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Reproduzierbarer 3D-Glioblastom-Migrationstest mit magnetischer Nanopartikel-vermittelter sphäroider Lokalisierung unter hypoxischen Bedingungen

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DOI:

10.3791/70365

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12. Mai 2026

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1Department of Physiology & Medical Physics, Centre for Systems Medicine, Royal College of Surgeons in Ireland, 2Cellular and Molecular Imaging Core, Royal College of Surgeons in Ireland

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Wir präsentieren ein 3D-Glioblastom-Migrationsmodell unter Verwendung von von Patienten abgeleiteten magnetischen Gliomsphären, die aus neu diagnostizierten und wiederkehrenden Tumoren erzeugt wurden. Diese Plattform ermöglicht die Visualisierung patientenspezifischer Migrationsdynamiken und die Bewertung der therapeutischen Wirksamkeit. Der Test kann nach der Migration multiplexiert werden, um die Proteinlokalisierung und Expressionsmuster zu bewerten.

Zusammenfassung

Wir beschreiben einen reproduzierbaren 3D-Migrationsassay, um das migratorische und invasive Potenzial von patientenabgeleiteten Glioblastomgliomen aus neu diagnostizierten und wiederkehrenden Tumoren unter klinisch relevanten hypoxischen Bedingungen zu modellieren. Gleichmäßig große Gliomsphären werden auf eine dünne Schicht extrazellulärer Matrix übertragen und mit magnetischen Eisenoxid-Nanopartikeln kokultiviert, was ihre zentrale Lokalisierung in Kulturbrunnen durch Platzierung auf einen magnetischen Plattenhalter ermöglicht. Die Einbeziehung von magnetischen Eisenoxid-Nanopartikeln beim Seeding ermöglicht eine präzise, lokalisierte Bildgebung einzelner patientenabgeleiteter Gliomsphären mittels einer sanften magnetischen Kraft und optimiert automatisierte Bildverarbeitungspipelines durch Reduzierung der Positionsvariabilität. Dieser Test unterstützt eine detaillierte Untersuchung des Migrationsverhaltens von Glioblastomen in einer physiologisch relevanten Mikroumgebung und ermöglicht einen direkten Vergleich des invasiven Potenzials und des Migrationsverhaltens zwischen neu diagnostizierten und rezidivierenden patientenabgeleiteten Gliomsphären. Die Methode ist kompatibel mit der Lebendzellbildgebung und multiplexierter Analyse und bietet eine skalierbare Plattform für die präklinische Untersuchung der Glioblastomwanderung, des invasiven Potenzials und der therapeutischen Wirkung.

Einleitung

Das Glioblastom bleibt eine der bedeutendsten Herausforderungen in der Neuroonkologie. Diese Erkrankung wird durch umfangreiche Heterogenität zwischen und innerhalb der Patienten, eine robuste Ausweichung der Reaktion auf Standardbehandlung, Resistenz gegen apoptotische Induktion und bemerkenswerte Plastizität als Reaktion auf Umweltbedingungenverursacht 1. In jüngerer Zeit hat die Komplexität des Tumormikroumfelds (TME) erhebliche Aufmerksamkeit erregt, insbesondere die dynamische Natur von gliomartigen Stammzellen (GSCs), die Phänotyp und Zellzustand als Reaktion auf Veränderungen der Mikroumgebungwechseln können 2,3. Diese phänotypische Plastizität fördert das Fortschreiten des Tumors und trägt trotz aggressiver Standardbehandlung zu einem unvermeidlichen Rückfall bei. Die chirurgische Resektion bleibt die effektivste Intervention zur Verbesserung der Patientenprognose, jedoch ist aufgrund der stark infiltrativen und mikroskopisch invasiven Natur des Glioblastoms eine vollständige Tumorentfernung nicht möglich4. Die Modellierung der invasiven Dynamik von Patientenproben über verschiedene Krankheitsstadien und bei tumorspezifischen Erkrankungen erleichtert ein tieferes Verständnis der dynamischen und plastischen Fähigkeit der Glioblastom-Migration und hilft so, wirksame neuartige Behandlungsansätze zu identifizieren5. Daher ist es unerlässlich, physiologisch relevante Modelle zu entwickeln, die patientenspezifische Invasions- und Migrationsdynamiken erfassen, um die präklinische Forschung zu verbessern und diese Ziele voranzutreiben. Darüber hinaus sind solche Modelle entscheidend für die Bewertung der Wirksamkeit neuartiger Anti-Tumor-Therapien, die theoretisch in Kombination mit Operationen entwickelt werden könnten, um eine residuale mikroskopische Invasion zu verhindern und letztlich das Rückfallrisiko zu verringern. Die Komplexität des Glioblastoms rechtfertigt die Notwendigkeit fortschrittlicher, komplexer präklinischer Modelle, die wichtige architektonische Merkmale des Tumors nachbilden können. Patientenbasierte dreidimensionale Modelle haben zunehmend Aufmerksamkeit erlangt wegen ihrer Fähigkeit, Zell-zu-Zell-Interaktionen zu erhalten, Gradienten von Nährstoffen, Sauerstoff und therapeutischen Wirkstoffen aufrechtzuerhalten und die strukturelle Integrität nativer Tumorezu replizieren 6,7. Die Visualisierung dieser 3D-Modelle stellt jedoch technische Herausforderungen dar, darunter die Positionierung der Sphäroide, Bildvariabilität und die Reproduzierbarkeit des Assays.

Hier beschreiben wir ein patientenspezifisches 3D-Glioblastom-Migrationsmodell, das unter hypoxischen Bedingungen durchgeführt wird und die Untersuchung der Migrationsdynamik über Proben aus verschiedenen Tumorsubtypen und Krankheitsstadien ermöglicht, einschließlich therapienaiver und wiederkehrender Tumorproben. Diese Plattform ermöglicht die Bewertung unterschiedlicher Reaktionen auf therapeutische Wirkstoffe und unterstützt Multiplex-Postmigrationsanalysen durch Bildsegmentierung, wodurch quantitative Bewertungen von Migrationsdynamik, Sphäroidwachstum und Proteinexpression ermöglicht werden. Die Einbindung magnetischer Eisenoxid-Nanopartikel ermöglicht eine konsistente Zentralisierung der Sphäroide innerhalb jedes Bohrlochs durch das Anlegen einer sanften magnetischen Kraft8. Kugeloide, die in Standard-Mehrbrunnenplatten kultiviert werden, zeigen oft eine Tendenz, sich den Brunnenrändern zuzubewegen, ein Verhalten, das vermutlich durch die Bildung flüssiger Menisken und periphere Verdunstung beeinflusst wird, insbesondere in Bohrlöchern am Plattenrand 9,10,11. Diese Phänomene führen zu Bilddartefakten und Hintergrundrauschen, insbesondere während der Durchgangslichtmikroskopie, was die Zeitrafferabbildung der Invasionsdynamik erschweren kann. Im Gegensatz zu 2D-Monoschichtkulturen, bei denen Bereiche gleichmäßiger Zelldichte für die Bildgebung ausgewählt werden können, erfordern Einzelsphäroid-Invasionstests eine präzise und konsistente Positionierung des gesamten Sphäroid- und Migrationsbereichs innerhalb des Bildgebungsfeldes. Dies stellt eine zusätzliche Herausforderung dar, da Drift oder unregelmäßige Positionierung innerhalb des Bohrlochs die Datenqualität und Reproduzierbarkeit beeinträchtigen kann. Daher minimiert die konsequente Zentralisierung von Sphäroiden innerhalb von Mehrbrunnenplatten diese Herausforderungen und verbessert nicht nur die Bildqualität, sondern auch die experimentelle Konsistenz, Bildverarbeitungspipelines und Nachmigrationsanalysen. Zusätzlich fördert das Initiieren von Sphäroidkulturen bei gleichmäßiger Zelldichte in diesen spezialisierten Sphäroidkulturplatten die reproduzierbare Sphäroidbildung, wodurch die Variabilität in Morphologie, Wachstumsrate und struktureller Integrität verringertwird 10,11. In der Praxis liegen typische Gliomsphären in diesen Assays zwischen 150–300 μm im Durchmesser und bilden sich unter standardisierten Zelldichten reproduzierbar. Kulturen werden unter hypoxischen Bedingungen (1 %–2 %O2) aufrechterhalten.

Die hier beschriebene Plattform unterstützt moderate bis hohe Durchsatzformate wie 96-Well-Platten, ermöglicht mehrere Replikationen pro Patientenprobe und ist skalierbar für Arzneimittelscreenings oder Multi-Condition-Assays12 . Die Optimierung der sphäroiden Positionierung und der Kulturbedingungen ist daher unerlässlich, um die Robustheit und klinische Relevanz der 3D-präklinischen Modelle zur Untersuchung des invasiven Gliompotenzials und anderer dynamischer zellulärer Prozesse zu verbessern.

Protokoll

Patientenabgeleitete Glioblastomzellen wurden von Erasmus MC, Rotterdam, Niederlande, und dem Hospital for Sick Children (Toronto, Kanada) bereitgestellt. Die primären Patientenproben für diese Linien wurden im Rahmen routinemäßiger Resektionen von Patienten unter ihrer informierten Einwilligung entnommen (ethische Zulassungsnummern, MEC-2013-090, 0020010404).

1. Vorbereitung magnetischer patientenabgeleiteter Gliomsphären (Abbildung 1)

  1. Mindestens 30 Minuten vor der Dissoziation der Gliomsphäre sollte ausreichend Zellablösungsenzym-Medium und Gliomasphärenmedium für das Experiment bereitgestellt werden (typischerweise 1 ml pro konfluentiver T75-Kolben) und beide auf Raumtemperatur gebracht werden.
  2. Unter sterilen Bedingungen werden Gliomsphären aus dem Kulturkolben durch sanfte Aspiration mit einer 10 mL serologischen Pipette und einer Pipettenhilfe aufgenommen und in ein 15 mL konisches Rohr übertragen. Zentrifugiere bei 300 x g für 3 Minuten. Entsorge das Supernatant vorsichtig, ohne die Zellkugel zu stören.
  3. Das Pellet in 1 ml Raumtemperatur-Zellabscheidungsenzymmedium wieder suspendieren und 10–15 Minuten inkubieren, wobei alle 2–3 Minuten sanft durch Pipettieren mit einer P1000-Pipette bewegt wird, um die Dissoziation in eine einzelne Zellsuspension zu erleichtern.
  4. Fügen Sie ein gleiches Volumen Gliomasphären-Medium hinzu, um das Enzym zu deaktivieren. Zentrifugieren Sie die Einzelzellensuspension bei 300 x g für 3 Minuten bei 37 °C, dann lassen Sie das Zellpellet vorsichtig in 3–5 mL vollständigen Gliomasphärenmediums resuspendieren, abhängig von der Größe des Zellpellets, wobei das genaue Volumen für die anschließende Zellzählung notiert wird.
    HINWEIS: Die Zeit der Enzymmedium-Inkubation hängt weitgehend von der Größe der Gliomsphären in der Kultur ab; vor der Anwendung wird immer visuell inspiziert und entsprechend angepasst.
  5. Nehmen Sie ein repräsentatives 10 μL Aliquot der Einzelzellsuspension und mischen Sie es vorsichtig mit 10 μL Trypan Blue in einem 1,5 mL Mikrozentrifugenrohr. Laden Sie 10 μL dieser Mischung in ein Hämozytometer oder einen automatisierten Zellzähler ein, um lebensfähige Zellen zu bestimmen.
  6. Säe 500 einzelne Glioblastomzellen pro Bohrloch in eine ultra-niedrige Anheftung 96-Well-Sphäroid-Mikroplatte. Die optimale Aussaatdichte kann je nach Patientenproben variieren.
  7. Fügen Sie pro Bohrloch 1 μg/mL Propidiumiodid (PI) und 0,05 μL Eisenoxid-Nanopartikel hinzu (zum Beispiel verwenden Sie 1,5 μL magnetische Nanopartikel für 20 Sphäroide, was etwa 10.000 Einzelzellen entspricht). Stellen Sie sicher, dass Eisenoxid-Nanopartikel vor der Zugabe homogenisiert werden, indem Sie mit einem auf 100 μL eingestellten P100 nach oben und unten pipettieren.
    HINWEIS: Das Volumen der verwendeten Eisenoxid-Nanopartikel kann je nach verwendeter Zelllinie optimiert werden, jedoch reichten in diesem Fall 1,5 μL pro 10.000 Zellen aus, um die Sphäroide zentral zu lokalisieren. Dieses Setup gewährleistet eine konstante Sphäroidgröße über alle Patientenproben hinweg und ermöglicht einen direkten Vergleich der Invasions- und Wachstumsdynamik während des Invasionstests.
  8. Inkubieren Sie die Platten 48 Stunden lang in einem befeuchteten Zellkulturinkubator bei 37 °C, 5 %CO2 und 21 %O2 , um die Bildung der Gliomasphäre zu ermöglichen.

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Abbildung 1: Gleichmäßig große und lokalisierte Gliomsphären, kokultiviert mit Eisenoxid-Nanopartikeln. (A) Gliomsphären, die aus neu diagnostizierten und wiederkehrenden Patiententumoren stammen, zeigen duale Phänotypen und zufällige Zell-zu-Zell-Assoziationen. (B) Schematische Darstellung der gleichmäßig großen Sphäroidenbildung innerhalb von 48 Stunden nach der Aussaat. (C) Durchgelassenes Lichtbilder von Gliomsphären, die 48 Stunden lang in runder sphäroider Mikroplatte ohne (oberes Panel) und mit (unterem Panel) Eisenoxid-Nanopartikeln kultiviert wurden. Beachten Sie das dunkle, gesprenkelte Erscheinungsbild von Gliomsphären, die Eisenoxid-Nanopartikel enthalten. (D) Gliomasphärenpositionierung zeigt eine zufällige Lokalisierung von Gliomsphären, die ohne Nanopartikel kultiviert wurden (oben) im Vergleich zur konsistenten zentralen Lokalisierung der mit Nanopartikeln kultivierten (unten), was zu reduziertem Hintergrundrauschen und verbesserter Bildqualität führt. Skala = 100 μm. Schaltplan erstellt mit Biorender.com. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.

2. Herstellung von extrazellulären Matrix (ECM) beschichteten Mehrfachbrunnenplatten (1 Stunde vor dem Migrationsassay)

  1. Aliquot und lagere das ECM gemäß den Anweisungen des Herstellers. Taue über Nacht langsam ein 1 mL Aliquot ECM (1:10 Verdünnung) auf Eis bei 4 °C auf. Unmittelbar vor der Beschichtung bereiten Sie eine endgültige Arbeitslösung bei 1:100 (v/v) vor, indem Sie eine weitere 1:10-Verdünnung des 1:10-Materials in eiskalten vollständigen Neurosphärenmedium durchführen. Lassen Sie das verdünnte ECM jederzeit auf Eis, um eine vorzeitige Polymerisation zu verhindern. Bewahre diese Verdünnung immer auf Eis, da ECM bei Raumtemperatur schnell polymerisiert.
  2. Geben Sie 50 μL der 1:100 ECM-Arbeitslösung in jede Mulde einer 96-Well-Platte mit klarem flachem Boden oder μClear-Bottom-Platte ab. Inkubieren Sie die Platte mindestens 1 Stunde bei 37 °C, damit das ECM aushärtet und in jedem Bohrloch eine dünne Matrix bildet.
  3. Nach der Inkubation werden vorsichtig 30 μL aus jedem Bohrloch entfernt, wobei 20 μL polymerisiertes ECM (Endkonzentration 1:100 v/v) am Boden jedes Bohrlochs verbleiben. Das ECM muss in dieser Zeit so kalt wie möglich gehalten werden, da es bei Raumtemperatur schnell polymerisiert. Die Bildgebungsplatte kann auch vorgekühlt und während dieses Prozesses auf Eis gelagert werden.
     

3. Bildgebungsplattenaufbau und Live-Zell-Bildgebung

  1. Am Tag des Tests (48 Stunden nach der Gliomasphären-Aussaat) wird die ECM-beschichtete Mikroplatte auf einen magnetischen 96-Well-Plattenantrieb gelegt, wie in Abbildung 2B,C dargestellt. Sterilisieren Sie die magnetische Platte, indem Sie mit 70 % Ethanol sprühen und sie trocken abwischen, nicht einweichen.
  2. Untersuchen Sie Sphäroide visuell auf Qualität und Gleichmäßigkeit. Mit einer Pipette wird 80 μL Medium mit der einzelnen Gliomasphäre aus jedem Bohrloch übertragen und sanft mit der ECM-Oberfläche auf die Platte gepipettiert.
    HINWEIS: Bei besonders großen Sphäroiden sollten Sie darauf achten, die Scherspannung während des Transfers zu minimieren; dies kann erreicht werden, indem man mit einer Schere 1–2 mm von der Spitze einer P100-Pipettenspitze abschneidet, um die Öffnung zu verbreitern und mechanische Schäden zu verringern. Stellen Sie sicher, dass die Schere vor der Anwendung unter UV-Temperatur sterilisiert wurde. Am wichtigsten ist, die Zugabe von Luftblasen zu minimieren, da dies einen großen Einfluss auf die Bildgebung hat.
  3. Behandle Sphäroide nach dem experimentellen Design. Bereiten Sie die Behandlungslösungen bei den gewünschten Konzentrationen in 20 μL-Volumina vor und geben Sie diese 20 μL zu jedem Brunnen mit den Sphäroiden, um ein Endvolumen von 100 μL zu erreichen.
    HINWEIS: Die Behandlung von Gliomsphären auf diese Weise reduziert das Pipetieren und minimiert das Risiko, die Sphäroide aus dem Brunnen zu entfernen.
  4. Übertragen Sie die Platte, während sie auf dem Magnetantrieb verbleibt, auf das Bildgebungssystem für Live-Aufnahmen. Seien Sie vorsichtig beim Entfernen der Platte aus dem magnetischen Halter und halten Sie sie so gerade wie möglich, um die Bewegung der Kugeln vom Zentrum des Brunnens zu minimieren.
  5. Führen Sie Live-Imaging mit einem programmierbaren invertierten Live-Zell-Mikroskop durch, das mit einem Plan-Apochromat 5x/0,35 NA-Objektiv, einer 0,5x-Röhrenlinse, einer Axiocam 506-Kamera (Binning =2) und Verwendung von Zen 3.1 (Blue Edition) Software ausgestattet ist. Die Pixel-zu-Mikron-Kalibrierung ist im Bildgebungssystem integriert und wird automatisch von der Software übernommen, daher ist keine manuelle Kalibrierung erforderlich. In diesem Fall wird eine Bildgebung mit einer Vergrößerung von 2,5x (5x Objektiv mit 0,5x Röhrenobjektiv) durchgeführt, wobei die Kamera auf 2 x 2 vergrößert wird, was zu einer Kalibrierung von 1 Pixel = 3,645 μm führt.
  6. Stellen Sie die Umweltkontrollen so ein, dass 1 % Sauerstoff und 5 %CO2 vorhanden sind, mit einem sehr langsamen Luftstrom vom Gasmischer. Dies hilft, unerwünschte Verdunstung zu verhindern, wenn die einströmende Luft durch eine Luftbefeuchtungsflasche geleitet wird.
  7. Um eine Verschiebung der Gliomasphäre während der anfänglichen Bildgebungsphase zu verhindern, reduzieren Sie die Stufenbeschleunigung und -geschwindigkeit des Mikroskops auf 10 %, um die Bewegung über die ECM-Oberfläche vor der sphäroiden Adhäsion zu minimieren.
  8. Laden Sie die Multiwell-Platte ohne Magnetantrieb vorsichtig ins Mikroskop. Falls zutreffend, stellen Sie sicher, dass das Plattenmaterial in der Software ausgewählt wird, damit die Optik entsprechend angepasst wird.
  9. Verwenden Sie eine geeignete Vergrößerung, die das gesamte invasive Sichtfeld abdeckt. Zum Beispiel wurden bei Cell Discoverer 7 das 5-fache Objektiv und das 0,5-fache Röhrenobjektiv gewählt, um eine 2,5-fache Vergrößerung zu erzielen.
  10. Jede Gliomasphäre lokalisieren, fokussieren und eine Position zuweisen, die die x-y-z-Koordinaten enthält. Hardware-Autofokussierung, sofern verfügbar, sollte verwendet werden, um eine konsistente Abbildung derselben Brennebene während des gesamten Experiments sicherzustellen.
  11. Überprüfen Sie sowohl den Phasengradientenkontrast (durchgelassenes Licht) als auch den Fluoreszenzkanal und passen Sie die Belichtungszeit sowie Lichtintensität an, um sicherzustellen, dass keine Überbelichtung vorliegt. Excite Propidiumiodid (Totezellfärbung) mit einer 590-nm-LED. Emission wird mit einem Quad-Bandpassfilter erfasst, der das Wellenlängenband 618–756 nm erfasst. Dies kann je nach Filtern und Lichtquelle bei anderen Mikroskopen variieren.
  12. Stellen Sie sich so ein, dass jede Stunde für die gewünschte Anzahl von Tagen Bilder gemacht werden.

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Abbildung 2: Beschreibung der Aufbau der Bildplatten. (A) Schaltplan, das das beschriebene Protokoll darstellt. (B) Bild der Mehrwellplatte neben dem magnetischen Plattenantrieb und einfache Montage der Mehrfachbohrerplatte auf dem magnetischen Antrieb, wobei jeder einzelne Magnet im Zentrum jedes Bohrlochs lokalisiert ist, was die Gliomasphärenlokalisierung erleichtert. Schaltplan erstellt mit Biorender.com. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.

4. Fixierung von Sphäroiden nach Invasionstest zur multiplexierten Proteinanalyse (Abbildung 3)

  1. Nach Abschluss des Invasionstests wird jeder Brunnen mit 100 μL PBS gewaschen. Dadurch steigt das Volumen auf 200 μL/Well. Wiederholen Sie diesen Schritt, indem Sie anschließend 100 μL PBS entfernen und durch weitere 100 μL PBS ersetzen.
  2. Entferne vorsichtig 200 μL Medium, gib dann 100 μL 4%-Paraformaldehyd (PFA) zu jedem Brunnen und inkubiere 10 Minuten bei Raumtemperatur unter einer Abzugshaube.
    VORSICHT: Paraformaldehyd ist eine giftige Chemikalie, und Vorsicht ist geboten, um das Risiko oder die Exposition zu minimieren.
  3. Nach der Fixierung entfern Sie das PFA aus jedem Brunnen und waschen Sie dreimal mit PBS, indem Sie das PFA entfernen und jedes Mal 100 ml PBS hinzufügen.
  4. Fügen Sie eine Immunfärbung gemäß den Anweisungen des Herstellers hinzu. Alternativ kann man zur Langzeitlagerung Natriumazid (0,02 %) dem PBS hinzufügen, um die Sterilität zu gewährleisten, und die Platte mit einer transparenten Folie versiegeln. Lagern Sie bei 4 °C, bis sie benötigt werden.

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Abbildung 3: Repräsentative Proteinanalyse nach dem Migrationstest der Gliomsphären im Zentrum vs. am Rand des Brunnens. Laser-Scanning-Konfokalmikroskopie rekurrierender Gliomsphären, immungefärbt mit einem Antikörper, der auf den Glioblastom-Stammzellmarker CD44-Post-Migrationstest abzielt. CD44-FITC (grün) und Hoechst (Kerne, blau). Skala = 100 μm. Pfeilspitzen zeigen den Rand des Brunnens an. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.

5. Bildverarbeitungspipeline der patientenabgeleiteten Migrationsdynamik

HINWEIS: Aus Erfahrung mit unserem Datensatz empfehlen wir, dass der Verarbeitungscomputer einen Multicore-Prozessor mit hoher Basiskernfrequenz und einer beträchtlichen Speichermenge besitzt, da die Weka-Verarbeitung eine hohe Kernanzahl sehr gut nutzt und je nach Datensatzgröße den verfügbaren Speicher nutzt.  Verwendete und empfohlene Spezifikation wie unten aufgeführt.  Beachten Sie, dass GPU-Verarbeitung in diesem Workflow nicht verwendet wird.
CPU: >= 6 Kerne | >= 2 GHz (empfohlen); 32 Kerne | 2,1 GHz (gebraucht)
Speicher: > 32 GB (empfohlen); 192 GB (gebraucht)

  1. Open Fiji13 [derzeit wird die enthaltene ImageJ-win64.exe ausführbare Datei für die Analyse verwendet]. Bild öffnen, indem man zu – Datei navigieren > Open Select Mehrkanal-Zeitraffer-Bilddatei (.czi) öffnet sich auf der Fiji-Schnittstelle (wenn das Skript verwendet wird, ist dies die Ergänzungsdatei 1).
  2. Wählen Sie die in der GUI benötigten Bilder aus. Am besten funktioniert es, wenn die invasivsten Gliomsphären im Experiment den Klassifikator zunächst trainieren (also gut kontrollieren – DMSO), da dieses Bild Details zu jedem Bildsegment liefert, z. B. das Aussehen eindringender/wandernder Zellen vs. Sphäroid vs. Hintergrund.
  3. Dann navigiere zu Bild > Farb- > Split-Kanälen – so wird das Bild in zwei Kanäle getrennt – in diesem Fall einen mit Propidiumiodid-Färbung und der andere mit durchgelassenem Licht.
  4. Wählen Sie den Kanal zur Segmentierung aus – in diesem Fall den übertragenen Lichtkanal, der die Migrationsdynamik darstellt. Navigieren Sie zu Plugins > Segmentierung > Trainable WEKA Segmentation14.
  5. Umbenennen die beiden Standardklassen als: Klasse 1: Gliomasphäre; Klasse 2: Invasion/Migration. Fügen Sie eine dritte Klasse namens Hintergrund hinzu (optional, aber empfohlen), indem Sie zu Einstellungen > Neue Klasse > Hintergrund navigieren.
  6. Mit dem Freeline-Tool annotieren Sie Trainingsregionen innerhalb jedes Bildstacks und jeder Klasse, indem Sie auf die repräsentativen Regionen zeichnen, d. h. einen Wirbel im Sphäroid zeichnen und auf "Zu Sphäroid hinzufügen " klicken, wiederholen Sie dies für das Invasionsgebiet und den Hintergrund, bis alle Regionen in jeder Klasse vertreten sind. Trainiere den Klassifikator, indem du auf Train-Classifier klickst. Zusätzliche Bilder können annotiert werden, um den Klassifikator bei Bedarf weiter zu trainieren und die Genauigkeit zu verbessern.
  7. Wenn zufrieden ist, speichern Sie das trainierte Klassifikatormodell mit einem Dateinamen wie CellLine_Treatment_Classifier.model. Schließen Sie das Segmentierungsfenster, wenn Sie fertig sind.
  8. Für neue Bilder mit diesem gespeicherten Klassifikator gehen Sie zu Plugins > Segmentation > Trainable WEKA Segmentation >Load Classifier> Open Saved Classifier CellLine_Treatment_Classifier (dies speichert eine .model-Datei ). Es ist eine Voraussetzung für Supplementary File 2 , dies vor der Ausführung des Skripts vorbereitet zu haben. Wenn das Skript gestartet wird, muss die entsprechende Beispieldatei ausgewählt werden).
  9. Navigieren Sie, um die Wahrscheinlichkeit auf der Trainable WEKA Segmentierungsschnittstelle zu erhalten – Dies erzeugt Wahrscheinlichkeitskarten für jede ausgewählte Klasse, z. B. Gliomasphäre, Invasion/Migration, Hintergrund, die die Wahrscheinlichkeit anzeigen, dass jeder dem Bild zugewiesene Pixelwert zur spezifischen Klasse oder Region des Bildes gehört. Dies erzeugt eine Datei mit 3 separaten Bildern von Wahrscheinlichkeitskarten (Gliomasphäre, Invasion, Hintergrund) mit einem 32-Bit-Dynamikumfang für jedes Bild.
  10. Wählen Sie die Wahrscheinlichkeitskarte, die Invasion/Migration entspricht. Navigiere zu Bild- > Hyperstacks > Reduziere die Dimensionalität. Wählen Sie Quelle behalten.
  11. Kanale deaktivieren, aber Frames behalten – das reduziert die Karte über die Zeit auf einen einzelnen Kanal – in diesem Fall die Invasionswahrscheinlichkeitskarte. Wählen Sie die Wahrscheinlichkeitsabbildung, die der Gliomasphäre entspricht.
  12. Wiederholen Sie die Schritte 5.10-5.11. Es wird nun zwei Wahrscheinlichkeitskarten geben, die dem ursprünglichen ausgestrahlten Lichtzeit-Time-Lapse-Bild für eine Szene der Migration und das sphäroide Gebiet entsprechen. Speichern Sie beide nach folgender Dateinamenskonvention: ImageName_Scene_Gliomasphere_ProbabilityMap und ImageName_Scene_Invasion_Probability Map in einem Ordner, der dem ausgewählten Experiment entspricht, also CellLine_Treatment.
  13. Schwellenwert einstellen, um eine binäre Maske zu erstellen: Gehe zu Bild > > Schwelle anpassen. Wählen Sie eine Schwellenwertmethode (z. B. Yen, Otsu). Behalten Sie die ausgewählte Methode bei allen bearbeiteten Bildern gleich.
  14. Navigieren Sie, um > Messungen zu analysieren. Wählen Sie die gewünschten Maße aus; Tick Area, Integrated Density und Mean und drücke dann OK. Navigieren Sie zum Analysieren > Analysieren von Teilchen. Für Invasion/Migration Set-Größe: 0 – unendlich; Zirkularität: 0,00 – 1,00. Für Gliomsphären: Setgröße: typischerweise 1500 – Unendlich (entsprechend der Sphäroidgröße in der Zelllinie/Behandlung angepasst – Kontrollkugeln werden natürlich größer); Zirkularität: 0,05 – 1,00. Wähle Pixel-Einheiten für alle aus.
  15. Navigieren Sie zum Analysieren>Pixel-Analysieren> Anzeigen: Masken auswählen. Nachdem die Masken erzeugt wurden, überprüfen Sie den segmentierten Interessenbereich über den gesamten Zeitraffer-Stack, um eine genaue Verfolgung sicherzustellen. Wenden Sie binäre Operationen über Process > binäre > an ... (z. B. beim Verfeinern der Sphäroidmaske Fülllöcher auswählen), gefolgt vom Navigieren zu Analysieren > Teilchen analysieren > Zeigen > Nichts auswählen und Summarise auswählen. Dies bietet ein Zusammenfassungsfenster ausgewählter Messungen.
  16. Speichern Sie die Ergebnisse, indem Sie auf Datei > Speichern > Ergebnisse klicken. Speichere als .csv Datei. Öffnen Sie in einer Tabellenkalkulation oder einer anderen Analysesoftware.
  17. Wiederholen Sie die Schwellwertung und Teilchenanalyse für alle segmentierten Klassen (z. B. Gliomsphären, Invasion), um die jeweiligen Messungen über die Zeit zu extrahieren.  Die Ausgabe liefert .csv Fläche (in Pixeln oder Mikrometern, je nach Kalibrierung) über die Zeit.
  18. Wählen Sie den Fluoreszenzkanal, der die PI-Färbung repräsentiert (z. B. Kanal 2).  Wenden Sie Schwellenwerte und Partikelanalysen wie oben an, um tote Zellen zu identifizieren. Verwenden Sie das Calculator Plus-Plugin, um Masken von PI-positiven Zellen mit der Gliomasphärenmaske und separat mit den Invasionsmasken zu multiplizieren, um tote Zellen für die spezifischen Regionen zu quantifizieren.
  19. Exportieren Sie Masken, Wahrscheinlichkeitskarten und Zusammenfassungstabellen als TIFF- und CSV-Dateien mit klaren, beschreibenden Dateinamen für Dokumentation und nachgelagerte Analyse. Bei Verwendung des im Zusatz bereitgestellten Skripts findet sich folgende Benennungskonvention: z. B. FileName_Scene#_(PI-)Invasion_Summary.csv (Daten für Objekte über die Zeit), FileName_Scene#_(PI-)Invasion.zip (mit Analyseteilchen definierte Regionen).
    HINWEIS: Ergänzungsfile 1 erzeugt einzelne tif-Dateien mit Zeitrafferbildern für jede Szene. Supplementary File 2 führt die Weka-Pixelklassifikation basierend auf einer vordefinierten Klassifikationsmodelldatei auf allen Szenen und allen Bildern in jedem Zeitverlauf aus und liefert Wahrscheinlichkeitskarten für die Gliomasphäre sowie für die eindringenden Zellen. Supplementary File 3 wird alle Bilder in Gliomsphären und eindringende Zellen segmentieren und die abgedeckten Bereiche sowie die Aufteilung der von toten (PI-positiven) Zellen bedeckten Bereiche quantifizieren. Supplementary File 4 zum Ausführen nimmt eine bestimmte Schwellenwerte und auch eine bestimmte Region an, während Supplementary File 3 es dem Benutzer erlaubt, den Schwellenwert einzustellen und den Bereich für jede Szene anzupassen. Der Schwellenwert sollte nicht für jede Szene auf verschiedene Methoden geändert werden, sondern kann für jedes Objekt unterschiedlich eingestellt werden.

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Abbildung 4: Herausforderung der reproduzierbaren Bildverarbeitung aufgrund schlechter Gliomasphärensegmentierung. Eine Bildverarbeitungspipeline mit trainierbarem WERA-Segmentierungs-Plugin auf Fidschi, das (A) zentral lokalisierte Gliomasphäre mit größerer Segmentierung des Migrationsbereichs gegenüber dem Hintergrund zeigt im Vergleich zu (B) Gliomasphäre, die am Rand lokalisiert ist, führt zu schlechter Bildsegmentierung und unbrauchbarer Replikation. Durch die Sicherstellung von Konsistenz in der Gliomasphärenlokalisierung erscheint die Bildverarbeitung über biologische Replikate, wie in (A) gezeigt, was die Reproduzierbarkeit und Automatisierung der Assay erheblich verbessert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.

Ergebnisse

Mit dem beschriebenen 3D-Migrationstest unter hypoxischen Bedingungen wurden Gliomsphären von wiederkehrenden Patiententumoren entweder mit Vehikel oder Medikament X behandelt, und die Invasionsdynamik wurde alle Stunde für 72 Stunden überwacht. Abbildung 5 beschreibt die Weka-Segmentierungsanalyse der Invasionsdynamik und zeigt, dass Medikament X das invasive Potenzial rekurrierender Gliomsphären im Vergleich zu Vehicle-Kontrollen unter klinisch relevanten hypoxischen Bedingungen signifikant reduziert.

Um die Auswirkungen von Medikament X auf die Eigenschaften der Stammzellen nach der Migration weiter zu bewerten, wurden die Gliomsphären fixiert und immunfärbt für die Expression und Lokalisierung des Glioblastom-Stammzellmarkers CD44, wie in Abbildung 6 dargestellt. Diese multiplexierte Analyse erleichtert die Visualisierung der Migrationsdynamik und der Expression von Stammzellmarkern und liefert Einblicke darin, wie Medikament X sowohl das invasive Potenzial als auch die stammartigen Eigenschaften von rezidivierenden Glioblastom-Modellen unter klinisch relevanten hypoxischen Bedingungen moduliert.

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Abbildung 5: Optimierter Migrationstest hebt die Wirksamkeit des neuartigen Medikaments X zur Verhinderung wiederkehrender Gliomasphärenwanderung hervor. Patientenabgeleitete rezidivierende Gliomsphären wurden mit Vehikel oder Medikament X für 72 Stunden unter hypoxischen Bedingungen behandelt. Die Invasionsdynamik wurde alle Stunde für 72 Stunden aufgenommen. (A) Repräsentative Lichtaufnahmen der Invasionsdynamik bei 0 und 72 Stunden im oberen Panel – Fahrzeug behandelt und unteres Panel – Medikament X behandelt. (B) Repräsentative Wahrscheinlichkeitskarten der Invasionsfläche, die in der Segmentierungsanalyse verwendet werden. (C) Wiederkehrende Gliomsphären, die mit Medikament X behandelt wurden, zeigten ein signifikant weniger invasives Potenzial als vehikelbehandelte Gliomsphären. Die Quantifizierung des invasiven Bereichs bei 72 Stunden zeigte eine signifikant verringerte Invasion in mit Medikament X behandelten Gliomsphären, dargestellt als zum Zeitpunkt der Fixierung bedeckte Gesamtfläche. Die Daten repräsentieren das Invasionsgebiet über die Zeit von n=3 unabhängigen Replikaten. Die statistische Signifikanz wurde mit einem ungepaarten t-Test bewertet; p < 0,005 wird durch ** angezeigt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.

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Abbildung 6: Migration und Expression des Stammzellmarkers nach der Behandlung. Die in Abbildung 5 beschriebenen Gliomsphären wurden nach der Migration fixiert und immunfärbt mit einem Antikörper, der auf den Glioblastom-Stammzellmarker CD44 abzielt, nach Behandlung mit entweder Vehikel oder Medikament X. Diese Abbildung zeigt die Art der multiplexierten Postmigrationsanalyse, die mit standardisierten Immunfärbungstechniken durchgeführt werden kann. Bilder zeigen CD44-FITC (grün) und Hoechst (Kerne, blau). Skala = 200 μm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Ergänzende Datei 1: Speichern von Multiscene CZI-Dateien vom Mikroskop als einzelne Szenen als TIF-Dateien.Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Ergänzende Datei 2: Erzeugung von Wahrscheinlichkeitsabbildungen mit einem Weka-Modell.Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Ergänzende Akte 3: Segmentierungsanalyse ohne Schwellenwert. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Ergänzende Datei 4: Segmentierungsanalyse mit Schwellenwert. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Diskussion

Die Modellierung der invasiven Dynamiken hochaggressiver Tumore wie Glioblastom ist entscheidend, um unser Verständnis der Krankheitsprozesse zu verbessern und wirksamere Behandlungsstrategien zu identifizieren. Die komplexe, adaptive und plastische Natur der Glioblastomzellmigration erfordert präklinische Modelle, die das dynamische Verhalten einzelner Gliomzellen genau erfassen können, während sie von der zentralen Tumormasse wandern. Wichtig ist, dass die Modellierung dieser Prozesse über patientenbasierte Proben aus verschiedenen Krankheitsstadien hinweg Forschern ermöglicht, die Herausforderung der Tumorheterogenität besser anzugehen und stadiumspezifische Veränderungen in der Invasionsdynamik zu erkennen.

Angesichts dieser Komplexität ist es vernünftig anzunehmen, dass präklinische Modelle über ein gleichwertiges Maß an Raffinesse verfügen sollten. Hier beschreiben wir eine verfeinerte Methode zur Erzeugung gleichmäßig großer, patientenabgeleiteter Gliomsphären, die mit Eisenoxid-Nanopartikeln kokultiviert werden. Dieser Ansatz ermöglicht eine kontrollierte Lokalisierung der Gliomsphären im Zentrum jedes Brunnens und ermöglicht so automatisierte Live-Zell-Bildgebung der Invasionsdynamik. Mehrere Studien haben eine signifikante Variabilität der Größe, Form und Wachstumskinetik der Sphäroide bei herkömmlichen 3D-Kulturmethoden hervorgehoben. Sayde und Kollegen zeigten, dass Sphäroide große Durchmesserverteilungen zwischen denen, die aus unsortierten und sortierten Krebsstammzellpopulationen stammen, aufweisen können, was die inhärente Variabilität in der Sphäroidenbildung widerspiegelt15,16. Diese Heterogenität wurde auch als Hauptquelle für Reproduzierbarkeitsprobleme in sphäroidbasierten Drogenscreening-Tests identifiziert, was die Bedeutung der Erzeugung homogener sphäroider Populationen weiter unterstreicht12. Diese Ergebnisse unterstreichen die Notwendigkeit, die Bedingungen der Sphäroidbildung vor der Durchführung funktionaler Analysen zu standardisieren – Herausforderungen, die diese Methode direkt angeht. Durch die Standardisierung sowohl der Sphäroidgröße als auch der Position verbessert diese Methode die Reproduzierbarkeit erheblich und minimiert die typischerweise mit 3D-Zellkultursystemen verbundene Variabilität, bei denen ungleichmäßige Sphäroidbildung die nachgelagerte Analyse beeinflussen kann.

Während der anfänglichen Entwicklung dieses Tests beobachteten wir erhebliche Variabilität in der sphäroiden Lokalisierung über Replikate, was die Verwendung einer großen Anzahl von Brunnen pro Experiment, aber auch vieler biologischer Replikate erforderte, um statistisch signifikante Ergebnisse zu erzielen. Dies erhöhte nicht nur die Arbeitsbelastung erheblich, sondern erzeugte auch eine erhebliche Menge unbrauchbarer Daten, verringerte die Assay-Effizienz und Reproduzierbarkeit. Die daraus resultierende Variabilität spiegelte daher den Verlust quantifizierbarer Daten wider und nicht Unterschiede im Invasionsverhalten. Durch die Zentralisierung der Gliomsphären innerhalb jedes Bohrlochs stellt die magnetische Lokalisierung sicher, dass Bilder aller Replikate konsistent segmentiert und analysiert werden können, selbst wenn biologische Unterschiede in der Invasionsdynamik zwischen den Proben beobachtet werden.

Die Einbindung von Eisenoxid-Nanopartikeln führt zu einer sanften magnetischen Kraft, die die Gliomsphären über alle Bohrungen hinweg zentralisiert und so die Leistung der Bildverarbeitungspipeline, der Datenverarbeitung und der Nachmigrationsanalysen erheblich verbessert, ohne die Biologie oder Lebensfähigkeit der Gliomasphärezu beeinträchtigen 8. Ein wesentlicher Vorteil dieses Systems ist seine Kompatibilität mit postmigrationsmultiplexierten Analysen; zum Beispiel zeigt Abbildung 6 die Analyse der Visualisierung des Glioblastom-Stammzellmarkers CD44, was die Bewertung der stammartigen Zellexpression nach Migration und Behandlung über Patientenproben hinweg ermöglicht. Diese Fähigkeit unterstreicht das Potenzial der Plattform für integrative Studien, die invasive Phänotypen mit molekularen Merkmalen verknüpfen – ein wichtiger Aspekt angesichts der phänotypischen Plastizität von glioblastom-stammartigen Zellen als Reaktion auf mikroökologische Hinweise und deren Fähigkeit, Behandlung zu umgehen und das unvermeidliche Tumorrückfall zu fördern.

Obwohl dieser Assay die Reproduzierbarkeit der Visualisierung der Dynamik einzelner Sphäroideninvasionen erheblich verbessert, bleiben einige kritische Einschränkungen für die zukünftige Assay-Optimierung berücksichtigt werden. Matrigel ist ein weit verbreitetes Modell der Basalmembran, ist jedoch ein komplexer, undefinierter extrazellulärer Matrix (ECM)-Ersatz, der aus murinen Sarcomen abgeleitet ist und die menschlicheGehirnmikroumgebung nicht vollständig repapituliert. Eine zukünftige Optimierung des Tests könnte gehirnspezifische ECM-Modelle integrieren, um die Mikroumgebung des Gehirntumors besser nachzuahmen, was wir für einen wichtigen Optimierungsschritt der In-vitro-Gehirninvasionsmodellehalten. Obwohl Matrigel weiterhin ein weit verbreitetes Modell der ECM ist, stellt es eine nicht-gehirnspezifische extrazelluläre Matrix dar, die aus dem Mausarkom abgeleitet ist. Dementsprechend reproduziert es nicht vollständig die biochemischen und mechanischen Eigenschaften der Mikroumgebung des menschlichen Gehirns. Wichtig ist, dass die hier beschriebene magnetische Lokalisierungsstrategie matrixunabhängig ist und in zukünftigen Studien leicht an hirnspezifische ECM-Systeme angepasst werden könnte, um die physiologische Relevanz weiter zu erhöhen.

Weitere Überlegungen des Tests sind die potenziellen Anforderungen für das Training eines neuen Weka-Segmentierungsmodells für jede Zelllinie aufgrund der Probenheterogenität und Variabilität in der Invasionsmorphologie. Zusätzlich sollten sowohl die Saatdichte als auch die Nanopartikelkonzentration für jede Zelllinie und jeden Sphäroidtyp optimiert werden, um Gleichmäßigkeit und Lebensfähigkeit vor der Durchführung von Hochdurchsatz-Migrationstests zu gewährleisten. Ungeachtet dieser Einschränkungen bietet diese Plattform einen skalierbaren und anpassungsfähigen Rahmen zur Untersuchung patientenspezifischer Glioblastom-Invasion und Behandlungsreaktion. Seine Kompatibilität mit Live-Zell-Imaging, automatisierten Segmentierungspipelines und multiplexierten Postassay-Analysen eröffnet Möglichkeiten für hochwertige Screenings neuartiger Therapeutika, Kombinationstherapien und mechanistische Untersuchungen von Invasionen aus hoch heterogenen Proben von Patiententumoren. Darüber hinaus liefert die Erweiterung dieses Tests auf Kokultursysteme wie ansässige Gehirnzellen wie Astrozyten, Neuronen und Mikroglia oder Modelle von Interaktionen der Blut-Hirn-Barriere zusätzliche Einblicke in Tumorstroma-Interaktionen, die das Fortschreiten und das Wiederauftreten des Glioblastoms antreiben.

Während der Assay-Entwicklung wurden mehrere technische Schritte als entscheidende Determinanten für Reproduzierbarkeit und Gesamtleistung identifiziert. Die Standardisierung der Aussaatdichte der Zelllinien vor dem Test stellt sicher, dass die anfängliche Größe der Gliomasphäre konstant bleibt, was das Wachstum der Sphäroiden über Zelllinien, Behandlungen und Bedingungen hinweg vergleichbar macht. Ohne diesen Standardisierungsschritt fügen die anfänglichen Sphäroidgrößen eine signifikante Variabilität hinzu, die dann die variablen Reaktionen der Gliomsphären auf experimentelle Bedingungen widerspiegeln kann. Eine präzise zentrale Lokalisierung der Gliomsphären innerhalb jedes Bohrlochs ist eine zentrale Voraussetzung für eine präzise automatisierte Bildaufnahme und nachgelagerte Segmentierung. Nicht zentrierte Sphäroide führten zu erheblichem Bildrauschen und verhinderten die Nutzung der Weka-Segmentierung als Mittel, um die Bilder in klar definierte Bereiche zu segmentieren. Indem sichergestellt wird, dass alle Gliomasphären im Zentrum lokalisiert sind, kann derselbe WOMA-Klassifikator mehrfach verwendet werden, da das Rauschen erheblich reduziert und sich die Bildqualität dramatisch verbessert. Eine Darstellung davon ist in Abbildung 1 dargestellt. Die Einbindung magnetischer Eisenoxid-Nanopartikel ist daher eine Methode, um die zentrale Platzierung der Gliomsphären sicherzustellen, die Positionsvariabilität zu minimieren und die Bildverarbeitung sowie Vergleichbarkeit zwischen Replikaten erheblich zu verbessern. Schließlich stellt das Training des Segmentierungsmodells innerhalb der WOMA-Pipeline einen weiteren kritischen Standardisierungsschritt dar. Aufgrund der interpatientischen Heterogenität und Unterschieden in der Invasionsmorphologie lässt sich ein einzelnes Segmentierungsmodell möglicherweise nicht auf alle Proben verallgemeinern. Das Umtrainieren oder Verfeinern der Klassifikationsparameter für jede Zelllinie gewährleistet genaue Wahrscheinlichkeitskarten invasiver Gebiete und verhindert Quantifizierungsfehler.

Insgesamt bietet dieser Test eine reproduzierbare und skalierbare Plattform, um die dynamischen invasiven Verhaltensweisen von Patienten abgeleiteten Gliomproben in Echtzeit zu untersuchen. Seine Kompatibilität mit multiplexierter Bildgebung und nachgelagerten molekularen Analysen macht es zu einem leistungsstarken und vielseitigen Werkzeug sowohl für grundlegende als auch für translationale Gliomforschung, was die translationale Relevanz präklinischer Glioblastommodelle erheblich steigern wird.

Offenlegungen

Nichts zu offenbaren

Danksagungen

Diese Arbeit wurde von Research Ireland (Science Foundation Ireland) unter dem Fördercode 20391A01 und dem Health Research Board unter dem Fördercode ERA-TRANSCAN-2022-002 unterstützt. Die Zellen wurden freundlicherweise von unseren Mitarbeitern im Dirks Lab, SickKids, Toronto und dem Erasmus Medical Center (EMC), Rotterdam, bereitgestellt.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
96-WELL-BIODRUCK-KIT, KLARGreiner655840
AccutaseInvitrogen00-4555-56n/a
B-27 Supplement (50X), Serum  frei ohne Vitamin AGibco1258701010%
Basisischer Fibroblastenwachstumsfaktor, Human  (bFGF)PeproTech100-18B20  ng/ml
Celldiscoverer  7Zeiss-
Corning-Sphäroid-MikroplattenCorningCLS4515
Corning-MatrigelmatrixCorning3542341:100 Endverdünnung
Countess Automatisierter ZellenzählerInvitrogen-
DMEM-F12  (500 ml)Thermofischer11320-074n/a
Epidermaler Wachstumsfaktor Mensch (EGF)PeproTechAF-100-1520  ng/ml
FITC-Maus-Anti-Mensch CD44BD Pharmingen5554781:100
Greiner CELLSTAR 96 Polystyrol-Zellkultur-Mikroplatten mit F-Boden/Schornsteinbrunnen, &; Klar, schwarz, TC, steril, mit DeckelGreiner655090
HeparinThermofischerA161985µ g/ml
Hoechst 33258  Sigma Aldrich (Merck)8614051&Micro; g/ml
NanoShuttle-PLGreiner6578411.5  &Mikro; l/10.000 Zellen
Penicillin – StreptomycinMerckP43331%

Referenzen

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