Entwicklung mesenchymaler Stammzellmembran-umhüllte Nanovesikel zur verbesserten Genlieferung

Zusammenfassung

Dieses Protokoll zielt darauf ab, eine Methode zur Herstellung und Reinigung von mesenchymalen Stammzellen (MSC)-abgeleiteten extrazellulären Vesikelbiomimetika für die Gentherapie einzuführen. Das Nanovesikel ist mit MSC-abgeleiteten Lipid-Doppelschichten eingeschlossen und kapselt rekombinante AAVs, die das relevante Gen im Lumen tragen. Dieses Nanovesikel bietet einen verbesserten Vektor für die Genlieferung in vivo .

Zusammenfassung

Extrazelluläre Vesikel (EVs) aus mesenchymalen Stammzellen (MSC) haben großes Potenzial für therapeutische Anwendungen und regenerative Medizin. EVs sind nanoskalige Vesikel, die von allen bekannten Zelltypen ausgeschieden werden und verschiedene Ladungen transportieren, darunter membranverankerte Proteine, lösliche Faktoren, mehrere RNA-Spezies und Metabolite, die die Physiologie und das Verhalten der Empfängerzellen regulieren. Während MSC-abgeleitete oder entwickelte EVs therapeutische Proteine und RNAs liefern können, bleibt die EV-vermittelte DNA-Lieferung aufgrund fehlender effizienter Mechanismen zur Sortierung von DNA-Sequenzen in Vesikeln schwierig. Frühere Arbeiten unserer Gruppe und anderer haben gezeigt, dass adenoassoziierte Virus-(AAV)-enthaltende EVs eine gezielte nukleare Abgabe und eine nachhaltige Genexpression in vitro und in vivo ermöglichen. Ihre Produktion und Isolierung wurden jedoch durch geringe Erträge und zeitaufwändige Verfahren eingeschränkt. Hier berichten wir über die Entwicklung von MSC-membranumhüllten Nanovesikeln, die durch eine größendefinierte Extrusionsmethode für eine effiziente Genlieferung erzeugt werden. Diese Vesikel, etwa 200 nm im Durchmesser, ahmen die Eigenschaften natürlicher EVs nach, während sie rekombinante AAV-Vektoren mit therapeutischen Gensequenzen kapseln. Im Vergleich zu herkömmlichen AAVs verbesserten die konstruierten MSC-Vesikel die Genabgabeeffizienz und erzielten signifikant höhere Erträge mit weniger Zeit und Kosten im Vergleich zu natürlich ausgeschiedenen EV-AAVs. Zusammenfassend präsentieren wir eine neuartige, MSC-basierte Membran-Nanovesikelplattform, die die Vorteile von EV-nachahmenden Strukturen mit AAV-vermitteltem Gentransfer kombiniert. Dieser Ansatz verbessert die Liefereffizienz und die Skalierbarkeit der Produktion und bietet eine vielversprechende Strategie, um die Gentherapie in Richtung klinischer Translation voranzubringen.

Einleitung

Gentherapie stellt einen transformativen Ansatz zur Behandlung genetischer und erworbener Krankheiten dar, indem spezifische Gene eingeführt, ersetzt oder zum Schweigen gebracht werden, um die normale zelluläre Funktion wiederherzustellen. In den letzten zwei Jahrzehnten haben Fortschritte in der Vektortechnik und Bereitstellungsstrategien die therapeutische Landschaft der Gentherapie erheblich erweitert. Unter den verschiedenen entwickelten Vektorsystemen hat sich das adenoassoziierte Virus (AAV) aufgrund seines günstigen Sicherheitsprofils, effizienten Transduktions und langfristigen Genexpressions sowohl in teilenden als auch in nicht teilenden Zellen ^{1,2 als} eine der erfolgreichsten und am weitesten verbreiteten Plattformen hervorgewandelt. Bis heute haben mehrere AAV-basierte Therapeutika die behördliche Zulassung für den klinischen Einsatz erhalten, darunter Behandlungen für spinale Muskelatrophie, Netzhautdystrophien und Hämophilie, was wichtige Meilensteine in der translationalen Medizin markiert³. Der breite Tropismus und die niedrige Immunogenität der AAV-Vektoren haben ihre Anwendung auch auf verschiedene Gewebe ermöglicht, darunter Leber, Muskel, zentrales Nervensystem^{und Auge}. Dadurch ist AAV zu einer führenden Plattform für die In-vivo-Genlieferung geworden und unterstützt laufende präklinische und klinische Studien, die sich auf metabolische, neurologische und kardiovaskuläre Erkrankungen konzentrieren.

Trotz ihres bemerkenswerten klinischen Erfolgs steht die AAV-basierte Gentherapie vor mehreren intrinsischen Herausforderungen, die ihre breitere Anwendung weiterhin einschränken. Eine wesentliche Einschränkung liegt in der begrenzten Genomverpackungskapazität des AAV-Kapsids (~4,7 kb), was seine Verwendung zur Übertragung großer oder mehrerer therapeutischer Gene ^5,6 einschränkt. Darüber hinaus wird die Bioverteilung und zelluläre Tropie der AAV-Vektoren weitgehend durch ihre Serotypen bestimmt, die jeweils unterschiedliche Affinitäten zu bestimmten Geweben aufweisen. Obwohl umfangreiche Capsid-Engineering- und Peptidpräsentationsstrategien eingesetzt wurden, um die Effizienz der Gewebezielsetzung und Transduktion zu verbessern, bleibt das Erreichen eines präzisen und vorhersehbaren Tropismus in verschiedenen biologischen Kontexten eine bedeutende Hürde⁷. Eine weitere entscheidende Einschränkung ist die Verbreitung bereits vorhandener neutralisierender Antikörper (NAbs) gegen natürliche AAV-Serotypen in der menschlichen Population. Selbst niedrige Titer von NAbs können die Effizienz der Vektortransduktion erheblich verringern, was die Berechtigung der Patienten einschränkt und wiederholte Dosierungen^erschwert. Verschiedene Strategien, wie rationales Kapsid-Redesign, immunsuppressive Regime und transienten Plasmaaustausch, wurden erforscht, um antikörpervermittelte Neutralisation^10,11 zu mildern, doch diese Ansätze bieten nur teilweise oder vorübergehende Linderung. Zusammen verringern diese Einschränkungen die allgemeine therapeutische Wirksamkeit und Reproduzierbarkeit der AAV-vermittelten Genlieferung in klinischen Einrichtungen.

In den letzten Jahren wurde das extrazelluläre vesikelumhüllte AAV (EV-AAV) als alternativer Vektor erforscht, der das Potenzial hat, mehrere wesentliche Einschränkungen konventioneller AAVs^{12, 13, 14, 15} zu überwinden. Während der Vektorverpackung kann ein Teil der AAV-Partikel durch vesikuläre Transportwege ausgeschieden und in extrazellulären Vesikeln eingeschlossen werden. Es wird angenommen, dass dieser Prozess AAV-codiertes membranassoziiertes Accessory Protein (MAAP) umfasst, das das virale Austritt erleichtert und die Membranassoziation^{fördert 16,17}. Die resultierenden EV-AAV-Partikel zeigen eine verbesserte Transduktionseffizienz und eine verbesserte Resistenz gegen neutralisierende Antikörper im Vergleich zu herkömmlichen AAV, hauptsächlich aufgrund der vesikulären Membran, die die zelluläre Aufnahme fördert und eine teilweise Abschirmung vor Antikörpererkennung¹⁸ bietet. Trotz dieser Vorteile bleibt die EV-AAV-Produktion jedoch ineffizient. Typischerweise wird nur ein kleiner Bruchteil der Vektorgenome (etwa 0,5 %–12 %) als EV-assoziierte AAVs in das Kulturmedium absezerniert, während die Mehrheit intrazellulär bleibt oder als freie AAVs^12,13 existiert. Daher ist eine großflächige Produktion erforderlich, um eine ausreichende Vektorerträge zu erzielen. Darüber hinaus wurde die EV-AAV-Erzeugung hauptsächlich mit HEK293T Produzentenzellen nachgewiesen, deren EVs eine schnelle Leberbeseitigung, eine kurze Zirkulationshalbwertszeit und potenzielle Biosicherheitsbedenken aufweisen können. Diese Einschränkungen unterstreichen die Notwendigkeit einer effizienteren und anpassbareren Membranumhülle-Strategie, die die Entwicklung der in dieser Studie vorgestellten Zellmembran-AAV-Plattform (CME-AAV) motiviert.

Mesenchymale Stammzellen (MSCs) und ihre EVs wurden umfassend hinsichtlich ihres regenerativen Potenzials und ihrer immunausweichenden Eigenschaften untersucht. Über Therapien basierend auf Zellen oder natürlich sekretierten EVs hinaus haben aktuelle Studien einen alternativen Ansatz zur verbesserten Arzneimittelabgabe mit Nanopartikeln gezeigt, die mit MSC-Membranen^{umgeben sind.} Die MSC-Membranbeschichtung verleiht die aktive Zielbestimmung, verringert die Immunbeseitigung und verlängert die Zirkulationszeit, was wahrscheinlich auf die intrinsische molekulare Zusammensetzung von MSC-abgeleiteten Membranen zurückzuführen ^ist. Aufbauend auf diesem Konzept nutzten wir MSC-abgeleitetes Membranmaterial, um ein zellmembranumhülltes AAV (CME-AAV) Nanovesikel für die Genlieferung zu konstruieren. Um dies zu erreichen, wurden gereinigte MSC-Membranfragmente mit rekombinanten AAV-Partikeln gemischt und einem kontrollierten Extrusionsprozess unterzogen, einer ursprünglich für die Liposomenherstellung^{entwickelten Technik 24,25}. Durch größendefinierte Extrusion fügen sich die Membrankomponenten spontan zu nanoskaligen Vesikeln zusammen, die AAV-Partikel einkapseln. Die resultierenden CME-AAVs wurden weiter aus freien, nicht gekapselten AAVs mittels dichtegradientenbasierter Zentrifugation gereinigt. Diese Strategie ermöglicht eine effiziente und reproduzierbare Herstellung membranumhüllter AAV-Vektoren, die eine deutlich verbesserte Transduktionseffizienz im Vergleich zu herkömmlichen AAVs aufweisen und eine vergleichbare Resistenz gegen neutralisierende Antikörper wie EV-AAVs aufweisen. Durch die Substitution verschiedener Transgene bietet die CME-AAV-Plattform ein großes Potenzial zur Behandlung verschiedener genetischer und erworbener Krankheiten.

Protokoll

Alle Tierverfahren wurden vom institutionellen Komitee für Tierpflege und -nutzung der Beijing Normal University in Zhuhai, China, genehmigt. Die Reagenzien und die verwendeten Geräte sind in der Materialtabelle aufgeführt.

1. Vorbereitung und Bildung von CME-AAV mittels porengrößendefinierter Extrusion

1. Erzeugung rekombinanter AAV-Vektoren
   HINWEIS: Das AAV-Produktionsprotokoll folgt zuvor veröffentlichten und weit verbreiteten Verfahren. Detaillierte Optimierungsschritte und -variationen wurden in früheren Studien^{beschrieben 12,26}.
   1. Kultivieren Sie HEK293T Zellen im vollständigen Wachstumsmedium und halten Sie sie am Tag der Transfektion auf einer 70%-80%-Konfluenz.
   2. Bereiten Sie drei Plasmide vor, die (i) den AAV-Transfervektor codieren, der das interessierende Transgen trägt, (ii) die AAV-Rep/Cap-Gene, die dem gewünschten Serotyp entsprechen, und (iii) die adenoviralen Helferfunktionen.
   3. Kotransfektieren HEK293T Zellen mit den drei Plasmiden unter Verwendung einer etablierten Transfektionsmethode (z. B. Calciumphosphat- oder polymerbasierte Transfektion) gemäß der Standardlaborpraxis.
   4. Inkubieren Sie transfizierte Zellen für 48–72 Stunden, um die AAV-Assemblierung und -Akkumulation zu ermöglichen.
   5. Sammeln Sie Zellen und Kulturmedium und setzen Sie AAV-Partikel durch wiederholte Gefrier-Tau-Zyklen oder eine vergleichbare Zelllysemethode frei.
   6. Zentrifugiere das Lysat mit niedriger Geschwindigkeit, um Zellreste zu entfernen und das Überlagermittel mit AAV-Partikeln zu sammeln.
   7. Reinigen Sie AAV-Partikel mit Dichtegradienten-Ultrazentrifugation oder einer anderen etablierten Reinigungsmethode.
   8. Tauschen gereinigte AAV-Vektoren in sterile, phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS) aus und lagern Aliquots bei −80 °C bis zur Nutzung.
2. Herstellung der MSC-Membranfraktion
   HINWEIS: Humane mesenchymale Stammzellen (MSCs) wurden gemäß institutionellen Richtlinien isoliert. Die Zellen wurden unter festgelegten Bedingungen oder labormodifizierten Protokollen kultiviert und erweitert. Die MSC-Identität kann durch die Bewertung der Expression phänotypischer Marker wie CD73, CD90 und CD105 mittels Durchflusszytometrie bestätigt werden. Die Multipotenz von MSCs wird durch ihre Fähigkeit bestätigt, sich in vitro in Osteoblasten, Chondrozyten und Adipozyten zu differenzieren. Die Zellen sind entnahmebereit, sobald sie eine 70%-90%ige Konfluenz erreichen. Die folgenden Verfahren müssen nicht zwangsläufig unter sterilen Bedingungen durchgeführt werden.
   1. Entferne das Kulturmedium und trenne MSCs mit einem Zellschaber von der Kulturschale.
   2. Sammeln Sie abgetrennte Zellen in ein konisches Rohr mit PBS und zentrifugieren Sie bei 300 × g für 5 Minuten bei 4 °C, um die Zellen zu pelletieren.
   3. Waschen Sie die Zellen zweimal mit PBS und zentrifugieren Sie jeweils bei 300 × g für 5 Minuten bei 4 °C.
   4. Die Endzell-Pellets in PBS mit einem Proteaseinhibitor-Cocktail erneut suspendieren.
   5. Die Zellsuspension wird drei Zyklen von Gefriertau unterzogen, um die Plasmamembran zu zerstören und ein grobes Zelllysat zu erzeugen.
   6. Pipettieren Sie das Lysat gründlich, um es zu homogenisieren, und zentrifugieren Sie dann bei 1.000 × g für 20 Minuten bei 4 °C, um Zellreste zu entfernen.
   7. Übertragen Sie das Überstandsmittel in ein neues Rohr und zentrifugieren Sie bei 18.000 × g für 1 Stunde bei 4 °C, um die Membranfraktion zu pelletieren.
   8. Entsorgen Sie das Supernatant und suspendieren Sie das resultierende Membranpellet in PBS. Diese Suspension stellt die rohe MSC-Membranfraktion dar und wird für die AAV-Verkapselung verwendet.
   9. Homogenisieren Sie die Membransuspension, indem Sie sie sequentiell durch Spritzen mit 20 G bis 27 G Nadeln führen.
   10. Bestimmen Sie die Proteinkonzentration der homogenisierten Membransuspension mittels eines BCA-Tests. Aliquot und lagern Sie die Federung bei −80 °C oder gehen Sie direkt zu den folgenden Schritten. Die Membransuspension wird nach jedem Auftauzyklus mit einer 27-G-Spritze wieder homogenisiert.
3. Bildung von CME-AAV durch Extrusion
   1. Die vorbereitete Membransuspension mit AAVs zu einem definierten Verhältnis von 150 μg Membranprotein pro 1 × 10:¹⁰ Genomkopien (g.c.) von AAV mischen. Die Mischung bei 37 °C 30 Minuten mit sanftem Schütteln inkubieren lassen.
   2. Laden Sie das Membran-AAV-Gemisch auf einen Mini-Extruder, der mit einer 400-nm-Polycarbonat-(PC)-Membran ausgestattet ist. Die Probe wird 20 Mal durch den Extruder geführt, um die Membran-AAV-Kapselung zu fördern.
   3. Ersetzen Sie die 400-nm-PC-Membran durch eine 200-nm-Membran und wiederholen Sie den Extrusionsprozess 20 Mal, um die Heterogenität der Vesikelgröße weiter zu verringern.
   4. Sammeln Sie die verarbeitete Mischung ein. Wenn eine größere Menge benötigt wird, werden mehrere Extrusionschargen zusammengelegt. Die resultierende Suspension enthält CME-AAVs sowie ungekapselte AAVs und leere Membranvesikel. Begeben Sie sich sofort zur CME-AAV-Reinigung.

2. Reinigung von CME-AAV durch Dichtegradientenzentrifugation

HINWEIS: Dieser Schritt beschreibt die Trennung von reinem CME-AAV von ungekapselten AAVs, Proteinaggregaten und Rest-Nukleinsäuren mittels iodixanolbasierter Dichtegradienten-Ultrazentrifugation. Das aus diesem Schritt gewonnene gereinigte CME-AAV ist sowohl für In-vitro - als auch in vivo-Studien geeignet. Alle Eingriffe werden empfohlen, unter einer sterilen Gewebekulturhaube durchzuführen.

1. Herstellung des Iodixanol-Gradienten
   1. Bereiten Sie 40 % und 25 % Iodixanollösungen vor, indem Sie die Grundstückslösung mit 10 × PBS und sterilem deionisiertem Wasser verdünnen, um eine Endkonzentration in 1× PBS zu erreichen.
   2. In einem 13,2 mL offenen, dünnwandigen ultraklaren Rohr wird vorsichtig ein diskontinuierlicher Dichtegradient hergestellt, indem man 1 ml 40 % Iodixanol und 3 ml 25 % Iodixanol von unten legt.
   3. Schichten Sie vorsichtig 7 mL der CME-AAV-enthaltenen Federung, die aus Schritt 1.14 gewonnen wurde, auf den oberen Rand des Gefälles. Balancieren Sie die Röhren und laden Sie sie in einen Schwenkschaufel-Ultrazentrifugenrotor.
2. Ultrazentrifugation und Sammlung von CME-AAV-Fraktionen
   1. Zentrifugieren Sie den Gradienten bei 150.000 × g für 3 Stunden bei 4 °C mit schneller Beschleunigung und langsamer Verzögerung (Stufe 9 bzw. Stufe 1).
   2. Entferne vorsichtig die Röhren vom Rotor, ohne den Gefälle zu stören. Sammeln Sie 1-mL-Fraktionen von oben bis unten in beschriftete 1,5-mL-Mikrozentrifugenröhren (F1-F11). Halten Sie alle Fraktionen auf Eis.
   3. Identifizieren und kombinieren Sie die Fraktionen F7 und F8, die die gereinigten CME-AAVs enthalten, in ein neues offenes Ultrazentrifugenrohr. PBS zu einem Gesamtvolumen von 11 ml hinzufügen und vorsichtig mit einer 1-ml-Pipette mischen.
3. Waschen und Bergung von CME-AAV
   1. Zentrifugiere die gesammelten Fraktionen erneut bei 150.000 × g für 3 Stunden bei 4 °C mit schneller Beschleunigung und schneller Verzögerung (Stufe 9 für beide Einstellungen).
   2. Entsorgen Sie vorsichtig den Überstandsstoff und suspendieren Sie das CME-AAV-Pellet in 50–200 μL sterilem PBS, abhängig von der gewünschten Konzentration.
   3. Aliquot nach Bedarf und bis zur weiteren Verwendung bei −80 °C lagern.

3. Charakterisierung von CME-AAV mittels Transmissionselektronenmikroskopie (TEM)

HINWEIS: Die Transmissionselektronenmikroskopie (TEM) wird verwendet, um die Morphologie, Größe und Membranstruktur von CME-AAV-Teilchen zu visualisieren. Das Verfahren folgt einem standardisierten Negativfärbungsprotokoll, ähnlich dem bei extrazellulären Vesikeln. Alle Schritte werden bei Raumtemperatur durchgeführt, sofern nicht anders angegeben.

1. Probenvorbereitung und -fixierung
   1. Verdünnen Sie die gereinigte CME-AAV-Suspension aus Schritt 2 auf eine Konzentration von etwa 1 × 10^9-1 × 10¹⁰ Partikel/mL in PBS.
   2. Fixieren Sie die Probe, indem Sie ein gleiches Volumen frisch vorbereitetes 4%-Paraformaldehyd (Endkonzentration 2%) hinzufügen und 30 Minuten bei Zimmertemperatur inkubieren.
   3. Legen Sie ein Formvar/kohlenstoffbeschichtetes Kupfergitter (200-Mesh) auf eine Paraffinfolie, mit der Kohlenstoffseite nach oben.
   4. Pipettieren Sie 10 μL der festen CME-AAV-Federung auf das Gitter und ermöglichen Sie eine Adsorption von 30 Minuten bei Raumtemperatur. Vermeiden Sie das Trocknen während der Adsorption.
   5. Entferne vorsichtig überschüssige Flüssigkeit vom Gitterrand mit Filterpapier, ohne die Mitte zu berühren.
2. Waschen und Nachfixierung
   1. Lasse das Gitter mit der Probenseite nach unten auf einem 50-μL-Tropfen PBS für 2 Minuten zum Waschen schwimmen. Wiederhole das zweimal.
   2. Übertragen Sie das Gitter für 5 Minuten auf einen 50-μL-Tropfen mit 1 % Glutaraldehyd, um die Membranstruktur zu stabilisieren.
   3. Waschen Sie das Gitter nacheinander fünfmal mit Tropfen deionisierten Wassers (je 30 S), um Puffersalze zu entfernen. Nach dem letzten Waschen vorsichtig abtupfen.
3. Negativfärbung
   1. Legen Sie das Gitter für 1 Minute auf einen 50-μL-Tropfen mit 2 % wässrigem Uranylacetat, um eine negative Färbung zu erzielen.
   2. Entfernen Sie überschüssige Flecken, indem Sie vorsichtig mit Filterpapier die Gitterkante berühren und bei Zimmertemperatur vollständig an der Luft trocknen lassen.
4. Bildgebung
   1. Untersuchen Sie die gefärbten Gitter mit einem Transmissionselektronenmikroskop, das mit 200 kV betrieben wird.
   2. Aufnahme repräsentativer Bilder mit Vergrößerungen zwischen 30.000 ×und 120.000× um die CME-AAV-Morphologie und Membranintegrität zu bewerten.
   3. Optional können die Partikeldurchmesser mit TEM-Bildanalysesoftware gemessen werden, um die Konsistenz der Vesikelgröße mit NTA-Ergebnissen zu bestätigen.
      HINWEIS: Probenkonzentration – CME-AAV-Konzentration anpassen, um eine moderate Partikeldichte zu erhalten; Übermäßig konzentrierte Proben führen zu Partikelüberlappungen, während zu verdünnte Proben nur wenige nachweisbare Vesikel liefern. Artefakte vermeiden – Unvollständiges Waschen kann Salzkristalle hinterlassen, die die Partikelsichtbarkeit erschweren. Stellen Sie sicher, dass die Gitter während der Färbung hydratisiert bleiben, um einen Membrankollaps zu verhindern. Alternative Färbungen – Phosphotungstische Säure (PTA, 1%-2 %, pH 7,0) kann als Alternative zu Uranylacetat verwendet werden, sofern radioaktive Handhabungsbeschränkungen gelten. Lagerung – Vorbereitete Gitter können mehrere Tage vor der Bildabnahme bei Raumtemperatur in einem staubfreien Behälter aufbewahrt werden, wobei eine sofortige Beobachtung für den besten Kontrast empfohlen wird.

4. Quantifizierung von CME-AAV mittels qPCR

HINWEIS: Dieser Schritt beschreibt eine qPCR-basierte Methode zur Quantifizierung von CME-AAV-Genomkopien (g.c./μL). Das Protokoll legt großen Wert auf die CME-AAV-spezifische Probenvorbereitung und Datenberichterstattung. Alle anderen Aspekte der qPCR-Einrichtung und des Zyklus sollten der Standardlaborpraxis und den Anweisungen des Herstellers für das ausgewählte qPCR-Kit folgen.

1. Probe und Standardzubereitung
   1. Tauen Sie Aliquots von gereinigtem CME-AAV auf Eis auf und vermischen Sie sie sanft durch Pipetten. Vermeide Vortexen.
   2. Bereiten Sie die AAV-Standardverdünnungen von 1 × 10⁶ bis 1 × 10³ g.c./μL durch sequentielle 10-fache Verdünnungen mit nukleasefreiem deionisiertem Wasser oder TE-Puffer vor. Bereiten Sie Standards frisch oder Aliquot vor und lagern Sie bei −20 °C für den kurzfristigen Gebrauch.
   3. Bereiten Sie folgende Kontrollen vor: eine No-Template-Kontrolle (NTC; Wasser), eine negative Kontrolle (PBS oder Blankmatrix) und eine positive Kontrolle (AAV-Probe bekannter Konzentration), falls vorhanden.
   4. Bereiten Sie die qPCR-Mastermischung auf Eis gemäß den Anweisungen des Herstellers für die gewählte Chemie (Farbstoff- oder Sondenbasis) vor.
2. qPCR-Radfahren und Datenanalyse
   1. Führe den qPCR mit den vom Hersteller des qPCR-Mastermix-Mixen empfohlenen Zyklus-Parametern durch.
   2. Erzeugen Sie eine Standardkurve, indem Sie C_t (y-Achse) versus log₁₀ (Standardkonzentration in g.c./μL) (x-Achse) abbilden. Passen Sie eine lineare Regression an, um Steigung (m) und y-Intercept (b) zu erhalten.
   3. Berechnen Sie die CME-AAV-Genomkonzentration für jede Probenreplikation mithilfe der Regressionsgleichung:
      oder
      
      wobei C Genomkopien pro μL sind.
   4. Durchschnittliche technische Replikationen und die endgültige CME-AAV-Konzentration als g.c./μL angeben.
      HINWEIS: Da die Wärmedenaturierung während der qPCR-Vorbereitung sowohl die umhüllende Membran als auch die AAV-Kapside stört, ist keine separate DNA-Extraktion erforderlich. Führen Sie keine DNase-Behandlung an Proben vor der Wärmelyse durch; DNase kann auf AAV-Genome zugreifen und sie abbauen, sobald Kapsiden/Membranen gestört sind, aber bevor die Probe Temperaturen erreicht, die DNase inaktivieren. Standards müssen, wo möglich, abgestimmt werden: Erstellen Sie eine Standardkurve aus einem gut charakterisierten AAV-Standard. Wenn sich Ihre Proben oder Standards in der Genomkonfiguration unterscheiden (einsträngiges AAV vs. selbstkomplementäres/doppelsträngiges AAV), passen Sie die gemeldeten Werte entsprechend an. Primer/Probe-Design: Primer können jede konservierte AAV-Sequenz anvisieren; als Beispiel werden häufig Primer verwendet, die auf den CMV-Promotor (stromaufwärts vom Transgen) abzielen.

5. Quantifizierung von CME-AAV-Teilchenprofilen

1. Verwenden Sie Nanopartikel-Tracking-Analyse (NTA), abstellbare resistive Pulsmessung (TRPS) oder vergleichbare Partikelanalyse-Techniken, um die Größenverteilung und Partikelkonzentration von CME-AAV-Präparaten zu bestimmen.
2. Taue CME-AAV-Proben auf Eis auf und homogenisiere vorsichtig durch Pipettieren vor der Analyse. Führen Sie Messungen nach Standardlaborverfahren und den Anweisungen des Herstellers für das ausgewählte Instrument durch, wie in den zuvor veröffentlichten Protokollen 12,27,28,29 beschrieben.

6. In-vitro-Analyse des CME-AAV-vermittelten Gentransfers

HINWEIS: Dieser Schritt beschreibt das Verfahren zur Bewertung der CME-AAV-vermittelten Genlieferung und der Transgenexpression in kultivierten Zellen. Der Test wird mit HEK293T Zellen und CME-AAV9 demonstriert. EGFP, kann aber auch an andere Zelltypen oder Reporter-Konstrukte angepasst werden. Konventionelles (nicht membranumhülltes) AAV9. EGFP dient als positive Kontrolle, während PBS oder leere AAV-Partikel als negative Kontrollelemente verwendet werden.

1. Zellpräparation
   1. Kultur HEK293T Zellen unter Standardbedingungen (DMEM mit 10 % FBS, 1 % Penicillin-Streptomycin) bei 37 °C bei 5 % CO₂.
   2. Säe die Zellen in 48- oder 96-Well-Platten aus, um etwa 70 % Konfluenz zum Zeitpunkt der Transduktion zu erreichen (typischerweise 24 Stunden nach der Aussaat). Passen Sie die Aussaatdichte entsprechend der Bohrlochgröße an (z. B. ~5 × 10⁴ Zellen/Brunnen für 48-Bohrloch-Platte oder ~1 × 10⁴-Zellen/Brunnen für 96-Bohrloch-Platten).
   3. Lass die Zellen 24 Stunden anheften und ausgleichen, bevor du Vektoren hinzufügst.
2. Vektoranwendung
   1. Bereiten Sie CME-AAV9 vor. EGFP und AAV9. EGFP funktionieren Lösungen im sterilen PBS. Typische Virusdosis: 5 × 10⁸ g.c. pro 48-Bohrloch (anpassen nach Promotorstärke, Zielgen und experimentellen Zielen).
   2. Für jedes Bohrloch werden gleiche Genomkopien (g.c.) von CME-AAV9 hinzugefügt. EGFP oder AAV9. EGFP direkt an das Kulturmedium.
   3. Beziehen Sie Negativkontrollbohrlöcher mit einem äquivalenten Volumen an PBS oder leeren AAV-Partikeln ein.
   4. Drehen Sie die Platte vorsichtig, um eine gleichmäßige Verteilung zu gewährleisten, und kehren Sie zurück in den Inkubator.
   5. Inkubation wird 24–72 Stunden fortgesetzt, abhängig von Promotoraktivität und Transgenexpressionskinetik. Für CMV-getriebenes EGFP in HEK293T Zellen wird typischerweise innerhalb von 48 Stunden starke Fluoreszenz beobachtet.
3. Bildgebung und Lebendzellanalyse
   1. Wenn Sie zur Bildgebung bereit sind, aspirieren Sie vorsichtig das Kulturmedium und waschen Sie die Zellen zweimal mit PBS, um ungebundene Partikel zu entfernen. Vermeiden Sie es, Zellen zu lösen.
   2. Färbe Zellkerne mit Hoechst 33342 (lebende Zell-kompatibel) gemäß den Anweisungen des Herstellers. Verwenden Sie kein DAPI für lebende Zellen.
   3. Führen Sie Live-Cell-Fluoreszenzbildgebung mit einem invertierten Fluoreszenzmikroskop mit geeigneten Filtern durch (z. B. Anregung 488 nm/Emission 513 nm für EGFP; Anregung 350 nm/Emission 460 nm für Hoechst).
   4. Verwenden Sie 10× oder 20× Ziele zur Quantifizierung der Transduktionseffizienz und 63× Ziel für hochauflösende subzelluläre Lokalisierung, falls erforderlich.
   5. Erfassen Sie mindestens fünf Sichtfelder pro Bohrloch (z. B. vier Ecken und eine Mitte) mit identischen Bildparametern (Belichtungszeit, Verstärkung, Blende usw.).
   6. Speichern Sie alle Bilder in Raw- und Graustufenformaten für quantitative Analysen.
4. Quantitative Bildanalyse
   1. Öffnen Sie Bilder in ImageJ (FIJI) oder einer gleichwertigen Software.
   2. Messen Sie die mittlere Fluoreszenzintensität für sowohl die EGFP- als auch die Hoechst-Kanäle für jedes Feld.
   3. Bestimmen Sie die Hintergrundintensität, indem Sie einen Bereich ohne fluoreszierendes Signal auswählen und Pixelwerte mitteln.
   4. Berechnen Sie die korrigierte Intensität für jeden Kanal:
      Ich_{habe korrigiert} = Ich_meine –_{I-Hintergrund}
   5. Berechnen Sie die normalisierte Intensität für jedes Feld als:
      
   6. Durchschnittliche normalisierte Intensitäten von mindestens fünf Feldern pro Bohrloch und berichten den Mittelwert ± SD über drei unabhängige biologische Replikate.
      HINWEIS: CME-AAV zeigt typischerweise eine erhöhte Fluoreszenzintensität im Vergleich zu herkömmlichem AAV, wenn gleiche Genomkopien angewendet werden, was eine verbesserte zelluläre Aufnahme und/oder Schutz vor neutralisierenden Antikörpern widerspiegelt. Die optimale Transduktionseffizienz hängt von der Qualität der CME-AAV-Vorbereitung, dem Zelltyp, der Promotorstärke und dem viralen Titer ab. Wenn schwache Signale beobachtet werden, erhöhen Sie die Genomkopie-Eingabe, bestätigen Sie die Vektorintegrität mittels qPCR und überprüfen Sie die Kalibrierung des Mikroskops. Andere fluoreszierende Reporter (z. B. mCherry, mNeonGreen, tdTomato) oder Luziferase-Konstrukte können je nach experimentellen Bedürfnissen verwendet werden. Bei der Arbeit mit primären oder nicht haftenden Zellen passen Sie die Aussaat- und Bildgebensbedingungen entsprechend an (z. B. Beschichtung von Platten mit Poly-L-Lysin oder Verwendung von Kammerobjektträgern).

7. Bewertung von CME-AAV – vermittelte Genlieferung in einem Mausmodell

HINWEIS: Dieser Schritt beschreibt die Bewertung der CME-AAV-vermittelten Genlieferung in vivo mittels eines Mausmodells.

1. Tierzubereitung
   1. Verwenden Sie Wildtyp-Mäuse wie C57BL/6. Stellen Sie sicher, dass alle Tierverfahren vom institutionellen Komitee für Tierpflege genehmigt und gemäß den einschlägigen Vorschriften durchgeführt werden.
   2. Wählen Sie Mäuse im Alter von 4-6 Wochen für optimale Konsistenz zwischen den Experimenten aus.
   3. Tiere unter normalen Unterbringungsbedingungen mit ad libitum Zugang zu Futter und Wasser vor der Injektion halten.
2. Vektorvorbereitung und -abgabe
   1. Wählen Sie einen AAV-Serotyp entsprechend dem Untersuchungszweck und dem Zielgewebe aus. In dieser Studie werden AAV9 und CME-AAV9 verwendet.
   2. Bereite virale Vektoren vor, die ein Luciferase-Reporter-Gen codieren (z. B. CME-AAV9.luciferase), für nicht-invasive Bildgebung.
   3. Verdünnen Sie die viralen Vektoren in steriler Kochsalzlösung auf eine Endkonzentration von 1 × 10¹° Genomkopien (g.c.) pro 50 μL pro Maus.
   4. Erwärmen Sie den Schwanz vorsichtig mit einem Heizkissen oder warmem Wasser, um die Vene vor der Injektion zu erweitern.
   5. Laden Sie 50 μL Virussuspension in eine 31-G-Insulinspritze ein und injizieren Sie langsam in die laterale Schwanzvene, um Leckage und Venenruptur zu minimieren.
   6. Nach der Injektion bringen Sie die Mäuse zurück in ihre Käfige und überwachen sie, bis sie vollständig genesen sind.
3. Biolumineszenzbildgebung in vivo
   1. Zwei Wochen nach der Verabreichung betäuben Sie die Mäuse mit Isofluran (gemäß institutionell genehmigten Protokollen) und injizieren Sie D-Luciferin (150 μg/g Körpergewicht; Sigma) intraperitoneal in PBS.
   2. Setzen Sie die narkosierten Mäuse in ein biolumineszenz-Bildgebungssystem.
   3. Nehmen Sie alle 2 Minuten nach der Injektion Lumineszenzbilder auf, bis das Signal ein Plateau erreicht.
   4. Quantifizieren Sie Biolumineszenz mit geeigneter Software. Definieren Sie Interessengebiete (ROIs) um lumineszente Bereiche und berechnen Sie den gesamten Photonenfluss (Photonen/s) für jedes Tier.
   5. Beziehen Sie AAV9.luc-behandelte und PBS-injizierte Gruppen als positive bzw. negative Kontrollgruppen zum Vergleich ein.
4. Ex-vivo-Bildgebung
   HINWEIS: Dieser Schritt ist optional.
   1. Unmittelbar nach der In-vivo-Bildgebung werden die Mäuse eingeschläfert und wichtige Organe gesammelt (Leber, Herz, Milz, Niere und Gehirn).
   2. Bilden Sie die isolierten Organe unter identischen Bildparametern mit demselben IVIS-System ab, um die gewebespezifische Luciferase-Expression zu bestimmen.
      HINWEIS: Alternative Verabreichungswege (z. B. intramuskuläre, intrazerebrale oder peritoneale Injektion) können je nach experimentellen Zielen gewählt werden. Die Biolumineszenzintensität spiegelt sowohl die Effizienz der Genabgabe als auch die Gewebeverteilung wider. Die CME-AAV-vermittelte Luziferase-Expression zeigt typischerweise einen früheren Beginn und eine erhöhte Spitzenexpression im Vergleich zur freien AAV, bedingt durch membranvermittelte Endozytose durch aufnehmende Zellen. Sorgen Sie für eine einheitliche Luciferindosis, Zeit- und Bildgebenseinstellungen über alle Proben hinweg für einen genauen Vergleich. Die beschriebene Virusdosis (1 × 10¹° g.c. pro Maus) liefert typischerweise ein nachweisbares Signal 2–4 Wochen nach der Injektion, aber Optimierung kann für verschiedene Vektoren oder Tiermodelle erforderlich sein.

Ergebnisse

Die in dieser Studie verwendeten MSCs wurden gemäß den entsprechenden ethischen Richtlinien aus menschlichem Nabelschnurgewebe isoliert. MSC-Membranfraktionen wurden gemäß dem beschriebenen Protokoll hergestellt. AAV9. EGFP wurde intern mit einem transienten Dual-Plasmid-Transfektionssystem in HEK293T Zellen produziert, wie zuvor^{berichtet wurde 12,26}. Für CME-AAV-Fertigung, Membranpräparate und AAV9. EGFP wurde mit einem Verhältn...

Diskussion

Kritische Schritte des CME-AAV-Protokolls

Dieses Protokoll beschreibt eine Methode zur Erzeugung von MSC-membranumhüllten AAVs, und mehrere Schritte sind entscheidend für eine erfolgreiche CME-AAV-Bildung. Erstens ist eine sorgfältige Vorbearbeitung der Zellmembran unerlässlich. Ziel dieses Schrittes ist es, Membranfragmente zu gewinnen, die sich für die Extrusion eignen, während gleichzeitig die Kontamination durch Kern-DNA, zytosolische Prot...

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Biolumineszenz-Bildgebungssystem	PerkinElmer	IVIS Spectrum optisches Bildgebungssystem (Lumina III)
D-Luciferin-Kaliumsalz	Yeasen Biotechnology	40902ES03
Fötales Rinderserum	Yeasen Biotechnology	40130ES76
Fluoreszenzmikroskop	Zeiss	Axio Observer 7
Formvar/kohlenstoffbeschichtete Kupfergitter 200 Mesh	Millipore-Sigma	TEM-FCF400CU
Glutaraldehyd	Millipore-Sigma	354400
HBSS	Gibco	C14175500BT
Hieff Unicon qPCR TaqMan Probe Master Mix	Yeasen Biotechnology	11205ES08
High-Glucose Dulbecco's modifiziertes Eagle-Medium	Hyclone	SH30243
Hochgeschwindigkeitszentrifuge	Beckman Coulter	Avanti J-E
Hoechst 33342	Beyotime	C1022
NTA-Instrument	Malvern Panalytical	NanoSight NS300
Offenes dünnes Ultraklar-Röhrchen für Ultrazentrifuge	Beckman Coulter	344059
OptiPrep Iodixanol	Millipore-Sigma	D1556
Paraformaldehyd 4%	Beyotime	P0099
PBS	Biosharp	BL302A
Penicillin-Streptomycin	Millipore-Sigma	V900929
qPCR-Instrument	Applied Biosystems	QS6 Echtzeit-PCR-System
Rotor für Hochgeschwindigkeitszentrifuge	Beckman Coulter	JA-25.50
SW 41 Ti Swing-Bucket-Rotor für Ultrazentrifuge	Beckman Coulter	331362
Transmissionselektronenmikroskop	JEOL	JEM-2100F
Ultrazentrifuge	Beckman Coulter	Optima XE-100
Uranylacetat	Electron Microscopy Sciences	NC1375332
Whatman Nuclepore Polycarbonatmembranfilter (200 nm)	Cytiva	10417004
Whatman Nuclepore Polycarbonatmembranfilter (400 nm)	Cytiva	10417104