Methodenartikel

Isolierung ventrikulärer Kardiomyozyten aus einem Mausmodell der Doxorubicin-Kardiotoxizität

DOI:

10.3791/70411

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27. Februar 2026

 ,  ,  , 
1Advanced Institute for Medical Sciences, Dalian Medical University, 2School of Basic Medical Sciences, Xi'an Jiaotong University, 3East China Normal University Health Science Center

In diesem Artikel

Zusammenfassung

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dieses Protokoll beschreibt eine reproduzierbare, Langendorff-freie Methode zur Isolierung lebensfähiger kardiozykulärer kardiomyozyten adulter Maus aus einem doxorubicininduzierten Kardiotoxizitätsmodell. Es wird eine direkte linkventrikuläre antegrade Perfusion gefolgt von kontrollierter enzymatischer Verdauung, um calciumtolerante, stabförmige Myozyten zu erhalten, die für strukturelle, molekulare und funktionelle Analysen geeignet sind.

Zusammenfassung

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Doxorubicin (DOX) ist ein wirksames chemotherapeutisches Medikament, dessen klinische Anwendung durch eine fortschreitende, dosisabhängige Kardiotoxizität begrenzt ist, die überwiegend das ventrikuläre Myokard betrifft. Die Untersuchung zellulärer Verletzungsmechanismen in diesem Zusammenhang erfordert eine zuverlässige Isolierung adulter Kardiomyozyten, ein Prozess, der bei kranken oder strukturell fragilen Herzen technisch anspruchsvoll ist. Hier beschreiben wir ein vereinfachtes und reproduzierbares Langendorff-freies Protokoll zur Isolierung funktioneller ventrikulärer Kardiomyozyten aus Mäusen mit DOX-induzierter Kardiotoxizität. Nach der Etablierung des DOX-Modells bei C57BL/6-Mäusen wird das Herz schnell entfernt und die Aorta ex vivo abgeklemmt. Die nicht-rezirkulierende antegrade Perfusion erfolgt direkt über den linken Ventrikel mit calciumfreien und enzymhaltigen Puffern. Sanfte mechanische Dissoziation des verdauten ventrikulären Gewebes erzeugt einzelne Kardiomyozyten, gefolgt von kontrollierter Wiedereinführung von Kalzium zur Wiederherstellung der Kalziumtoleranz. Diese Methode liefert hochwertige, lebensfähige, stabförmige Kardiomyozyten, die mit nachgelagerten Tests kompatibel sind, einschließlich Immunfluoreszenz, Analyse der Sarkomerorganisation, Apoptose-Detektion und molekularen Signalstudien. Indem der Bedarf an spezialisierten Langendorff-Perfusionsgeräten eliminiert wird, bietet dieses Protokoll eine zugängliche, leistungsfähige Lösung für Labore, die Mechanismen von DOX-induzierten Herzverletzungen untersuchen.

Einleitung

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Doxorubicin (DOX) ist ein starkes Anthracyclin-Chemotherapeutikaum, dessen klinische Anwendung jedoch durch kumulative Kardiotoxizität eingeschränkt ist, die sich zu dilatativer Kardiomyopathie undHerzinsuffizienz entwickeln kann. Die Kardiomyozytenapoptose ist ein zentraler pathogener Prozess in dieser Toxizität 3,4,5, und die Untersuchung dieser zellulären Ereignisse erfordert zuverlässigen Zugang zu funktionellen adulten Kardiomyozyten, die aus DOX-geschädigten Herzen stammen. Allerdings macht die DOX-Exposition Kardiomyozyten strukturell fragil und metabolisch kompromittiert, was ihre Anfälligkeit für enzymatische und mechanische Belastung während der Isolation erheblich erhöht und zu einer geringen Lebensfähigkeit führt. In der breiteren Literatur bleibt die Langendorff-Perfusion die vorherrschende Methode zur Isolierung von adulten Kardiomyozyten7. Allerdings hat es bemerkenswerte Einschränkungen, wenn es auf beschädigtes Myokard angewendet wird. Die Methode erfordert spezialisierte Hardware, präzise Aortenkanulation und beträchtliche technische Kompetenz; bei DOX-behandelten Herzen kann die zusätzliche mechanische Belastung, die während der Langendorff-Perfusion eingeführt wird, die Zellschädigung weiter verschlimmern und zu inkonsistenten und oft suboptimalen Ergebnissen führen8.

Um diese Herausforderungen zu überwinden, entwickelten wir ein vereinfachtes und zugängliches Protokoll zur Isolierung calciumtoleranter adulter ventrikulärer Kardiomyozyten aus einem Mausmodell mit akuter DOX-induzierter Kardiotoxizität9. Durch die Eliminierung der konventionellen Langendorff-Perfusion und die Durchführung einer kontrollierten ex vivo antegraden Perfusion direkt durch den linken Ventrikel minimiert diese Methode die ischämische Exposition und reduziert die mechanische Manipulation des Myokards. Diese Merkmale werden voraussichtlich die prozedurale Konsistenz verbessern und das Überleben von verletzlichen Kardiomyozyten aus geschwächtenHerzen 7,10 erhöhen.

Der aktuelle Ansatz baut auf aufkommenden Fortschritten in der Langendorff-freien Kardiomyozytenisolierung auf und erweitert diese Konzepte auf adulte ventrikuläre Zellen, die den Erhalt der reifen kontraktilen Architektur und der Kalziumhandhabungseigenschaften erfordern – Merkmale, die durch vereinfachte Verdauungsmethoden, die hauptsächlich für Neugeborenenherzen entwickelt wurden, nicht ausreichend unterstütztwerden 11,12. Dieses Protokoll bietet daher eine praktische und reproduzierbare Alternative für Labore ohne spezialisierte Perfusionssysteme. Die isolierten Kardiomyozyten behalten ihre strukturelle Integrität und eignen sich gut für vielfältige nachgelagerte Anwendungen, darunter Sarkomeranalyse, Immunfluoreszenzbildgebung und Apoptose-Signalstudien, was eine direkte mechanistische Untersuchung von DOX-induzierten Herzverletzungen in einem physiologisch relevanten Kontext ermöglicht. Zusammenfassend adressiert dieses Protokoll einen kritischen, ungedeckten Bedarf zur Isolierung lebensfähiger Kardiomyozyten aus DOX-geschädigten Herzen.

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Protokoll

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Alle Tierverfahren wurden gemäß institutionellen und nationalen Richtlinien für die Pflege und Nutzung von Labortieren durchgeführt und vom Institutional Animal Care and Use Committee der Xi'an Jiaotong Universität überprüft und genehmigt (Genehmigungsnummer XJTUAE2022-1441). Die verwendeten Verbrauchsgüter, Reagenzien und Ausrüstung sind in der Materialtabelle aufgeführt.

1. Etablierung des DOX-induzierten akuten Kardiotoxizitätsmodells bei C57BL/6-Mäusen

  1. Tiervorbereitung: Verwenden Sie 8-12 Wochen alte männliche C57BL/6 Mäuse (24-28 g). Haustiere unter normalen Bedingungen mit einem 12-Stunden-Licht/Dunkel-Zyklus und ad-libitum-Zugang zu Futter und Wasser. Zufällig werden Mäuse DOX-behandelten oder salzhaltigen Kontrollgruppen zugeteilt (n = 3 pro Gruppe).
  2. DOX-Verwaltung
    1. Bereiten Sie eine frische DOX-Lösung mit 1,5 mg/mL in steriler Kochsalzlösung vor. Schützen Sie die Lösung vor Licht, indem Sie den Behälter mit Alufolie umwickeln.
    2. Wiegen Sie jede Maus und berechnen Sie das Injektionsvolumen für eine einzelne intraperitoneale (i.p.) Dosis von 15 mg/kg13,14.
    3. Halten Sie die Maus vorsichtig fest und verabreichen Sie die DOX-Lösung per peritonealer Injektion. Bringen Sie die Maus zurück in ihren Käfig und fahren Sie gemäß dem Versuchsplan vor.
      VORSICHT: DOX ist ein zytotoxischer Wirkstoff. Tragen Sie geeignete persönliche Schutzausrüstung (Laborkittel, Handschuhe, Augenschutz) und behandeln Sie das Reagenz in einem ausgewiesenen Bereich für chemische Sicherheits.
  3. Zeitplan und Überwachung: Überwachen Sie Mäuse täglich auf allgemeine Gesundheit und Verhalten. Alle zwei Tage das Körpergewicht aufzeichnen. Führe 7 Tage nach der DOX-Injektion eine Kardiomyozyten-Isolierung durch.

2. Herstellung von Lösungen und chirurgischen Werkzeugen zur Isolierung von Kardiomyozyten

  1. Puffervorbereitung: Siehe ergänzende Tabelle 1 für detaillierte Herstellungsmethoden dieser Lösungen.
    1. Bereite einen Perfusionspuffer und einen EDTA-Puffer vor. Stellen Sie den pH-Wert aller Lösungen mit NaOH auf 7,4 ein.
    2. Stellen Sie eine Enzymverdauungslösung mit Kollagen Typ II, Kollagen IV und Protease XIV mit Perfusionspuffer vor.
    3. Bereiten Sie den Stopppuffer vor, indem Sie den Perfusionspuffer mit 5 % fetalem Rinderserum (FBS) ergänzen.
    4. Bereiten Sie ein vollständiges Kulturmedium vor, indem Sie 0,1 % Rinderserumalbumin (BSA), Insulintransferrin-Selen (ITS), 10 mM 2,3-Butanedionmonoxim (BDM), Lipidkonzentrat und Penicillin/Streptomycin (P/S) zum M199-Medium hinzufügen.
    5. Calcium-Wiedereinführungspuffer bereiten, indem Sie vollständiges Kulturmedium zum Perfusionspuffer bei den endgültigen Calciumkonzentrationen von 0,34 mM, 0,68 mM bzw. 1,02 mM hinzufügen.
      HINWEIS: Bereiten Sie alle Lösungen unter sterilen Bedingungen mit 0,22 μm Filtration vor. Lagere Lösungen bei 4 °C, geschützt vor Licht, bis zu zwei Wochen. Für die Isolierung eines Mausherzens bereiten Sie 50 mL EDTA-Puffer, 100 mL Perfusionspuffer (60 mL für Kollagenase-Lösung, 10 mL für Stopppuffer, Rest für Perfusion und Gravitationssedimentation), 60 mL Kollagenasepuffer und 10 mL Stopppuffer.
  2. Vorbereitung von chirurgischen Werkzeugen: Sterilisieren Sie alle chirurgischen Instrumente vor dem Eingriff durch Autoklavierung. Ordnen Sie folgende Werkzeuge nacheinander im chirurgischen Bereich an: Feine Schere, gebogene Schere, Pinzette, gebogene hämostatische Zange (Abbildung 1A) und Spritzenpumpe (Abbildung 1B).

3. Isolierung von Kardiomyozyten aus DOX-behandelten Herzen

HINWEIS: Ein schematischer Überblick über das Isolierungsverfahren der Kardiomyozyten ist in Abbildung 2 dargestellt. Nachdem überprüft wurde, dass alle chirurgischen Instrumente, Geräte und Lösungen bereit sind, beginnen Sie mit der Isolation.

  1. Aortenklemmung und Herzexzision
    1. Betäuben Sie die Maus mit 3 % Isofluran und bestätigen Sie die Anästhesie, indem Sie prüfen, ob sie auf einen Zehenkneif15 nicht reagiert.
    2. Sichern Sie die Maus in Rückenlage auf der Sektionstafel.
    3. Mach einen Mittellinienschnitt durch Haut und Thoraxwand, um das Herz freizulegen, und schneide die absteigende Aorta durch.
    4. Perfundieren Sie 7 ml EDTA-Puffer mit kontrollierter, gleichmäßiger Rate in die Basis des rechten Ventrikels über etwa 1 Minute, um schnell Blut aus den Ventrikeln zu entfernen, dabei die ischämische Exposition zu minimieren und die kardiale strukturelle Integrität, insbesondere bei empfindlichen, DOX-geschädigten Herzen, zu erhalten (Abbildung 2A).
    5. Klemmen Sie die aufsteigende Aorta schnell ab (Abbildung 2B), entfernen Sie das Herz und übertragen Sie es sofort in eine 100-mm-Schale mit eiskaltem EDTA-Puffer.
      HINWEIS: Die Gesamtzeit von der Thorakotomie bis zum Herztransfer wird idealerweise unter 2 Minuten gehalten, um Ischämie zu minimieren.
  2. Perfusionsaufbau
    1. Schneiden Sie das umliegende Gewebe sorgfältig ab.
    2. Lege das Herz in eine Dissektionsschale mit eiskaltem Perfusionspuffer.
    3. Perfundieren Sie 10 ml EDTA-Puffer über 6 Minuten über den Apex des linken Ventrikels mit einer einwohnenden Nadel, um extrazelluläre Verbindungen zu destabilisieren.
    4. Übertragen Sie das Herz in eine weitere 100-mm-Schale und entfernen Sie den restlichen EDTA aus den Herzkammern, indem Sie 3 ml Perfusionspuffer über 2 Minuten durch denselben Katheter perfundieren.
      HINWEIS: Beobachten Sie die Herzschwellung während der Perfusion und sichern Sie die Aorta mit gekrümmten hämostatischen Zangen, um ein geschlossenes Perfusionssystem zu etablieren. Kontrollieren Sie sorgfältig die Perfusionsrate und den Druck, um übermäßige hydrostatische Kräfte zu vermeiden und das Risiko eines Risses im linken Vorhof zu minimieren.
  3. Enzymatische Verdauung
    1. Das entfernte Herz wird in eine 100 mm große Schale mit 5 ml Enzymverdauungslösung übertragen.
    2. Verbinden Sie die Wohnnadel mit einer 20-ml-Spritze, die mit der Enzymverdauungslösung gefüllt ist, und befestigen Sie die Nadel sicher mit Sterilisationsindikatorband an der Arbeitsfläche des Biosicherheitsschranks.
    3. Setzen Sie die Spritze in eine Mikroinjektionspumpe und starten Sie die Perfusion mit einer kontrollierten Rate von 3 Min/mL (Abbildung 2C).
    4. Lassen Sie das Herz durch den linken Ventrikel 60–90 Minuten mit der Enzymlösung perfundieren, bis eine vollständige Verdauung erreicht ist, was sich durch einen vollständigen Verlust der Gewebeelastizität und eine blasse Färbung der ventrikulären Oberfläche zeigt (Abbildung 2D). Wenn nach der Erstperfusion eine unvollständige Verdauung festgestellt wird, verabreichen Sie zusätzlich 15–20 ml Enzymlösung zur fortgesetzten Verdauung.
      HINWEIS: Verhindern, dass die Nadel beim Spritzwechsel verrutscht; Wenn sie sich versetzt, werden Sie wieder in die ursprüngliche linke Ventrikelstelle eingesetzt, um den Perfusionsweg zu erhalten.
  4. Gewebedissoziation
    1. Übertragen Sie das verdaute Herz in eine 60-mm-Schale mit 5 ml Stopppuffer.
    2. Trennen Sie das ventrikuläre Gewebe mit feiner Pinzette in kleine Stücke (Abbildung 2E).
    3. Triturieren Sie die ventrikuläre Gewebesuspension vorsichtig mit einer 5-ml-Pipette, um einzelne Kardiomyozyten zu dissoziieren (Abbildung 2F).
    4. Filtern Sie die Zellsuspension durch ein 100 μm Zellsieb, um große Gewebefragmente zu entfernen.
    5. Spülen Sie das Sieb mit zusätzlichen 5 ml Stopppuffer, um die Zellenausbeute zu maximieren.
      HINWEIS: Führen Sie alle Triturationsschritte vorsichtig durch und beschränken Sie das Pipetieren auf höchstens 50 Wiederholungen, um mechanische Schäden an den Herzomyozyten zu vermeiden.
  5. Calcium-Wiedereinführung
    HINWEIS: Lassen Sie die Kardiomyozyten 3–4 aufeinanderfolgende 15-minütige Gravitationssedimentationsphasen in 15-mL-Zentrifugenröhren durchlaufen (Abbildung 2G). Nach jeder Sedimentation werden vorsichtig 80 % des Supernatanten entfernt und das Pellet in 3 ml des anschließenden Kalzium-Wiedereinführungspuffers wieder suspendiert. Erhöhen Sie schrittweise die Calciumkonzentration mit den vorbereiteten Gradientenlösungen bei jedemSchritt 16.
  6. Zellzählung und Beschichtung
    1. Quantifizieren Sie die Zelldichte mit einem Hämozytometer und berechnen Sie den Anteil von stabförmigen zu runden Kardiomyozyten 1,9 (Abbildung 2H).
    2. Platte 1-5 × 105 Zellen im Beschichtungsmedium in 6-Well-Platten, vorbeschichtet mit Laminin (10 μg/mL) für 1 Stunde bei 37 °C und mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) gewaschen. Bereiten Sie die Teller einen Tag im Voraus vor und lagern Sie sie bei Bedarf bei 4 °C. Wechsle das Medium nach 1 Stunde auf ein frisches, vorgewärmtes Medium und danach alle 48 Stunden.
      HINWEIS: Das Protokoll kann nach Schritt 3.6 pausiert werden. Die Zellen können bis zu 6 Stunden in kurzfristiger Kultur erhalten bleiben, um sofortige Experimente durchzuführen.

4. Bewertung der strukturellen Integrität der Kardiomyozyten durch Immunfärbung

  1. Stellen Sie Zellen mit 4 % Paraformaldehyd für 15 Minuten bei Raumtemperatur fest.
  2. Wasche die Zellen dreimal mit PBS, jeweils 5 Minuten.
  3. Permeabilisiere die Zellen mit 0,1 % Triton X-100 in PBS für 10 Minuten und wasche dreimal mit PBS, jeweils 5 Minuten.
  4. Blockiere unspezifische Bindungen mit 1 % BSA in PBS für 1 Stunde.
  5. Inkubieren Sie Zellen mit primären Antikörpern gegen das sarkomerische α-Actinin über Nacht bei 4 °C.
  6. Waschen Sie vorsichtig dreimal mit PBS und inkubieren Sie dann 1 Stunde lang mit dem passenden fluoreszierenden Sekundärantikörper bei Raumtemperatur.
  7. Dreimal vorsichtig mit PBS waschen, dann 5 Minuten lang die Kerne mit DAPI abfärben.
  8. Deckfolien auf Glasschlitten mit Antifade-Montagemedium montieren.
  9. Nehmen Sie Bilder mit einem Fluoreszenzmikroskop auf, um Färbungsmuster zu visualisieren.

5. Analyse der apoptotischen Signalübertragung in isolierten Kardiomyozyten

  1. Proteinextraktion und Quantifizierung
    1. Lyse Kardiomyozyten in einem RIPA-basierten Puffer, ergänzt mit Protease- und Phosphataseinhibitoren.
    2. Zentrifugieren Sie die Homogenate bei 12.000 × g für 15 Minuten bei 4 °C. Sammeln Sie das Supernatant für eine weitere Analyse ein.
    3. Bestimmen Sie die Proteinkonzentration mittels eines kolorimetrischen Tests mit Biinchoninsäure.
  2. Western-Blot-Analyse
    1. Trennen Sie 30 μg Protein auf SDS-Polyacrylamid-Gelen und übertragen Sie die aufgelösten Proteine auf PVDF-Membranen.
    2. Blockieren Sie die Membranen mit 5 % fettarmer Milch in TBS mit 1 % Tween-20 und inkubieren Sie sie dann über Nacht bei 4 °C mit primären Antikörpern gegen Bax, Bcl-2 und gespaltene Caspase-3, wichtige Proteinmarker, die häufig in DOX-kardiotoxischenStudien bewertet werden.
    3. Inkubieren Sie mit geeigneten sekundären Antikörpern mit Peroxidase-Peroxidase. Signale mit verstärktem chemilumineszenz-Reagenz erkennen und Bilder mit einem digitalen Bildgebungssystem aufnehmen18.
  3. Datenanalyse
    1. Quantitative Daten als Mittelwert ± SEM aus drei unabhängigen biologischen Replikaten präsentiert.
    2. Führen Sie statistische Analysen mit GraphPad Prism durch, wobei Zwei-Wege-ANOVA für Vergleiche über mehrere Gruppen und Zeitpunkte hinweg angewendet wird, oder ein ungepaarter zweiseitiger t-Test für Vergleiche zwischen zwei Gruppen. Ein p-Wert < 0,05 galt als statistisch signifikant.

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Ergebnisse

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Bewertung von Zellausbeute und Lebensfähigkeit

Mäuse, die DOX erhielten, zeigten einen deutlichen Rückgang des Körpergewichts im Vergleich zur salzhaltig behandelten Gruppe (ergänzende Abbildung 1A). Die erfolgreiche Etablierung des akut-DOX-induzierten Kardiotoxizitätsmodells wurde durch deutliche Zunahmen der serumkardialen Schädigungsmarker, einschließlich cTnT und CK (ergänzende Abbildung 1B,C), sowie eine...

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Diskussion

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Eine erfolgreiche Isolierung hochwertiger, calciumtoleranter erwachsener Kardiomyozyten ist für zelluläre Studien zur kardialen Pathophysiologie unerlässlich. Dieses Protokoll liefert zuverlässig funktionelle Kardiomyozyten sowohl aus gesunden als auch von pathologischen Mausherzen, wobei zwei Schritte besonders entscheidend für die Erhaltung der Zelllebensfähigkeit sind. Zunächst sollten Sie die Dauer der enzymatischen Perfusion sorgfältig optimieren und überwachen. Unzureichende Verdau...

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Offenlegungen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Die Autoren haben nichts offenzulegen.

Danksagungen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Diese Arbeit wurde von der Natural Science Foundation of China unterstützt (Zuschuss 82230012 und 81830015 an N. Wang, Zuschuss 82570478 an L. Xiao).

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
100-mm-Zell-Clutur-SchalenJet Bio-Filtration TCD000100
100 & mu; M-Zell-SiebCorning431752
15-mL-ZentrifugenröhrenJet Bio-Filtration CFT011150
50-mL-ZentrifugenröhrenJet Bio-Filtration CFT011500
60-mm-ZellkulturschalenJet Bio-Filtration TCD100060
Rinderserum-Albumin (BSA)Sigma-AldrichA1470 
Kollagenase IISigma-AldrichC6885
Kollagenase IVSigma-AldrichC5138
Gebogene hämostatische ZangeRWD Life ScienceF22003-10
Schere mit gebogenem EndeRWD Life ScienceS12001-09
Feine SchereRWD Life ScienceS12000-09
PinzetteRWD Life ScienceF13014-12
Einwohnende Kanüle (26G)Becton, Dickinson und Co.381312
Insulin-Transferrin-Selen (ITS)MedChemExpressHY-150287
Isofluran   RWD Life ScienceR510-22-10
Laminin (Maus)Thermowissenschaftlich23017015
Lipidkonzentrat (chemisch definiert)MedChemExpressHY-K3019
M199 MediumSigma-AldrichM4530
Penicillin-StreptomycinMedChemExpress  HY-K1006
Protease XIVSigma-AldrichP5147
SterilisationsindikatorbandBergbau und Fertigung in Minnesota (3M)CT060934701
Spritzenpumpe (ISPLab01)Baoding Shenchen PräzisionspumpeSC-49464A

Referenzen

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Kardiomyozyten IsolierungMausherzmodellcalciumfreier Puffermechanische DissoziationMechanismen der Herzsch digungApoptose DetektionSarkomer OrganisationImmunfluoreszenz Assay

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