Method Article

Entwicklung und Wirksamkeit enzym-responsiver Squalen-Chidamid-Nanopartikel bei Bauchspeicheldrüsenkrebs

DOI:

10.3791/69875

⸱

March 13th, 2026

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1School of Pharmaceutical Sciences, Zhejiang Chinese Medical University, 2Huzhou Institute for Food and Drug Control, 3Academy of Chinese Medical Sciences, Zhejiang Chinese Medical University, 4Institute for Innovation in Modern Traditional Chinese Medicine, The First Affiliated Hospital of Zhejiang Chinese Medical University, Zhejiang Provincial Hospital of Traditional Chinese Medicine

* These authors contributed equally

In This Article

Summary

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Dieses Protokoll beschreibt die Synthese und Charakterisierung von folsäuremodifizierten Squalen-Chitosan-Nanopartikeln, bewertet deren enzymresponsive Arzneimittelfreisetzung und zelluläre Aufnahme in vitro und wendet sie an, um die Pankreaskrebstherapie durch gezielte Abgabe zu verbessern.

Abstract

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Hier stellen wir ein Protokoll vor, um die begrenzte intratumorale Penetration von Kleinmolekülarzneimitteln zu adressieren, die durch die dichte extrazelluläre Matrix (ECM) des pankreatalen duktalen Adenokarzinoms (PDAC) verursacht wird. Prodrugs bieten großes Potenzial, diese Herausforderung zu meistern, indem sie die Wirksamkeit der Medikamentenpenetration und die Tumorabtötung verbessern. Squalen (SQ), ein natürlicher Vorläufer der Cholesterinbiosynthese mit ausgezeichneter Biosicherheit und Biokompatibilität, kann die Membrankompatibilität hydrophiler Medikamente verbessern und deren zelluläre Aufnahme verbessern, wenn es an Chemotherapeutika oder bioaktive kleine Moleküle konjugiert wird. In dieser Studie entwickelten wir ein neuartiges, lipophiles, SQ-basiertes Prodrug-System: Das hydrophile Krebsmittel Chidamid (CHI) wurde über eine Amidbindung mit SQ konjugiert – einer Verbindung, die auf Pankreatin und Cathepsin B (Schlüsselenzyme, die im PDAC-Mikroumfeld überexprimiert werden). Diese Konjugation ergab ein amphiphiles SQ-CHI-Prodrug, das weiter zu folat-(FA)-modifizierten Nanopartikeln (FA-SQ-CHI NPs) selbst zusammengesetzt wurde. Die optimierten NPs wiesen einen gleichmäßigen hydrodynamischen Durchmesser von 173,3 ± 1,5 nm, einen Polydispersitätsindex (PDI) von 0,181 ± 0,18, eine hohe Arzneimittelbelastungskapazität von 59,0 % ± 0,77 % sowie ein stabiles Zeta-Potenzial von -13,10 ± 0,86 mV. auf. In-vitro-Freisetzungsstudien zeigten, dass die NPs 80,2 % ± 4,22 % kumulierte Arzneimittelfreisetzung innerhalb von 72 Stunden in Anwesenheit von 0,25 % Pankreatin erreichten, während in pH-adjustierten Puffern (pH 4,5 oder 7,4) ohne Enzyme nur 33–38 % Freisetzung beobachtet wurden. Zelluläre Aufnahmetests bestätigten, dass die FA-Modifikation die intrazelluläre Abgabeeffizienz signifikant verbesserte, mit einer 1,8- bis 2,3-fach höheren Fluoreszenzintensität in PDAC-Zellen (PSN-1 und CFPAC-1) im Vergleich zu nicht-gezielten NPs bei 12-24 Stunden. Das aktuelle Protokoll bietet eine umfassende Methodik für die Synthese und Charakterisierung des Prodrugs, die In-vitro-Bewertung der enzymresponsiven Freisetzungskinetik sowie vergleichende Analysen der therapeutischen Wirksamkeit und Gewebepenetration, wobei die Kernvorteile des Nanoträgers wie gezielte Abgabe, hohe Arzneimittelbelastung und enzymausgelöste kontrollierte Freisetzung hervorgehoben werden.

Introduction

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Das pankreatatisch-duktale Adenokarzinom (PDAC) ist ein hochgradig bösartiger Tumor des Verdauungstrakts mit einer Inzidenzrate, die nahezu seiner Sterblichkeitsrate entspricht, und einer 5-Jahres-Überlebensrate von nur 8 % bis 9 %. Eine komplexe Tumormikroumgebung (TME) ist das Markenzeichen von PDAC2. Sie besteht hauptsächlich aus einer abnormen extrazellulären Matrix (ECM), aktivierten krebsassoziierten Fibroblasten (CAFs) und einem stark immunsuppressiven zellulären Milieu. Das PDAC ECM ist reich an Typ-I-Kollagen. Sowohl der veränderte Inhalt als auch die abnorme Struktur fördern das Tumorprogression und sind mit einer schlechten Prognose assoziiert3. CAFs sind die häufigsten stromalen Zellen und bestehen aus funktional unterschiedlichen Subtypen, wie matrixproduzierende MyCAFs und entzündlichen iCAFs, die phänotypische Plastizitätaufweisen 4.

Immunologisch wird das PDAC TME von pro-tumorartigen myeloiden Zellen dominiert. Anti-Tumor-Lymphozyten sind selten oder funktionsunfähig. Reife B-Lymphozyten tragen ebenfalls zur Immunsuppressionbei 3,4. Zusammen bilden diese Komponenten mehrere therapeutische Barrieren. Das dichte Stroma, gekennzeichnet durch einen hohen Druck der interstitiellen Flüssigkeit, erzeugt eine bedeutende Eindringbarriere, die die Verabreichung von Therapeutika in die tiefen Tumorregionen stark behindert und dadurch die klinische Wirksamkeit von Chemotherapeutikaerheblich einschränkt. Daher ist es von entscheidender Bedeutung, Arzneimittelabgabesysteme zu entwickeln, die diese stromale Barriere überwinden und tief in das Bauchspeicheldrüsentumorgewebe eindringen können.

In den letzten Jahren hat Squalen (SQ), ein natürlicher Vorläufer der Cholesterinbiosynthese, aufgrund seiner hervorragenden Biosicherheit und Biokompatibilitätgroße Aufmerksamkeit erregt. Da SQ stark hydrophob ist, kann es mit hydrophilen Medikamenten konjugiert werden, um amphiphile Prodrogen zu bilden, wodurch die Biokompatibilität hydrophiler Kleinmolekül-Medikamente mit Zellmembranen verbessert und deren zelluläre Aufnahmeeffizienz erhöhtwird. Frühere Studien haben gezeigt, dass SQ kovalent mit verschiedenen chemotherapeutischen Wirkstoffen wie Cisplatin, Paclitaxel und Gemcitabin konjugiert werden kann, wodurch Prodrogen-Nanopartikel mit hoher Arzneimittelbelastungskapazität entstehen, was die Arzneimittelabgabe an solide Tumoreverbessert 8,9. Diese Eigenschaften unterstreichen das breite Anwendungspotenzial von SQ in der Entwicklung von Arzneimittelabgabesystemen.

Um die Tumorzielsetzung zu verbessern, verwendet diese Studie Folsäure (FA) als Zielliganden. FA ist ein wasserlösliches Vitamin, das für den Ein-Kohlenstoff-Stoffwechsel, Biosynthese10, Redoxhomöostase11 und Methylierungsreaktionen12 entscheidend ist. Die Konjugation von FA über seine Carboxylgruppen an den Nanoträger ermöglicht die spezifische Erkennung und Bindung an den Folatrezeptor (FR), gefolgt von rezeptorvermittelter Endozytose13. Durch die Nutzung der erhöhten Permeabilität und des Retentionseffekts von Tumorzellen bewerteten Zheng et al.14 die Folatrezeptor-α (FRα)-Expression in Bauchspeicheldrüsenkrebs, normaler Bauchspeicheldrüse, benachbarten Geweben und chronischer Pankreatitis mittels Western Blotting und Immunhistochemie und analysierten deren Korrelation mit klinisch-pathologischen Merkmalen. FRα wurde bei 94,7 % (72/76) der Bauchspeicheldrüsenkrebsfälle exprimiert, korreliert mit Metastasen, fehlte jedoch in normalen Bauchspeicheldrüsengeweben. FA-modifizierte Nanopartikel können sich selektiv in FR-positiven Geweben ansammeln, was eine molekular gezielte Therapie ermöglicht.

Chidamid (CHI) ist ein neuartiger Histondeacetylaseinhibitor. Präklinische Studien haben gezeigt, dass es auch eine starke antitumorale Aktivität gegen solide Tumore wie Bauchspeicheldrüsen- und Brustkrebs aufweist und die Arzneimittelresistenz in Tumorzellenumkehren kann. Seine starke Hydrophilität ist jedoch mit einer geringen Durchdringungseffizienz in die Tumormikroumgebung und einer schlechten Verteilung in soliden Tumorgeweben verbunden, was das klinische therapeutische Potenzial für Bauchspeicheldrüsenkrebsstark einschränkt. Mit Chidamid (CHI) als Modellmedikament schlägt diese Studie die Herstellung selbstassemblierter Nanopartikel durch die Konjugation von CHI mit SQ und die anschließende Modifikation mit FA vor. Diese Strategie zielt darauf ab, die antitumorale Wirksamkeit von CHI gegen Bauchspeicheldrüsenkrebs zu erhöhen, indem die schlechte Penetration in das Tumormikroumfeld und die suboptimale Verteilung im festen Tumorgewebe überwunden werden. Darüber hinaus wird durch die Bewertung der in-vitro-Wirksamkeit von CHI in Bauchspeicheldrüsenkrebszelllinien erwartet, dass dieser Ansatz die Durchdringung und zytotoxische Wirkung von CHI – einem repräsentativen hydrophilen Kleinmolekül-Medikament – im Mikroumfeld des Bauchspeicheldrüsentumors erheblich verbessert und so eine experimentelle Grundlage für die Steuerung der CHI-basierten Therapie bei Bauchspeicheldrüsenkrebs liefert.

Unsere Studie erläutert die experimentellen Verfahren zur Herstellung von CHI-SQ-PEG-FA-selbstassemblierten Prodrug-Nanopartikeln zur Behandlung von Bauchspeicheldrüsenkrebs. Konkret beschreiben wir die Optimierung und Charakterisierung des Vorbereitungsprozesses für CHI-SQ-PEG-FA-Nanopartikel sowie in vitro-Studien zur Arzneimittelfreisetzung. Der Prozess beinhaltet: zunächst die Optimierung der Formulierung mit einem experimentellen Einfaktoransatz sowie die Bestimmung der optimalen Partikelgröße und Arzneimittelbelastung; zweitens die Charakterisierung der Nanopartikel mittels UPLC- und MTS-Analysen; und schließlich die Etablierung eines in vitro kokultivierten Tumor-Sphäroid-Modells. Mit Coumarin-6 (C6) als fluoreszierende Sonde in gezielten Nanopartikeln validieren wir zudem das Eindringen und die Verteilung der Nanopartikel in dreidimensionalen Tumorsphäroiden und erhalten relevante Daten.

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Protocol

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1. Synthese von SQ-CHI und SQ-PEG-FA

  1. Synthese von SQ-CHI: Wiege 120,4 mg (0,3 mmol) 1,1',2-Tris-Norsqualenoinsäure und löse sie in 1 mL N, N-Dimethylformamid (DMF). Fügen Sie nacheinander NHS (46 mg, 0,4 mmol) und EDCI (72 mg, 0,38 mmol) hinzu und lassen Sie die Reaktion 90 Minuten unter Stickstoffschutz ablaufen.
  2. Chidamid (58,56 mg, 0,15 mmol) in 1 mL DMF auflösen und tropfenweise zur Reaktionsmischung geben. Rühren Sie die Reaktion bei Raumtemperatur unter einer Stickstoffatmosphäre für 72 Stunden um.
  3. Nach dem Abschluss wird das Lösungsmittel unter reduziertem Druck bei 5–15 kPa verdampft, um das Rohprodukt zu erhalten. Reinigen Sie das Rohprodukt durch Flash-Säulenchromatographie unter Verwendung einer Gradienteneluation von DCM/MeOH (99:1, 99:5, 85:5).
  4. Strukturelle Überprüfung von SQ-CHI: Das synthetisierte SQ-CHI-Produkt in ein Glasfläschchen geben und es 24 Stunden lang unter Vakuum in einem Desiccator trocknen. Lösen Sie das Produkt in etwa 1 ml deuteriertem Chloroform (CDCl3) auf und geben Sie es in ein NMR-Probenröhrchen um. Führen Sie eine1H-NMR-Analyse durch, um die chemische Struktur des Produkts zu bestätigen17.
  5. Synthese von SQ-PEG-FA: 41,12 mg 1,1',2-Tris-Norsqualensäure in 35 μL DMF auflösen. Fügen Sie dieser Lösung sequentiell N-Hydroxysuccinimid (NHS, 15,71 mg) und 1-Ethyl-3-(3-Dimethylaminopropyl)carbodiimid (EDCI, 24,59 mg) hinzu.
  6. Lassen Sie die Reaktion 90 Minuten unter einer Stickstoffatmosphäre ablaufen. Lösen Sie 20 mg FA-PEG-NH2 in 35 μL DMF auf und geben Sie es tropfenweise der Reaktionsmischung zu.
  7. Rühren Sie die resultierende Mischung bei Raumtemperatur 72 Stunden unter Stickstoff um. Reinige das Rohprodukt mit einer 3 kDa MWCO Ultrafiltrationszentrifugenröhre bei 5.200 x g für 30 Minuten, um unreagierte freie Säure zu entfernen. Geben Sie die gereinigte SQ-PEG-FA-komplexe wässrige Lösung in ein Glasfläschchen und frieren Sie es bei -50 °C vor. Die vorgefrorene Lösung wird in einem Gefriertrockner geblendet, um den SQ-PEG-FA-Komplex als lyophilisiertes Pulver zu erhalten.

2. Strukturelle Verifikation von SQ-PEG-FA

  1. Platzieren Sie den gelyophilisierten SQ-PEG-FA-Komplex in ein 2-ml-Zentrifugenrohr und trocknen Sie ihn anschließend 24 Stunden lang unter Vakuum in einem Desikator. Lösen Sie das Produkt in etwa 1 ml deuteriertes Dimethylsulfoxid (DMSO-d6) auf und geben Sie es in ein NMR-Proberohr um. Führen Sie eine1H-NMR-Analyse durch, um die chemische Struktur des Komplexes zu bestätigen.
  2. Optimierung der Vorbereitung und Charakterisierung von SQ-CHI-PEG-FA-NPs
  3. Wiege 6,64 mg SQ-CHI und löse es in 2 mL absolutem Ethanol, um eine 3,32 mg/mL (4,3 μM) Lagerlösung herzustellen.
  4. Fügen Sie die SQ-CHI ethanolische Lagerlösung (1, 0,2, 0,1 oder 0,05 mL) tropfenweise zu 1 mL deionisiertes Wasser beim Rühren hinzu. Rühren Sie 5 Minuten um und entfernen Sie dann das Ethanol durch Verdunstung mit reduziertem Druck. Sonikieren Sie das resultierende Gemisch für 30 Minuten, um eine CHI-SQ-Nanopartikelsuspension zu erhalten. Missen Sie den hydrodynamischen Durchmesser und den Polydispersitätsindex (PDI) der Nanopartikel mit einem Zetasizer, um die optimale Formulierung18 zu bestimmen.
  5. Gib 0,1 mL der SQ-CHI ethanolischen Lagerlösung tropfenweise zu 1 ml deionisiertem Wasser nach verschiedenen Rührdauern (0, 5, 10 oder 20 Min). Nach der jeweiligen Rührphase wird das Ethanol durch druckreduzierende Verdunstung entfernt, gefolgt von einer 30-minütigen Sonikation, um CHI-SQ-Nanopartikelsuspensionen zu erhalten. Missen Sie den hydrodynamischen Durchmesser und die PDI, um die optimale Rührzeit zu bestimmen.
  6. Geben Sie 0,1 ml der SQ-CHI Ethanollagerlösung tropfweise zu 1 ml deionisiertem Wasser unter 5 Minuten Rühren. Nach dem Umrühren wird das Ethanol durch Druckreduzierung entfernt. Sonikieren Sie das resultierende Gemisch für verschiedene Dauern (0, 5, 20 oder 30 Min), um CHI-SQ-Nanopartikelsuspensionen zu erhalten. Messen Sie den hydrodynamischen Durchmesser und die PDI, um die optimale Sonikationszeit zu bestimmen.
  7. Bestätigen Sie die optimalen Bedingungen basierend auf den obigen Ergebnissen. Hier gilt das gewonnene Volumenverhältnis von Wasser zu Bodenlösung = 10:1, Rührzeit = 5 Minuten und Sonikationszeit = 30 Minuten. Wiederholen Sie alle Experimente unabhängig voneinander in dreifacher Ausgabe, um die Zuverlässigkeit zu gewährleisten.
  8. Verwenden Sie die Ein-Faktor-Methode, während andere Parameter konstant bleiben. Variieren Sie nacheinander folgende Faktoren, um deren Einfluss auf die Partikelgrößenverteilung und das Zeta-Potenzial der Nanopartikel zu bewerten: Massenverhältnis der Komponenten (SQ-CHI: SQ-PEG-FA = 1:0, 1:0,05, 1:0,5, 1:0,7), Phasenvolumenverhältnis (wässrige Phase: organische Phase = 1:1, 1:5, 1:10, 1:20) und Sonikationszeit (5, 15, 30, 45 Min).
  9. Nach dem optimierten Protokoll werden die SQ-CHI- und SQ-PEG-FA-Stocklösungen im festgelegten Verhältnis gemischt. Geben Sie diese Mischung tropfenzweise unter ständigem Rühren in deionisiertes Wasser. Rühren Sie 5 Minuten weiter, um ein gründliches Mischen sicherzustellen. Ethanol durch druckreduzierende Verdunstung entfernen, gefolgt von 30 Minuten Sonikation, um die endgültige CHI-SQ-PEG-FA-Nanopartikelsuspension zu erhalten.
  10. Messen Sie den hydrodynamischen Durchmesser, die Größenverteilung (PDI) und das Zeta-Potenzial der Nanopartikel mittels dynamischer Lichtstreuung mit einem Laserpartikelgrößenanalysator. Beobachte die Morphologie der Nanopartikel mittels Transmissionselektronenmikroskopie (TEM, 150.000-fache Vergrößerung) und Rasterelektronenmikroskopie (SEM, 80.000-fache Vergrößerung).
  11. Bestimmung des Arzneimittelbelastungsgehalts mittels Ultraleistungs-Flüssigkeitschromatographie (UPLC)
  12. Setzen Sie die chromatografischen Bedingungen wie folgt ein: C18-Säule (2,1 mm x 50 mm, 1,7 μm); Mobilphase: 0,1 % Ameisensäure-wässrige Lösung – Acetonitril (75:25, v/v); Detektionswellenlänge: 258 nm; Durchflussrate: 0,2 mL/min; Säulentemperatur: 23 °C; Injektionsvolumen: 5 μL; Laufzeit: 10 Minuten.
  13. Die CHI-SQ-PEG-FA NP-Suspension rekonstruieren und sie bei 7.500 x g für 30 Minuten zentrifugieren. Sammeln Sie das Überlagerungsmittel und filtern Sie es durch eine 0,22 μm mikroporöse Membran. Verwenden Sie das resultierende Filtrat als Testlösung. Injizieren und analysieren Sie die Testlösung unter den angegebenen chromatografischen Bedingungen. Berechnen Sie den Arzneimittelbelastungsgehalt der Nanopartikel anhand der gemessenen CHI-Konzentration im Filtrat.

3. In-vitro-Arzneimittelfreisetzungsstudie

  1. Pipettieren Sie einen 2 mL Aliquot entweder einer frisch vorbereiteten CHI-Lagerlösung oder der CHI-SQ-PEG-FA-Nanopartikelsuspension präzise in einen Dialysebeutel mit einem Molekulargewichtsabgrenzungseffekt von 3 kDa.
  2. Tauchen Sie den Dialysebeutel in das Freisetzungsmedium ein, das verschiedene Pankreatinkonzentrationen enthält (0 %, 0,05 %, 0,1 %, 0,25 %). In vorgegebenen Zeitintervallen (0,1, 0,5, 1, 2, 4, 6, 8, 10, 12, 24, 30, 36, 48, 72 H) werden 1 mL Proben aus dem Freigabemedium entnommen und sofort durch ein gleiches Volumen vorgewärmtes frisches Medium ersetzt, um die Sinkbedingungen aufrechtzuerhalten.
  3. Bestimmung der CHI-Konzentration in allen Proben mit der UPLC-Methode (chromatographische Bedingungen wie in Abschnitt 3 angegeben) und Berechnung der kumulativen Arzneimittelfreisetzung.
  4. Verwenden Sie Ammoniumacetatpuffer (pH 4,5) als Freisetzungsmedium. Pipettieren Sie genau 2 ml der Nanopartikelsuspension in einen Dialysebeutel (3 kDa). Geben Sie verschiedene Aktivitätseinheiten (0, 0,7, 1,4, 2,8 U) von Cathepsin B direkt in den Dialysebeutel. Tauchen Sie den Beutel in 40 mL Release-Medium und befruchten Sie ihn in einem Shaker mit konstanter Temperatur bei 37 ± 0,5 °C und 75 U/min. Zu den vorab festgelegten Zeitpunkten (0,1, 0,5, 1, 2, 4, 6, 8, 10, 12, 24, 30, 36, 48, 72 H) entnehmen Sie 1 mL Proben und ersetzen Sie sie sofort durch ein gleiches Volumen frisches, vorgewärmtes Medium beim gleichen pH-Wert, um das Systemgleichgewicht aufrechtzuerhalten.
  5. Filtern Sie die gesammelten Proben durch eine 0,22 μm mikroporöse Membran. Analysieren Sie die Filtrate mit UPLC, um die Arzneimittelkonzentration zu bestimmen. Berechnen Sie den kumulativen Freisetzungsprozentsatz von CHI und erstellen Sie die Profile der Arzneimittelfreisetzung.
  6. Pipettieren Sie eine 2 mL Aliquot entweder der CHI-Originallösung oder der CHI-SQ-PEG-FA NP-Federung genau in einen Dialysebeutel (3 kDa MWCO). Tauchen Sie den Dialysebeutel in das Freisetzungsmedium ein, das verschiedene Pankreatinkonzentrationen enthält (0 %, 0,05 %, 0,1 %, 0,25 %). Zu den vorgegebenen Zeitpunkten (0,1, 0,5, 1, 2, 4, 6, 8, 10, 12, 24, 30, 36, 48, 72 H) entnehmen Sie 1 mL Proben und ersetzen Sie sie sofort durch ein gleiches Volumen frisches, vorgewärmtes Freigabemediums, um die Sinkbedingungen zu gewährleisten.
  7. Quantifizieren Sie die Wirkstoffkonzentration in den Proben mittels UPLC. Berechnen Sie die kumulative Arzneimittelfreisetzung und erstellen Sie die Freisetzungskurven.
  8. Bewertung der Nanopartikelstabilität in PBS
  9. Mischen Sie die CHI-SQ-PEG-FA NPs mit PBS (pH 7,4) im Verhältnis 1:20 (v/v). Inkubieren Sie das Gemisch in einem Schüttler bei konstanter Temperatur bei 37 ± 0,5 °C und 100 U/min. Entnehmen Sie Proben bei 1, 3, 6, 12, 18, 24, 30, 36, 42, 48, 72, 96 Stunden, um den hydrodynamischen Durchmesser und das Zeta-Potenzial zu messen.
  10. Zellproliferationstest mit der MTS-Methode
  11. PSN-1 Bauchspeicheldrüsenkrebszellen wurden in vollständigem RPMI-1640-Medium kultiviert. Zellen in der logarithmischen Wachstumsphase wurden durch Verdauung mit 0,25 % Trypsin bei 37 °C entnommen und in vollständigem Medium auf eine Dichte von 4–6 x 104 Zellen/ml resuspendiert. Die Suspension wurde in 96-Well-Platten mit 100 μL pro Bohrloch ausgesat und diese für 2 Stunden in einem 37 °C, 5 % CO2-Inkubator vorkultiviert, um eine vollständige Zelladhäsion zu ermöglichen.
  12. Aspiriere das ursprüngliche Kulturmedium. Richten Sie eine Kontrollgruppe (Blankkulturmedium) und mehrere Konzentrationsgradienten von Chidamidgruppen auf (0,2, 2, 8, 10, 20, 80 pM) mit drei Replikationsbohrlöchern pro Gruppe. Fügen Sie jedem Brunnen 100 μL Blank- oder arzneimittelhaltiges Medium hinzu und übertragen Sie die Zellplatte dann in den Inkubator zur weiteren Kultur. Behandle die experimentellen Gruppen mit 100 μL frischem Medium, das unterschiedliche Konzentrationen (0,2, 2, 8, 10, 20, 80 pM) von SQ-PEG, freiem CHI, CHI-SQ-PEG NPs oder CHI-SQ-PEG-FA NPs enthält, während die Kontrollgruppe ein gleiches Volumen Blankmedium erhält. Nach weiterer Inkubation von 96 Stunden wird das medikamentenhaltige Medium aus jedem Brunnen entfernt.
  13. Fügen Sie jedem Bohrloch 20 μL MTS-Arbeitslösung hinzu, gefolgt von einer Inkubation für 4 Stunden. Schütteln Sie die 96-Well-Platte für 15 Sekunden, um die Homogenität zu gewährleisten, und missen Sie sofort die Absorptionsfähigkeit (A-Wert) jedes Bohrlochs bei einer Wellenlänge von 490 nm mit einem Mikroplattenleser. Berechnen Sie die Zellproliferationsrate, indem Sie den OD-Wert der Blankgruppe vom OD-Wert der medikamentenbehandelten Gruppe subtrahieren, das Ergebnis durch die Differenz zwischen dem OD-Wert der Blankmedium-Gruppe und dem OD-Wert der Blankgruppe teilen und dann mit 100 multiplizieren.
  14. Etablierung eines in vitro kokultivierten Tumor-Sphäroidmodells
  15. Mische PSN-1-Zellen in der logarithmischen Wachstumsphase mit HPSC-Zellen im Verhältnis 2:7 und setze sie in ultra-niedrige Anheftungsplatten mit 96 Wellen und einer Dichte von 5.000 Zellen pro Well. Nach der Bildung der Tumorsphäroide werden die Sphäroide mit verschiedenen Nano-Formulierungen (Coumarin 6-markierte CHI-SQ-PEG/C6 NPs und CHI-SQ-PEG-FA/C6 NPs) oder DMSO (als Kontroll) behandelt und gemeinsam 48, 96 und 144 Stunden inkubiert, um die Wirksamkeit des Medikaments zu bewerten.
  16. Nach der Inkubation wird jedem Bohrloch ein gleiches Volumen des Zellviabilitätsassay-Reagens hinzugefügt. Stellen Sie die Platte auf einen Orbitalshaker und schütteln Sie 15 Minuten lang, um eine vollständige Lyse sicherzustellen, gefolgt von einer 30-minütigen Inkubation bei Raumtemperatur im Dunkeln.
  17. Übertragen Sie das Zelllysat auf eine schwarze 96-Well-Platte. Messen Sie das chemilumineszenzfähige Signal bei einer Wellenlänge von 562 nm mit einem multifunktionalen Mikroplattenleser, um die Zellviabilität zu quantifizieren.
  18. Untersuchung der zellulären Aufnahme von Nanopartikeln
  19. Bereite gezielte Nanopartikel (CHI-SQ-PEG-FA/C6 NPs) und nicht gezielte Nanopartikel (CHI-SQ-PEG/C6 NPs) vor, die Kumarin-6 (C6) als fluoreszierende Sonde enthalten. Routinemäßig werden PSN-1-Zellen in der logarithmischen Wachstumsphase für 24 Stunden kultiviert, um eine Monoschicht zu bilden. Lösen Sie Cumarin 6 in Ethanol auf, um eine 200 μg/mL Stocklösung herzustellen. Mische 10 μL der Lösung mit SQ-CHI und SQ-PEG-FA (oder SQ-PEG) im Verhältnis 1:0,7 und injiziere dann tropfenweise in deionisiertes Wasser während des Rührens. 5 Minuten umrühren, Ethanol durch Verdunstung entfernen und 30 Minuten sonisieren. Zum Schluss reinigen Sie durch Ultrafiltration (3 kDa, 12.000 U/min, 20 Min), um die Gegenstände zu erhalten.
  20. Die Zellen werden wie folgt behandelt: Die experimentellen Gruppen erhalten ein serumfreies Medium mit freiem C6, CHI-SQ-PEG/C6 NPs oder CHI-SQ-PEG-FA/C6 NPs (mit einer Endkonzentration von 5 μmol/L und einer C6-Konzentration von 2,6 μmol/L), während die Kontrollgruppe ein gleiches Volumen Blankmedium erhält.
  21. Nach der 4-, 12- und 24-Stunden-Inkubation wird das medikamentenhaltige Medium aspiriert. Färbe-Zellkerne mit 4',6-Diamidino-2-Phenylindol (DAPI)19.
  22. Führen Sie Beobachtungen unter einem Fluoreszenzmikroskop durch (40x, Anregungswellenlänge Ex=360 nm, Emissionswellenlänge Em=477 nm). Untersuchen Sie die zelluläre Aufnahme von Nanopartikeln durch Messung der Fluoreszenzintensität von Cumarin-6.

4. Statistische Analyse

  1. Führen Sie alle Experimente mit mindestens 3 Replikaten durch, um die in dieser Studie präsentierten Daten zu erhalten. Analysieren Sie Statistiken mit der GraphPad Prism Software. Präsentieren Sie experimentelle Daten als Mittelwert ± Standardfehler des Mittelwerts (SD) und vergleichen Sie die Gruppen mit Student's t Test, Einweg-ANOVA oder Wilcoxon-Test, wo angebracht. Setzen Sie die Schwelle für die statistische Signifikanz bei P < 0,05.

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Results

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Diese Studie entwarf und evaluierte erfolgreich ein neuartiges, gezieltes Nanoarzneimittel-Liefersystem – Chidamid-Squalenylation Prodrug-basierte selbstzusammengesetzte Nanopartikel (CHI-SQ-PEG-FA, NPs; Abbildung 1). Wir synthetisierten CHI-SQ-PEG-FA-NPs (Abbildung 2) und bewerteten systematisch die Auswirkungen verschiedener Parameter, darunter das Phasenverhältnis von Öl zu Wasser (Abbildung 3A),...

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Discussion

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Diese Studie bietet einen praktischen Schritt-für-Schritt-Leitfaden zur Implementierung eines Systems mit niedriger Taille, das auf der Selbstassemblierung von Nanopartikeln basiert. Die in dieser Studie gewonnenen selbstassemblierten Nanopartikel zeigten eine regelmäßige kugelförmige Form, gute Dispersion, gleichmäßige Partikelgröße, hohe Arzneimittelbelastung und Verkapselungseffizienz und zeigten eine zufriedenstellende Stabilität21. Ein 3D-Tumorsphäroid-Kokult...

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Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Die Autoren erklären keine Interessenkonflikte.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Diese Arbeit wurde durch Zuschüsse der Zhejiang Provinz Natural Science Foundation (LZ23H290001, LY19H280001) unterstützt; Stipendien der National Natural Science Foundation of China (82474338 und 82274364); Zhejiang Provinz Drei ländliche Gebiete und Neun Parteien Agrarwissenschafts- und Technologie-Kollaborationsprogramm (2025SNJF075); sowie das Public Welfare Research Project des Huzhou Science and Technology Grand (2021GZ261); sowie das Allgemeine wissenschaftliche Forschungsprojekt des Bildungsamtes der Provinz Zhejiang (Y202456442, 2025YKJ10).

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
0,25 % Trypsin-EDTAGibco (USA)25200072
1-Ethyl-3-(3-Dimethylaminopropyl)Carbodiimid-Hydrochlorid (EDCI)Sigma-Aldrich (USA)E6383
2-mL kryogene FläschchenCorning (USA)430488
96-Well-ZellkulturplattenCorning (USA)3598
Absolutes EthanolChina National Pharmaceutical Group Corp. (Sinopharm)100092680
AcetonChina National Pharmaceutical Group Corp. (Sinopharm)32201-2,5L
AcetonitrilTedia (USA)A998-4HPLC-Grad
AmmoniumacetatChina National Pharmaceutical Group Corp. (Sinopharm)10002861
Wasserfreies NatriumsulfatSigma-Aldrich (USA)31481
Biologischer SicherheitsschrankThermo Fisher Scientific, USA1380, 1332, 1356
ZellkulturkolbenCorning (USA)CLS430372
ZellkulturinkubatorThermo Fisher Scientific, USAHERA51901126
Chidamid(CHI)Shenzhen Microcore Biotech Co., Ltd. (China)Reinheit >95 %
Cytation 5 Multimode-MikroplattenleserBioTek, USACYT5MV
Thermostatischer magnetischer Heizer des DF-101SZhengzhou Kechuang Instrument Co., Ltd., China
DichloromethanChina National Pharmaceutical Group Corp. (Sinopharm)80047318
Dimethylsulfoxid (DMSO)Sigma-Aldrich (USA)D2650
DioxanAladdin (China)D116156-5 ml
DMEM-MediumGibco (USA)12100046
Dulbeccos phosphatgepufferte Kochsalzlösung (DPBS)Gibco (USA)14040141
EthylacetatChina National Pharmaceutical Group Corp. (Sinopharm)10009460
EthyletherChina National Pharmaceutical Group Corp. (Sinopharm)
FA2004B elektronische BilanzShanghai Tianmei Balance Instrument Co., Ltd., ChinaFA2004B
Fetales Rinderserum (FBS)Gibco (USA)10099141C
Folat-Poly(Ethylenglykol)-Amin (FA-PEG-NH2)Shanghai Pengshu Biological Technology Co., Ltd. (China)PS2-NFA-2000
AmeisensäureAladdin (China)F112034HPLC-Grad
GefriertrocknerThermo Fisher Scientific, USA
menschliches Cathepsin BSigma-Aldrich (USA)SRP0289
Zelllinien menschlicher Bauchspeicheldrüsenkrebs (PSN-1, CFPAC-1)die American Type Culture Collection (ATCC)CRL-3211, CRL-1918
menschliche Pankreas-Sternzellen (HPaStec, HPSC)die American Type Culture Collection (ATCC)
Menschliches TrypsinSigma-Aldrich (USA)
SalzsäureChina National Pharmaceutical Group Corp. (Sinopharm)CFSR-10011008
Invertiertes MikroskopOlympus, JapanIX83
Iscoves modifiziertes Dulbeccos Medium (IMDM)Gibco (USA)12440053
IX 1000 Vortex-Mixer Hangzhou Ruicheng Instrument Co., Ltd., ChinaIX 1000
MethanolChina National Pharmaceutical Group Corp. (Sinopharm)M433287-10L
methanol Tedia (USA)MS1922-001HPLC-Grad
Mikrozentrifugenröhrchen (1,5/2,0 mL)Axygen (USA)MCT-150-C
Mikropipetten (20, 100 und 1000 & mu; L)Thermo Fisher Scientific, USA4642050, 4642070, 4642090
Mill-Q Wasseraufbereitungssystem Millipore, USAZR0Q00800
  MTS-Testkit (3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-5-(3-Carboxymethoxyphenyl)-2-(4-Sulfophenyl)-2H-Tetrazolium)Promega (USA)G3582
N,N-Dimethylformamid (DMF)Aladdin (China)
N-Bromosuccinimid (NBS)Sigma-Aldrich (USA)B81255
N-Hydroxysuccinimid (NHS)Sigma-Aldrich (USA)56480
Optima Max Ultrazentrifuge Beckman, USA393490
Penicillin/Streptomycin-LösungGibco (USA)15140-122
Periodische SäureSigma-Aldrich (USA)P7875
ErdölätherChina National Pharmaceutical Group Corp. (Sinopharm)
Phenazinmethosulfat (PMS)Sigma-Aldrich (USA)3180806
Phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS)Gibco (USA)70011069
Poly(Ethylenglykol)-Amin (PEG-NH2)Shanghai Pengshu Biological Technology Co., Ltd. (China)PG2-AM-20k
RPMI-1640 MediumGibco (USA)31800022
SilikagelpulverSigma-Aldrich (USA)53698300 Mesh
NatriumbicarbonatSigma-Aldrich (USA)401676
NatriumchloridChina National Pharmaceutical Group Corp. (Sinopharm)10019318
NatriumdichromatdihydratSigma-Aldrich (USA)1.93689
SqualeneSigma-Aldrich (USA)Y0002131
sterile Zentrifugenröhren (15 und 50 mL)Corning (USA)430791, 430828
SchwefelsäureChina National Pharmaceutical Group Corp. (Sinopharm)10021618
TetrahydrofuranChina National Pharmaceutical Group Corp. (Sinopharm)34865-4X4LAnalytische Bewertung
Ultrafiltrations-Zentrifugalröhren (Molekulargewichtsgrenze: 3,5 kDa)Beckman, USA344088

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