Methodenartikel

Verbesserung der Aufnahme des intestinalen rekombinanten adenoassoziierten Virus durch eine traditionelle chinesische Medizinformel

DOI:

10.3791/70413

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24. April 2026

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1Faculty of Traditional Chinese Medicine, Naval Medical University, 2Oncology Department of Traditional Chinese Medicine, Changhai Hospital, Naval Medical University, 3State Key Laboratory of Genetics and Development of Complex Phenotypes, School of Life Sciences, Zhongshan Hospital, Fudan University, 4Shanghai Key Laboratory of Gene Editing and Cell Therapy for Rare Diseases, Engineering Research Center of Gene Technology (Ministry of Education), Fudan University, 5Institutes of Integrative Medicine, Fudan University

* These authors contributed equally

In diesem Artikel

Zusammenfassung

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Hier stellen wir ein Protokoll zur Einrichtung eines Everted-Darmsack-Modells vor, um Wechselwirkungen zwischen der Traditionellen Chinesischen Medizin (TCM) und dem rekombinanten adenoassoziierten Virus (rAAV) während der Darmaufnahme zu bewerten und so eine ex-vivo-Plattform zur Optimierung oraler Genabgabestrategien bereitzustellen.

Zusammenfassung

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Die orale verabreichung des rekombinanten adenoassoziierten Virus (rAAV) birgt ein erhebliches therapeutisches Potenzial, wird jedoch durch ineffiziente Intestinalabsorption eingeschränkt. Die traditionelle chinesische Medizin (TCM), die weit verbreitet in oralen Formulierungen verwendet wird, stellt eine vielversprechende Quelle für Absorptionsverstärker dar. Ihre potenziellen Auswirkungen auf die rAAV-Aufnahme und -Transduktion sind jedoch weitgehend unerforscht. Das Everted-Darmsack-Modell bietet eine quantitative Ex-vivo-Plattform zur Untersuchung dieser Interaktionen. Hier wird ein detailliertes Protokoll vorgestellt, das das Everted-Darmsack-Modell verwendet, um die Translokation des adenoassoziierten Virus (rAAV) durch das Darmepithel und die anschließende Gentransduktion im Darmgewebe unter kontrollierten experimentellen Bedingungen quantitativ zu bewerten. Wichtige Schritte umfassen die Entnahme von Dünndarmsegmenten von Labornagetieren, das Evertieren der Segmente zur Bildung von Säcken und das Auffüllen jedes Sacks mit sauerstoffreichem Puffer. Die versenkten Säcke werden in einen sauerstoffreichen Puffer mit rAAV-Partikeln eingetaucht und bei 37 °C inkubiert, um Luminalexposition und Vektortransport zu ermöglichen. Endpunktanalysen umfassen die Probenahme der inneren (serosalen) Flüssigkeit zur Messung von rAAV-Partikeln, die das Epithel durchquert haben, sowie die Analyse des Sackgewebes auf Transgenexpression zur Bestimmung der Transduktionseffizienz. Durch das Testen mehrerer Darmregionen liefert das Protokoll Einblicke in segmentspezifische Unterschiede in der rAAV-Aufnahme. Darüber hinaus ermöglicht die Einbeziehung von GZNG, einer klassischen TCM-Formel, während der Inkubation die Bewertung ihrer Auswirkungen auf Vektoraufnahme und Transduktion. Der Everted-Darmsack-Ansatz bietet eine wertvolle Plattform zur Screening von rAAV-Serotypen, Lieferverstärkern und Interaktionen zwischen rAAV-Vektoren und TCM-Komponenten. Ihr einfaches und parallelierbares Design ermöglicht auch Hochdurchsatz-Screening in präklinischen Studien.

Einleitung

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Rekombinantes adenoassozoziiertes Virus (rAAV) stellt eine vielversprechende Plattform für systemische Gentherapie dar, wobei derzeit drei primäre Verabreichungswege erforscht werden: intravenöse Injektion1, intraperitoneale Injektion2 und orale Verabreichung3. Obwohl die Routen intravenöser und intraperitonealer Injektionen umfassend erforscht wurden, bleibt die orale Verabreichung, ein nicht-invasiver Ansatz, vergleichsweise wenig erforscht. Die Machbarkeit der oralen RAAV-Abgabe wurde erstmals von Xin et al.4 nachgewiesen, die eine erfolgreiche Transduktion der Darmschleimhaut und die Einleitung einer anti-HIV-Immunantwort nach oraler Verabreichung von rAAV2 berichteten. Ähnlich zeigten Hara et al.3,5, dass orale rAAV/Aβ gastrointestinale Schleimhaut transduzieren und die Ablagerung von Amyloiden im Gehirn reduzieren kann, während Steel et al.6 fanden, dass orale Impfungen eine überlegene Überlebens- und Anti-Tumor-Immunität im Vergleich zur intramuskulären Injektion zeigten. Die gleiche Studie berichtete, dass rAAV6 einen stärkeren intestinalen Tropismus als rAAV5 aufwies. Über die Impfstoffanwendungen hinaus wurde therapeutisches Potenzial auch in anderen Krankheitsmodellen erzielt. Ma et al.7 und Hao et al.8 bewiesen, dass orales rAAV nach gastrointestinaler Transduktion zu Tumorsuppression bzw. antifibrotischer Therapie in Leber und Magen führte. Huang et al.9 identifizierten den konstruierten Serotyp Rec2 als selektiv transduzierend braunes Fettgewebe nach oraler Verabreichung, im Gegensatz zum vorherrschenden Lebertropismus bei intravenöserVerabreichung 10. Trotz dieser bahnbrechenden Ergebnisse bleibt die Forschung zur oralen RAAV-Abgabe begrenzt, teilweise aufgrund fehlender in-vitro-Screening-Systeme für groß angelegte Evaluationen.

Das von Wilson und Wiseman 1954 entwickelte Modell des Darmsacks bleibt eine wertvolle In-vitro-Plattform zur Untersuchung der Wirkstoffabsorptionsmechanismen im Darm. Im Gegensatz zu anderen Absorptionssimulatoren berücksichtigt dieses System eindeutig mehrere physiologische Prozesse, die über die einfache passive Diffusion12 hinausgehen. Diese Eigenschaft macht es besonders vorteilhaft für die Untersuchung von TCM13. Mit diesem System ist dokumentiert, dass TCM-Verbindungen oft segmentabhängige Intestinal-Absorptionsmuster im gesamten Magen-Darm-Trakt aufweisen. So zeigte eine Studie, dass mehrere Alkaloide von Wuwei Qingzhuo San selektiv in verschiedenen Darmsegmenten absorbiert werden, wobei Jejunum und Ileum die aktivste Aufnahme14 aufweisen. Zusätzlich kann die gemeinsame Verabreichung von TCM-Bestandteilen die Aufnahme im Darm modulieren. Liao et al.15 berichteten, dass die gemeinsame Verabreichung mit Radix Angelicae dahuricae-Extrakt die intestinale Absorption von Puerarin signifikant verbesserte, was den Einfluss von TCM-Interaktionen auf die segmentale Aufnahme hervorhebt. Daher dient das Modell des Everted-Darmsacks als ideales Werkzeug, um die komplexen Absorptionsverhalten und synergistischen Interaktionen in TCM-Formulierungen und anderen Arzneimitteln zu erläutern.

Die Auswahl eines geeigneten Modells für die rAAV-Absorptionsforschung erfordert ein differenziertes Verständnis der Abwägungen zwischen physiologischer Genauigkeit, technischer Komplexität und Durchsatz. Die folgende Tabelle fasst die primären experimentellen Modelle zusammen, die zur Untersuchung der intestinalen Absorption verwendet werden.

Diese Studie liefert einen Beweis dafür, dass das Modell des Everted Darmsacks zur Untersuchung der intestinalen Absorption rekombinanter adenoassoziierter Virusvektoren (rAAV) verwendet werden kann. Sie liefert wertvolle Einblicke darin, wie die gemeinsame Verabreichung von TCM die intestinale Absorption von rAAV-Vektoren beeinflusst, und unterstreicht die Notwendigkeit einer weiteren Charakterisierung ihrer mechanistischen Interaktionen unter physiologisch relevanten Bedingungen. Die Optimierung von TCM-verbesserten oralen Verabreichungsstrategien durch diesen Ansatz kann die Entwicklung nicht-invasiver rAAV-Therapeutika erleichtern und somit die Patientencompliance und die Behandlungszugänglichkeit verbessern.

Forscher sollten das Modell des entfernten Darmsacks anhand folgender Kriterien bewerten, um sicherzustellen, dass es mit ihren experimentellen Zielen übereinstimmt. Geeignete Anwendungen umfassen ein schnelles Screening von Serotypen, die Bewertung von Adjuvanzen/Enhancern sowie regionale Kinetik, während ungeeignete Anwendungen und Einschränkungen Langzeit-Expressionsstudien (>48 H) und systemische Pharmakologie umfassen.

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Protokoll

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Alle Tierverfahren wurden strikt gemäß den vom Naval Medical University Animal Ethics Committee genehmigten Richtlinien durchgeführt (Genehmigung CHEC (A.E)-2025011).

1. Herstellung von Tyrod-Lösung und viralen Lösungen

  1. Tyroden-Lösungsvorkonditionierung:
    1. Bereiten Sie zwei 500-mL-Aliquoten der Tyrod-Lösung (pH 7,4) vor (siehe Materialtabelle).
    2. Kühlen Sie einen Aliquot auf 4 °C, den anderen auf 37 °C.
    3. Blasen Sie jeden Aliquot mit 95 % O₂/5 % CO₂.
  2. Viruslösungsvorbereitung:
    1. Rekombinante AAV9-CMV-EGFP werden zur 37 °C Tyrod-Lösung hinzugefügt, um eine Endkonzentration von 1 x 1011 vg/mL (Kontrollbedingung) zu erreichen.
    2. Für den experimentellen Zustand wird die AAV9-CMV-EGFP-Vorbereitung mit einer TCM-Formel GZNG (Tabelle 2) im Vehikel gelöst auf eine Endkonzentration von 200 mg/ml ergänzt.
    3. Für die reine GZNG-Kontrolle fügen Sie GZNG (200 mg/mL) der Tyrod-Lösung ohne AAV9 CMV-EGFP hinzu.
      HINWEIS: Bereiten Sie virale Verdünnungen unmittelbar vor der Anwendung vor, um die Infektivitität zu erhalten. Der pH-Wert der GZNG-Lösung liegt bei etwa 5,0–6,0.

2. Tierpräparation und Entnahme von Darmgewebe

  1. Fasten: Fasten Sie die acht Wochen alten Sprague–Dawley-Ratten 24 Stunden vor der Operation. Sorgen Sie für freien Zugang zu Wasser während dieser Zeit, um die Flüssigkeitszufuhr zu erhalten.
    HINWEIS: Fasten hilft, den Darminhalt zu minimieren und gewährleistet eine genaue Messung der Darmaufnahme während ex-vivo-Experimenten .
  2. Überprüfen Sie die Tiergesundheit vor dem Fasten und stellen Sie sicher, dass sie in gutem Zustand sind. Schließen Sie Tiere mit Anzeichen von Stress oder Krankheit aus der Studie aus.
  3. Verabreichen Sie Natriumpentobarbital (200 mg/kg, intraperitoneal) zur Einleitung einer tiefen Anästhesie. Überprüfen Sie, ob das Tier vollständig betäubt ist, indem Sie auf fehlende Reflexe und stabile Atmung achten.
    VORSICHT: Pentobarbital ist eine gefährliche kontrollierte Substanz; Führen Sie sie mit Handschuhen und PSA in einer Abzugshaube, um Hautkontakt oder -inhalation zu vermeiden, und befolgen Sie institutionelle Richtlinien für sichere Entsorgung und Notfallmaßnahmen.
  4. Führen Sie eine Euthanasie durch zervikale Verrenkung durch, sobald eine tiefe Anästhesie bestätigt wurde.
  5. Wischen Sie den Bauch- und Thoraxbereich mit 75 % Ethanol ab, um die Haut zu desinfizieren und die mikrobielle Kontamination während der Operation zu reduzieren.
  6. Machen Sie mit steriler chirurgischer Schere einen Mittellinienschnitt im Bauchbereich, um die Bauchhöhle freizulegen.
  7. Magen und Darm werden vorsichtig getrennt und freigelegt. Verwenden Sie während des Eingriffs eine sterile Abdeckung, um das umliegende Gewebe und die Organe zu schützen.
  8. Schneiden Sie vorsichtig den Pylorusschließmuskel, um den Magen vom proximalen Duodenum zu trennen. Stellen Sie sicher, dass der Duodenum für weitere Eingriffe intakt bleibt.
  9. Sezieren Sie den distalen Dickdarm an der Recto-Anal-Übergangsstelle, ohne Schäden am umliegenden Gewebe zu vermeiden.
  10. Lösen Sie vorsichtig die mesenterien Ansätze aus dem Dünndarm mit feiner Pinzette oder Schere. Seien Sie vorsichtig, das Mesenterium nicht zu dehnen oder zu zerreißen.
  11. Der intakte Dünndarm wird sofort in eine eiskalte Lösung des sauerstoffhaltigen Krebs-Ringer-Puffers (Tyrode-Lösung, 4 °C) übertragen.

3. Ex-vivo Vorbereitung des Darmsacks

  1. Wähle die Darmsegmente wie folgt aus: Ein 8 cm großes Segment, das 10 cm distal vom Pylorus liegt, wurde als Duodenalsegment bezeichnet.
  2. Nehmen Sie ein 8 cm großes Jejunalsegment, beginnend 16 cm distal vom Duodenalsegment.
  3. Erhalten Sie ein 8 cm langes Ilealsegment, das weitere 16 cm distal vom Jejunalsegment beginnt.
  4. Für den Dickdarm nehmen Sie ein 8 cm großes Segment, das sich 5 cm proximal zum blinden Ende der Spülung befindet.
    HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass das Gewebe elastisch und intakt ist und sich für die Inversion während der Vorbereitung eignet.
  5. Spülen Sie das Darmlumen mit einer 2-ml-Spritze, die mit eiskaltem, sauerstoffreicher Tyrod-Lösung gefüllt ist.
  6. Entsorgen Sie das Abwasser gemäß institutionellen Biohazard-Abfallprotokollen, um die Sterilität zu gewährleisten und eine Verunreinigung zu verhindern.
    VORSICHT: Behandeln Sie biologische Abfälle mit Handschuhen und geeigneter Schutzausrüstung, um eine Exposition gegenüber potenziell infektiösen Materialien zu vermeiden. Entsorgen Sie alle biologischen Abfälle und Abwässer gemäß den institutionellen Sicherheitsrichtlinien für Biohazards, um Umweltkontaminationen zu verhindern.
  7. Setzen Sie das proximale Ende des Darmsegments auf einen 4 mm polierten Glasstab ein. Stellen Sie sicher, dass die Staboberfläche glatt ist, um Schleimhautrisse zu verhindern.
  8. Binden Sie das distale Ende des Segments mit einer 2-0-Seidennaht zusammen, um das Gewebe am Stab zu befestigen. Bestätigen Sie, dass das Gewebe während der Inversion stabil bleibt.
  9. Schieben Sie das Darmsegment vorsichtig durch, indem Sie das Gewebe entlang der Stange schieben, bis die Schleimhaut vollständig freiliegt. Vermeiden Sie übermäßiges Dehnen oder Drehen, um die Gewebeintegrität zu erhalten.
  10. Geben Sie 2 ml eiskalter Tyrode-Lösung in das Lumen, um auf Leckage zu prüfen. Der akzeptable Austritt sollte innerhalb von 1 Minute <5 % betragen. Wenn ein Leck festgestellt wird, stellen Sie die Nähte an und überprüfen Sie die vollständige Inversion der Schleimhautfläche.
    HINWEIS: Führen Sie die Eversion in kalter Umgebung durch, um den enzymatischen Abbau zu minimieren und die Lebensfähigkeit des Gewebes zu erhalten.
  11. Führen Sie eine 5 cm lange 3 mm lange Glaskapillare in das offene Ende des ausgestreckten Segments ein, um als Durchlauf zu dienen. Schieben Sie die Kanüle vorsichtig vor, um Schleimhautrisse zu vermeiden.
  12. Sichern Sie die Kanüle mit 2-0 Seidennähten. Stellen Sie sicher, dass die Kanüle in Position bleibt, ohne zusammenzufallen oder den Flüssigkeitsfluss zu behindern.
  13. Tragen Sie sanfte Spannung auf die Nähte aus, um die richtige Form des Darmsacks zu erhalten. Vermeiden Sie Knicken oder Verdrehungen, da diese die Durchfluss stören und die Aufnahmeergebnisse beeinträchtigen können.
  14. Vermeiden Sie übermäßiges Anspannen, da dies das Gewebe schädigen oder den Sack verformen könnte. Halten Sie während des gesamten Experiments eine gleichmäßige Spannung. Untersuchen Sie den umgeschlagenen Darmsack regelmäßig auf Leckage oder strukturelle Schäden. Wenn die Leckage 5 % übersteigt, reparieren oder ersetzen Sie das Segment, bevor Sie fortfahren.

4. AAV-Transduktion und Inkubation

  1. Jeden umgeworfenen Sack in ein 7 mL konisches Rohr mit 4 ml 37 °C sauerstoffhaltiger Tyrodlösung einzusetzen.
  2. Fügen Sie virale Lösung wie folgt hinzu: Kontrolle: AAV9-CMV-EGFP allein; Experimentelle: AAV9-CMV-EGFP + GZNG.
  3. Statisch bei 37 °C für 2 Stunden inkubieren, wobei ein Gasgemisch von 95 % O2/5 % CO2 kontinuierlich in die Lösung geblasenwurde.

5. Stichprobe, Endpunktverarbeitung und Analyse

  1. Zeitverlaufsstichproben
    1. Entnehmen Sie 50 μL Serosalflüssigkeit aus jedem Darmsack bei 0, 30, 60, 90 und 120 Minuten mit einer kalibrierten Mikrospritze. Gewährleisten Sie eine genaue Probenahme ohne Luftblasen.
    2. Ersetzen Sie die entlassene Flüssigkeit sofort durch 50 μL vorgewärmte (37 °C) Tyrod-Lösung, um das osmotische Gleichgewicht und das interne Volumen zu erhalten. Minimieren Sie die Zeit zwischen Entzug und Ersatz, um konsistente experimentelle Bedingungen zu erhalten.
      HINWEIS: Bei Verwendung einer Mikrospritze (z. B. Hamilton-Spritze) sollten Sie die Sterilität bewahren und sie vorsichtig behandeln, um Schäden an der Darmmembran zu vermeiden.
    3. Führen Sie zu jedem Zeitpunkt rechtzeitig Probenahmen durch, um die Störung der Brutumgebung zu minimieren.
  2. Bestimmung des Virustiters
    1. Entnehmen Sie die gesamte DNA aus der Serosalflüssigkeit mit einem kommerziell erhältlichen Animal Genomic DNA Extraction Kit gemäß den Anweisungen des Herstellers.
    2. Durchführung der absoluten Quantifizierung der Kopienzahl des rAAV-Vektorgenoms mittels qPCR. Verwenden Sie ein SYBR Green Kit mit ITR-Primern. Führen Sie die qPCR-Amplifikation in einer Standardplatte mit 96 Wellen mit einem thermischen Zyklus und folgenden Zyklusbedingungen durch: Anfangsdenaturierung: 95°C für 10 Minuten; Denaturierung: 95°C für 15 Sekunden; Glühen und Extension: 60°C für 1 Minute; Insgesamt 40 Zyklen
    3. Um die Genomkopienzahl zu quantifizieren, erstellen Sie eine Standardkurve mit seriellen Verdünnungen des Plasmids rAAV-CMVp-gfp (1 ng, 0,1 ng und 0,01 ng). Verwenden Sie diese Verdünnungen, um die Kopienzahl des viralen Genoms anhand ihrer entsprechenden Zyklusschwellenwerte (Ct) zu berechnen.
    4. Bestimmung der Kopienzahl des Vektorgenoms in der gesammelten serosalen Flüssigkeit mittels der Standardkurve. Die Ergebnisse wurden als Genomkopien pro 100 ng extrahierter DNA angegeben.
      HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass alle Reagenzien und Ausrüstungen steril sind, um eine Kontamination während der DNA-Extraktion und qPCR-Analyse zu verhindern. Verwenden Sie geeignete Kontrollen zur Überprüfung der qPCR-Genauigkeit, einschließlich No-Template Controls (NTC) und Plasmidstandards.
    5. Führen Sie für jede Probe eine dreifache qPCR durch, um die Reproduzierbarkeit und Zuverlässigkeit der Ergebnisse sicherzustellen.
  3. Terminale Gewebeverarbeitung
    1. Saugen Sie alle restlichen Luminalflüssigkeiten aus jedem Darmsack mit einer sterilen Pipette ab. Führen Sie es vorsichtig an, um ein Gewebereißen zu vermeiden.
    2. Spülen Sie jeden Sack dreimal mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS), die 1 % Penicillin–Streptomycin (P/S) enthält, um Restmittel, Bakterien und Verunreinigungen zu entfernen. Sorgen Sie für gründliches Waschen, um die Sterilität für nachgelagerte Anwendungen zu erhalten.
    3. Schneiden Sie das Darmgewebe mit steriler chirurgischer Schere oder Klingen in2 mm ( 3 mm * 2 mm * 0,5 mm) Fragmente. Halten Sie die Fragmente gleichmäßig groß für eine gleichmäßige Inkubation.
    4. Inkubieren Sie die Gewebefragmente in 10 ml DMEM, ergänzt mit 10 % FBS und 1 % (v/v) P/S bei 37 °C für 48 Stunden in einem befeuchteten Inkubator mit 5 % CO₂. Das Kulturmedium sollte während der Inkubation alle 12 Stunden erneuert werden.
      HINWEIS: Dieser Schritt erhält die Gewebelebensfähigkeit und ermöglicht die Zellerneuerung nach dem Experiment. Stellen Sie sicher, dass die Schleimhaut beim Schneiden und Waschen intakt bleibt. Führen Sie drei vollständige PBS-Waschverfahren durch, um Ablagerungen und mikrobielle Verunreinigungen zu beseitigen. Halten Sie eine konstante Temperatur (37 °C) und hohe Luftfeuchtigkeit aufrecht, um die Stoffwechselaktivität und die Gewebegesundheit zu unterstützen.
      VORSICHT: Gewebefragmente werden mit sterilen Werkzeugen behandelt und mechanische Belastung vermeidet, um die Epithelintegrität zu erhalten.
  4. Nach-Inkubationsanalysen
    1. Aliquot A (Histologische Analyse):
      1. Fixieren Sie die Gewebeproben in 4 % Paraformaldehyd (PFA) für 24 Stunden bei 4 °C, um die zelluläre Architektur zu erhalten.
      2. Nach der Fixierung werden die Gewebe in der OCT-Verbindung eingebettet und eine Hämatoxylin- und Eosin-(H&E)-Färbung durchgeführt, um die Gewebeintegrität und -morphologie zu beurteilen.
        VORSICHT: Paraformaldehyd ist ein gefährliches Fixierungsmittel; handhabt es in einer Abzugshaube mit geeigneter persönlicher Schutzausrüstung
    2. Aliquot B (Fluoreszenzanalyse und Genomquantifizierung):
      1. Das verbleibende Gewebe mit Schnelleinfrieren in flüssigem Stickstoff einfrieren und bis zur weiteren Verarbeitung bei -80 °C aufbewahren.
      2. Verwenden Sie die gefrorenen Proben für die Fluoreszenzmikroskopie, um die EGFP-Expression zu nachweisen und die Transfektionseffizienz oder die virale Aufnahme zu bewerten.
      3. Führen Sie DNA-Extraktion gefolgt von qPCR durch, um die Kopienzahl des viralen Genoms oder die Transgenexpression zu bestimmen.

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Ergebnisse

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Dieses Protokoll wurde verwendet, um die Effizienz der AAV9-vermittelten Genlieferung über verschiedene Segmente des Dünndarms sowie die Wirkung der GZNG-Behandlung auf die Verbesserung des Gentransfers und der Expression zu bewerten. Es wurden mehrere wichtige Ergebnisse beobachtet, die sowohl die erfolgreiche Anwendung des Protokolls als auch einige Variabilitäten unter bestimmten Bedingungen zeigen.

Die Bewertung der AAV9-vermittelten EGFP-Expression durch ...

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Diskussion

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In dieser Studie wurde ein neuartiger in-vitro-Ansatz zur Bewertung der intestinalen rAAV-Absorption durch Anpassung des klassischen Everted-Darmsack-Modells etabliert. Diese Methode ermöglicht eine segmentspezifische Analyse der AAV-Transduktionseffizienz im Dünndarm unter kontrollierten Bedingungen sowie die Bewertung der synergistischen Effekte zwischen TCM und rAAV. Hier werden die entscheidenden Schritte, Fehlersuche und Modifikationen, Einschränkungen sowie deren breite An...

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Offenlegungen

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Die Autoren haben keine Interessenkonflikte zu erklären.

Danksagungen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Die Autoren möchten allen Kollegen und Mitwirkenden danken, die während dieser Studie wertvolle Diskussionen und technische Unterstützung geleistet haben. Wir schätzen auch die institutionelle Unterstützung, die diese Arbeit ermöglicht hat. Diese Arbeit wurde finanziell durch den Zuschuss #82474349 der National Natural Science Foundation of China (an CL) unterstützt.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
DMEMWISENT319-005-CLFlüssig mit 4,5 g/L D-Glukose, mit L-Glutamin, rotem Phenol und Natriumpyruvat
EGFP CDS-Region qPCR-PrimerTSINGKEF: 5'-ACTTCTTCAAGTCCGCCATG-3'; R: 5'-TGTCGGCCATGATATAGACG-3'
Fetales RinderserumWISENT086-550Überlegene Qualität, primäre Zellkulturqualität
Penicillin-Streptomycin(P/S)WISENT450-201-ELDiese Lösung enthält 10.000 Einheiten/mL Penicillin und 10.000 Μ00 Mikro; g/mL Streptomycin.
PrimeScript RT Master Mix (perfekte Echtzeit)TaKaRaRR036A
TaKaRa MiniBEST universelles RNA-ExtraktionskitTaKaRa9767
TSINGKE TSE401 ArtiCanCEO SYBR qPCR MixTSINGKETSE401Dieses Produkt eignet sich für quantitative Fluoreszenzexperimente mit der SYBR-Green-Farbstoffmethode und ist mit verschiedenen Echtzeit-fluoreszenzquantitativen PCR-Instrumenten kompatibel.
TSINGKE TSP202-200 Trelief  Hi-Pure Tiergenom-DNA-KitTSINGKETSP202-200
Tyrodes LösungYuan YeR20268-500mlEs besteht hauptsächlich aus Natriumchlorid, Kaliumchlorid, Magnesiumchlorid, Phosphaten, Calciumchlorid, Glukose und HEPES.

Referenzen

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