata.hrbmu.edu.cn/CellMarker/ | CellMarker-Datenbank; Zur Abfrage von Gewebe-/Zelltypmarker-Genen während der Einzelzellannotation |
| Vergleichende Toxikogenomik-Datenbank (CTD) | CTD (Duke University et al.) | http://ctdbase.org/ | CTD-Datenbank; Zum Abrufen von Wechselwirkungen zwischen Chemikalien, Genen, Phänotypen und Krankheiten, die zur Arzneimittelvorhersage verwendet werden |
| deCODE Plasma pQTL Datensatz (2021, 4.907 Aptämere, 35.559 europäische Proben) | deCODE-Genetik | https://www.decode.com/summarydata/ | pQTL-Datenveröffentlichung 2021; Verwendung als pQTL-Expositionsdaten für MR-Analysen |
| eQTLGen Vollblut-eQTL-Daten | eQTLGen-Konsortium | https://www.eqtlgen.org/ | eQTLGen Phase I/II (spezifische Version je nach Einsatz); Verwendet als eQTL-Expositionsdaten für MR- und Kolokalisationsanalysen |
| GEO Single-Cell RNA-seq Dataset GSE161470 (Menschliches Herzgewebe: 4 Kontrollstücke + 1 pathologische Probe) | NCBI Genexpressionsomnibus (GEO) | https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc=GSE161470 | GSE161470; Erfassung von Einzelzell-RNA-Sequenzierungsdaten menschlichen Herzgewebes für eine nachgelagerte Analyse |
| GWAS-Katalog | NHGRI– EBI | https://www.ebi.ac.uk/gwas/ | GWAS-Katalog; Um HF-bezogene GWAS-Informationen, Annotationen und Hilfsanalysen abzurufen |
| Zusammenfassung von GWAS-Statistiken zur Herzinsuffizienz (GCST90162626) | NHGRI– EBI GWAS Katalog | https://www.ebi.ac.uk/gwas/studies/GCST90162626 | Studienzugang: GCST90162626; Verwendet als Ergebnisdaten für MRT- und Kolokalisationsanalysen |
| Molekulare Signaturdatenbank (MSigDB) v7.0 | Broad Institute | https://www.gsea-msigdb.org/gsea/msigdb | MSigDB v7.0; Für GSEA/GSVA-Hintergrundgensets und Signalwegannotationen |
| Pirinixsäure (WY-14643) Strukturdaten (PubChem) | NCBI PubChem | https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/compound/5694 | PubChem CID: 5694; Verwendet zur Gewinnung von Liganden-3D-Strukturen für molekulare Andockungen und Dynamiksimulationen |
| UniProt-Proteindatenbank (DBNL, UniProt ID: Q9UJU6) | UniProt-Konsortium | https://www.uniprot.org/uniprot/Q9UJU6 | UniProt: Q9UJU6; Verwendet zur Ermittlung der Aminosäuresequenz von DBNL für Strukturvorhersage und Andocken |
| Vollblut-mQTL-Metaanalyse (Ref 11, 3.701 europäische Proben, 426.636 mQTL-Merkmale) | Autoren / Konsortium (laut deiner Referenz 11) | Der Autor wird auf Hinzufügen der ursprünglichen Datenbank-URL / DOI ausgesprochen | Referenz DOI oder Datensatz-ID; Verwendet als mQTL-Expositionsdaten für MR-Analysen |
Referenzen
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