Entzündungshemmende Wirkung von Sesquiterpen-Lactonen aus Eupatorium lindleyanum DC. in Nagetiermodellen

Zusammenfassung

Diese Studie zeigt, dass Sesquiterpen-Laktone aus Eupatorium lindleyanum DC. (SLEL) bewirken signifikante entzündungshemmende Effekte in xylol-induzierten Maus-Ohrödemen und carrageen-induzierten Rattenpfotenödem-Modellen, indem sie histopathologische Schäden lindern, die Zytokinfreisetzung reduzieren und die Aktivierung der NF-κB-Signale hemmen.

Zusammenfassung

Akute Entzündung ist ein grundlegender pathologischer Prozess, der an vielen immunbezogenen Erkrankungen beteiligt ist. Eupatorium lindleyanum DC., ein traditionelles Heilkraut, ist reich an Sesquiterpen-Lactonen (SLEL), die pharmakologisch aktiv sind; ihre entzündungshemmenden Wirkungen und die damit verbundenen molekularen Veränderungen sind jedoch unvollständig charakterisiert. In dieser Studie wurden akute Entzündungsreaktionen in einem xylenguzuzierten Mausorohrödemmodell und einem Carrageen-induzierten Rattenpfotenödemmodell induziert. Gewebeverletzungen und entzündliche Infiltration wurden mittels Hämatoxylin- und Eosin-Färbung beurteilt. Die Spiegel proinflammatorischer Zytokine (TNF-α, IL-6 und IL-1β) wurden im Serum mittels ELISA quantifiziert, und ihre transkriptionelle Expression in entzündeten Geweben wurde mittels quantitativer PCR (qPCR) analysiert. Veränderungen in NF-κB-Signalweg-assoziierten Proteinen, einschließlich phosphoryliertem IκBα und p65, wurden mittels Western-Blotting untersucht. Die SLEL-Behandlung reduzierte Ohr- und Pfotenödem und linderte histopathologische Merkmale akuter Entzündungen, einschließlich Gewebeödem, entzündlicher Zellinfiltration und Gefäßverstopfung. Parallel dazu war die Verabreichung von SLEL mit einer verringerten Serumspiegel und Gewebe-mRNA-Expression von Tnf-α, Il-6 und Il-1β verbunden. Die Western-Blot-Analyse zeigte eine reduzierte Phosphorylierung von IκBα und p65 in entzündeten Geweben nach der SLEL-Behandlung, was auf eine Modulation der NF-κB-bezogenen Signalereignisse hinweist. Zusammen zeigen diese Ergebnisse einen experimentellen Arbeitsablauf zur Bewertung der entzündungshemmenden Wirkung von SLEL in akuten Entzündungsmodellen und legen nahe, dass seine Effekte mit einer verminderten proinflammatorischen Zytokinexpression und veränderter NF-κB-Signalweg-bezogener Signalübertragung verbunden sind.

Einleitung

Entzündung ist eine komplexe Abwehrreaktion, die durch pathogene Invasionen oder Gewebeverletzungen ausgelöst wird und eine entscheidende Rolle bei der Begrenzung von Infektionen, der Beseitigung schädlicher Reize und der Förderung der Gewebereparatur^{spielt 1}. Während kontrollierte Entzündungsreaktionen für die Aufrechterhaltung der Gewebehomöostase unerlässlich sind, kann übermäßige oder anhaltende Entzündungen zu Gewebeschäden, Organfunktionsstörungen und dem Fortschreiten chronischer Krankheiten führen. Klinisch ist die Entzündung durch Rötung, Schwellung, Hitze und Schmerzen gekennzeichnet und kann in schweren Fällen zu systemischen pathologischen Reaktionen führen. Zunehmende Evidenz hat eine dysregulierte Entzündung mit der Entwicklung von Krebs, Herz-Kreislauf-Erkrankungen und Autoimmunerkrankungenⁱⁿ Verbindung ^gebracht.

Nichtsteroidale Antirheumatika (NSAR) sind derzeit die am weitesten verbreiteten Mittel zur Entzündungsbehandlung. Trotz ihrer Wirksamkeit bei der Symptomlinderung ist die langfristige Verwendung von NSAR häufig mit Nebenwirkungen verbunden, darunter Magen-Darm-Reizungen, Überempfindlichkeitsreaktionen und Hepatotoxizität⁴, die ihre klinische Anwendbarkeit einschränken. Daher wächst das Interesse daran, alternative entzündungshemmende Mittel mit verbesserten Sicherheitsprofilen zu identifizieren. Naturprodukte, einschließlich traditioneller Kräutermedizin, wurden als potenzielle Quellen bioaktiver Verbindungen mit immunmodulatorischen Eigenschaften untersucht. Verallgemeinerte Behauptungen hinsichtlich niedriger Toxizität oder systemischer regulatorischer Funktionen sollten jedoch vorsichtig interpretiert werden und eine experimentelle Validierung in definierten Krankheitsmodellen⁵ erfordern.

Eupatorium lindleyanum DC. ist eine traditionelle Heilpflanze, deren charakteristische Phytochemikalien Sesquiterpen-Lactone umfassen, hauptsächlich Guaianolid- und Eudesmanolid-Typ-Verbindungen, sowie Germacranolide und Xanthanolide⁶. Extrakte von Eupatorium lindleyanum DC. Es wurde berichtet, dass sie in verschiedenen experimentellen Umgebungen lipidsenkende, antiatherosklerotische, antitumorale und entzündungshemmende Wirkungen zeigen⁶. Insbesondere Ethanolextrakte von Eupatorium lindleyanum DC. Schützende Effekte in Lipopolysaccharid-(LPS)-induzierten akuten Lungenverletzungsmodellen⁷ gezeigt. Die entzündungshemmende Aktivität von SLEL und seine Effekte in klassischen akuten Entzündungsmodellen sind jedoch weiterhin unzureichend charakterisiert.

Um diese Lücke zu schließen, verwendeten wir zwei komplementäre akute Entzündungsmodelle: Xylen-induziertes Ohrödem bei Mäusen, das schnelle neurogene und vaskuläre Entzündungsreaktionen erfasst, und Carrageen-induziertes Pfotenödem bei Ratten, ein gut etabliertes Modell, das zeitabhängige akute Entzündungen mit Zytokinproduktion und zellulärer Infiltration widerspiegelt. Alternative Modelle, wie LPS-induzierte systemische Entzündung, wurden aufgrund ihres Schwerpunkts auf systemischer Immunaktivierung statt lokalisierter Gewebeödeme und ihrer begrenzten Eignung für gepaarte histologische und molekulare Analysen auf Gewebeebene nicht ausgewählt⁸.

Mit dieser kombinierten Modellstrategie wurden entzündliche Antworten durch quantitative Ödemmessungen, histopathologische Beurteilung mittels Hämatoxylin- und Eosin-(H&E)-Färbungen, Serumzytokinprofilierung, Gewebe-Transkriptionsanalysen und NF-κB-assoziierte Proteinveränderungen bewertet. Dieses Protokoll eignet sich besonders gut zur Untersuchung der entzündungshemmenden Wirkung bei akuter Entzündung, bei der Ödembildung, Zytokinexpression und signalwegassoziierte molekulare Werte von Interesse sind. Dennoch sollten die Einschränkungen akuter Modelle anerkannt werden, darunter eingeschränkte Extrapolation auf chronische entzündliche Erkrankungen und interpretative Grenzen bei der Ableitung von Kausalität aus Veränderungen der Signalübertragung auf Gewebeniveau.

Zusammengefasst zeigt diese Studie einen protokollgetriebenen Ansatz, der komplementäre akute Entzündungsmodelle mit gepaarten histologischen und molekularen Analysen integriert und so einen reproduzierbaren Rahmen zur Bewertung des entzündungshemmenden Potenzials pflanzlicher Substanzen bietet.

Protokoll

Das Tierversuchsprotokoll wurde vom Institutional Animal Care and Use Committee der Chongqing Medical University (IACUC-CQMU-2025-10073) genehmigt.

Herstellung von Sesquiterpen-Lacton-angereicherten Fraktion (SLEL)

Getrocknete medizinische Materialien von Eupatorium lindleyanum DC. wurden pulverisiert und zweimal mit 70 % (v/v) Ethanol unter reduziertem Druck einer Refluxextraktion unterzogen. Jede Extraktion erfolgte mit einem Lösungsmittel-Material-Verhältnis von 10:1 (v/w) für 2 Stunden. Die kombinierten Extrakte wurden gefiltert, unter reduziertem Druck bei ≤60 °C konzentriert und anschließend vakuumgefriertrocknet, um das rohe Ethanolextraktpulver zu erhalten.

Der getrocknete Extrakt wurde vollständig in destilliertem Wasser gelöst (Endkonzentration: 100 mg/mL) und nacheinander der Polyamidharzchromatographie unterzogen, gefolgt von einer D101-makroporösen Adsorptionsharzchromatographie zur Anreicherung von Sesquiterpen-Lactonen. Nachdem das Adsorptionsgleichgewicht erreicht war, wurde das D101-Harz mit destilliertem Wasser gewaschen, um polare Verunreinigungen zu entfernen, und anschließend mit wasserfreiem Ethanol eluiert. Nach der Ethanolelution wurde die gesammelte Fraktion unter reduziertem Druck konzentriert und gefriertrocknet, um die SLEL-Fraktion zu erzeugen, die bis zur Nutzung bei −20 °C gelagert wurde.

Die Trennung erfolgte auf einer UPLC-Plattform mit einem binären mobilen Phasensystem aus Acetonitril und 0,1 % (v/v) Ameisensäure im Wasser. Das Gradientenprogramm umfasste eine anfängliche 25-minütige isokratische Haltung bei niedrigem organischen Gehalt, einen kurzen linearen Steiggang auf 70 % Acetonitril, eine hochorganische Stufenphase bei 90 % Acetonitril und einen abschließenden Gleichgewichtsschritt zur Rückkehr zu den Ausgangsbedingungen. Das System wurde mit 0,25 mL·min⁻¹ betrieben, mit einer Säulentemperatur von 35 °C und einem Einspritzvolumen von 0,1 μL (Zusatzabbildung S1).

Tiere

In dieser Studie wurden insgesamt 36 männliche Sprague–Dawley-Ratten (200 ± 20 g) und 36 männliche BALB/c-Mäuse (20 ± 2 g) eingesetzt. Die Tiere wurden unter standardisierten Bedingungen gehalten (22 ± 2 °C, 55 ± 5 % Luftfeuchtigkeit, 12 Stunden Hell/Dunkel-Zyklus) mit freiem Zugang zu Futter und Wasser. Die Tiere wurden vor den Experimenten sieben Tage lang akklimatisiert und täglich auf allgemeine Gesundheit überwacht. Alle Verfahren wurden durchgeführt, um das Leiden der Tiere zu minimieren, und vor der Blutentnahme und Gewebeentnahme wurde eine Anästhesie angewendet.

Xyleng-induziertes Ohrödem bei Mäusen

Das Modell des Mausorödems wurde wie zuvor beschrieben^{festgelegt 9}. Nach der Akklimatisierung wurden die Mäuse zufällig in sechs Gruppen (n = 6 pro Gruppe) eingeteilt: Kontrollgruppe (CG), Modell (MG), Dexamethason (DEX, 10 mg/kg) sowie SLEL niedrige Dosis (75 mg/kg), mittlere Dosis (150 mg/kg) und hohe Dosierung (300 mg/kg). Alle Behandlungen wurden einmal täglich für 7 aufeinanderfolgende Tage oral mit Gavage verabreicht (Enddosisvolumen: 10 mL/kg). 1,5 Stunden nach der letzten Verabreichung wurde die Entzündung ausgelöst, indem 30 μL Xylen gleichmäßig auf beide Oberflächen des rechten Ohrs aufgetragen wurden, außer in der Kontrollgruppe. Dreißig Minuten später wurden die Mäuse betäubt, Blutproben entnommen und 8-mm-Rundohr-Punches aus identischen anatomischen Positionen beider Ohren entnommen.

Carragenan-induzierte Pfotenödem bei Ratten

Das Modell des Rattenpfotenödems wurde mit Carrageen entwickelt, wie zuvor^{beschrieben 10}. Die Ratten wurden zufällig sechs Gruppen zugeteilt (n = 6 pro Gruppe): CG, MG, DEX (5 mg/kg) sowie SLEL niedrige Dosis (50 mg/kg), mittlere Dosis (100 mg/kg) und hohe Dosierung (200 mg/kg). Die Behandlungen wurden einmal täglich für 7 Tage (10 ml/kg) oral verabreicht. Das Ausgangsvolumen der Pfoten wurde vor der endgültigen Dosierung gemessen. Dreißig Minuten nach der letzten Verabreichung wurden 0,1 ml 1% (w/v) Carragenan-Lösung subkutan in die Plantaroberfläche der rechten Hinterpfote injiziert. Das Pfotenvolumen wurde 1, 2, 3 und 4 Stunden nach der Injektion mit einem Plethysmometer gemessen. Das Pfotenödem wurde berechnet wie folgt:

Pfotenödem (%) = (Vt − V0) / V0 × 100%

Histologische Untersuchung

Ohren- und Pfotengewebe wurden unmittelbar nach funktionellen Untersuchungen entnommen. Die Gewebe wurden in 10 % neutralem Formalin für 72 Stunden bei Raumtemperatur fixiert, in Paraffin eingebettet, in Schnitt (5 μm) eingebettet und gemäß den Standardprotokollen¹¹ mit H&E gefärbt.

Enzymgekoppelter Immunsorbent-Test (ELISA)

Serumproben wurden durch Zentrifugation bei 3.000 × g für 10 Minuten bei 4 °C gewonnen. Die Konzentrationen von TNF-α, IL-6 und IL-1β wurden mit kommerziell erhältlichen ELISA-Kits gemäß Standardprotokollen quantifiziert.

Western-Blot-Analyse

Totalproteinextrakte wurden aus Ohr- und Pfotengeweben mit RIPA-Lysepuffer hergestellt, ergänzt mit Protease- und Phosphataseinhibitoren. Die Proteinkonzentrationen wurden mittels eines BCA-Tests quantifiziert, und gleiche Mengen Protein (30 μg pro Probe) wurden mit SDS-PAGE aufgelöst und auf PVDF-Membranen übertragen. Die Membranen wurden bei Raumtemperatur 1 Stunde lang mit 5 % fettarmer Milch blockiert, gefolgt von einer Inkubation mit primären Antikörpern bei 4 °C über Nacht und HRP-konjugierten sekundären Antikörpern für 1 Stunde bei Raumtemperatur. Immunreaktive Bänder wurden mittels verstärkter chemilumineszenz nachgewiesen und mit der ImageJ-Software quantifiziert.

Quantitative Echtzeit-PCR (qRT-PCR)

Die gesamte RNA wurde aus Ohr- und Pfotengeweben mit dem RNA-Extraktionsreagenz, das in der Materialtabelle aufgeführt ist, isoliert. Ein Mikrogramm Gesamt-RNA wurde gemäß den Anweisungen des Herstellers rückwärts in cDNA mit einem kommerziellen Reverse-Transkriptions-Set transkribiert. Quantitative PCR wurde mit SYBR Green-Chemie und genspezifischen Primern (Tabelle 1) in einem Reaktionsvolumen von 10 μL unter einem zweistufigen Amplifikationsprotokoll durchgeführt. Detaillierte Reverse-Transkriptionsbedingungen und PCR-Zyklusparameter sind im Abschnitt Protokoll angegeben. Die relativen Transkriptniveaus wurden mit der 2^{⁻ΔΔCT-Methode} berechnet, wobei Gapdh als internes Referenzgen verwendet wurde.

Daten- und statistische Analyse

Die Daten werden als Mittelwert ± SD angegeben. Statistische Vergleiche zwischen zwei Gruppen wurden mit einem ungepaarten Studenten-t-Test durchgeführt, während der Einweg-ANOVA für Analysen mit mehr als zwei Gruppen angewandt wurde. Die statistische Signifikanz wurde als p < 0,05 definiert. Die Signifianz ist angegeben als # p < 0,05 und ## p < 0,01 gegenüber der Kontrollgruppe (CG) und * p < 0,05 und ** p < 0,01 gegenüber der Modellgruppe (MG).

Ergebnisse

Chemische Zusammensetzung in SLEL bis UPLC-Q/TOF/MSn

Das chemische Profil von SLEL wurde mit UPLC-Q/TOF-MSn in positiven und negativen Ionenmodi untersucht. Neun Sesquiterpen-Lactone wurden als vorherrschende Bestandteile identifiziert (ergänzende Abbildung S1). Molekularformelzuweisungen wurden aus beobachteten Adduktionionen abgeleitet, darunter [M+H]⁺ und [M+Na]⁺ im positiven Modus sowie [M−H]⁻ und [M+HCOO]⁻ im negativen Modus (Ergänzungstabelle S1<...

Diskussion

In dieser Studie werden Sesquiterpen-Lactone aus Eupatorium lindleyanum DC verwendet. (SLEL) wurden mit zwei etablierten akuten Entzündungsmodellen untersucht, nämlich xylenguziertes Ohrödem bei Mäusen und carragenan-induziertes Pfotenödem bei Ratten. Durch die Einbeziehung histopathologischer Bewertung, Serum-Zytokin-Messungen, mRNA-Quantifizierung auf Gewebeebene und Protein-Signalwerte bietet dieses Protokoll eine mehrschichtige Charakterisierung lokaler und systemischer Entz...

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Anti-GAPDH	ImmunoWay	YN5585
Anti-IΚ BΑ	Zell-Signaltechnik	4812
Anti-P65	Abmart	TA5006
anti p-Iκ BΑ	Zell-Signaltechnik	2859
Anti-P-P65	Abmart	TP70621
BCA	Beyotime Biotechnology Co., Ltd	P10010
IL-1β Trikot	Xiamen Huijia Biotechnology Co., Ltd	EHJ-20537R
IL-6-Bausatz	Xiamen Huijia Biotechnology Co., Ltd	EHJ-20746R
Mikropipette	Eppendorf
Mikroplatten-Leser	Gene Co., Ltd	Odyssey Fc
PVDF	Millipore	IPVH00010
Reverse-Transkriptions-Kit	MedChemExpress	HY-K051A
RIPA-Puffer	Beyotime Biotechnology Co., Ltd	P0013B
SYBR Green Mastermix	MedChemExpress	HY-K0522
TNF-α Trikot	Xiamen Huijia Biotechnology Co., Ltd	EHJ-20039r
TRIzol	Thermo Fisher Scientific	15596018CN
Ultra-Niedrigtemperatur-Gefrierschrank	SANYO