Ein vereinfachtes und robustes Protokoll zur Isolierung und langfristigen Expansion primärer menschlicher endometrialer Epithelzellen

Summary

Die Primärkultur menschlicher endometrialer Epithelzellen (HEECs) ist technisch anspruchsvoll. Dieses Protokoll kombiniert die Verdauung von gemischten Enzymen mit ROCK-Inhibitor (Y-27632), um das Überleben und die Expansion der Zellen zu verbessern und gleichzeitig die epitheliale Identität zu erhalten, und bietet eine robuste Grundlage für endometriale Forschung und regenerative Anwendungen.

Abstract

Die Forschung zu endometrialen Erkrankungen, einschließlich tamoxifenassoziierter endometrialer Hyperplasie, wurde durch das Fehlen robuster in-vitro-Epithelmodelle eingeschränkt. Konventionelle Methoden zur Isolierung menschlicher endometrialer Epithelzellen (HEECs) sind oft ineffizient, technisch anspruchsvoll und schlecht skalierbar. Hier wird ein vereinfachtes, feeder-freies Protokoll beschrieben, das eine Mischung aus Enzymverdauung, Erythrozytenlyse und anhaltende ROCK-Inhibitor-Behandlung (Y-27632) integriert, um eine effiziente Isolierung und Erweiterung primärer HEECs zu ermöglichen. Die Einbeziehung von Y-27632 ist entscheidend, um die dissoziationsinduzierte Apoptose zu mildern und die Zelladhäsion im Frühstadium zu verbessern. Dieser Ansatz unterstützt serielle Passaging, während die epitheliale Identität für mindestens 3 Passagen erhalten bleibt, wobei die Morphologie über 10 Passagen hinaus erhalten bleibt. Die Charakterisierung mittels Western Blot und Immunfluoreszenz bestätigt eine hohe Expression von Cytokeratin 18 und E-Cadherin mit einer fortschreitenden Reduktion der vimentin-positiven stromalen Schadstoffe unter selektiven Kulturbedingungen. Durch die Bewältigung wichtiger technischer Einschränkungen bietet diese Methode eine zuverlässige, skalierbare Quelle von Epithelzellen für mechanistische Studien, Krankheitsmodellierung, Arzneimittelscreening und regenerative Anwendungen in der Endometriumforschung. Der standardisierte Arbeitsablauf bietet eine Alternative zu komplexen Kokultursystemen und erleichtert einen breiteren Zugang zu hochwertigen Primärzellmodellen.

Introduction

Zuverlässige In-vitro-Modelle sind unerlässlich, um die Untersuchung von Endometriumerkrankungen voranzutreiben, insbesondere solchen, die mit Tamoxifen (TAM)¹ assoziiert sind. Obwohl TAM weit verbreitet als endokrine Therapie bei Brustkrebs eingesetzt wird, erhöht seine partielle Östrogen-Agonistenaktivität im Endometrium die Häufigkeit von endometrialer Hyperplasie, Polypen und in einigen Fällen der malignen Transformation² deutlich. Die aktuelle klinische Behandlung der tamoxifenassoziierten Endometriumpathologie basiert hauptsächlich auf einer Progesterontherapie oder chirurgischen Eingriffen, die beide erhebliche Einschränkungen aufweisen. Die Progesteronbehandlung ist häufig mit Nebenwirkungen wie Durchbruchblutungen und Gewichtszunahme verbunden, während chirurgische Methoden irreversible Endometriumschäden verursachen und die Fruchtbarkeit beeinträchtigen^können. Diese Einschränkungen unterstreichen die Notwendigkeit robuster Epithelmodelle, die mechanistische Studien unterstützen und die Entwicklung verbesserter therapeutischer Strategien unterstützen können. Der Fortschritt in diesem Bereich wurde jedoch hauptsächlich durch technische Herausforderungen bei der Gewinnung hochreiner, expandierbarer menschlicher endometrialer Epithelzellen (HEEC) eingeschränkt.

Grundlegende Arbeiten auf diesem Gebiet wurden von Arnold et al. (2001) berichtet, die stromale und epitheliale Zellpopulationen mittels Kollagenaseverdauung und sequentieller Siebfiltration isolierten und so eine Reinheit von über 98 % erreichten, wie durch Immunfärbung⁴ bestätigt wurde. Trotz ihres Erfolgs basierte die Methode auf der Verdauung eines einzelnen Enzyms, erforderte eine längere Verarbeitung und setzte auf eine stufenweise Filtration zur Entfernung von Stromal- und Erythrozyten-Schadstoffen, was den Arbeitsablauf arbeitsintensiv und schwer zu^{standardisieren} machte. Später etablierten Yokomizo et al. (2002) ein primäres HEEC-Kultursystem aus Hysterektomieproben, das eine dreidimensionale Kokultur mit stromalen Feederzellen⁵ verwendete. Während die zuführbare Mikroumgebung das epitheliale Wachstum teilweise unterstützte, erlaubte das System nur begrenzte Durchgänge, typischerweise nicht mehr als fünf Durchgänge, was seine Nützlichkeit für Anwendungen mit großflächigen, stabilen Epithelexpansionen^{einschränkte}.

Um diese Einschränkungen zu überwinden, wurde ein vereinfachtes und hochgradig reproduzierbares Protokoll für HEEC-Isolierung und Langzeitkultur entwickelt. Geleitet von früheren Arbeiten, die zeigen, dass der ROCK-Inhibitor Y-27632 die Effizienz der Primärkulturen bei humanen Keratozyten, gingivalen Epithelzellen und Mammarienepithelzellen deutlich verbessert, wurde dasselbe Prinzip auf Endometriumgewebe ^6,7,8 angewandt. Dieser Ansatz umfasst drei Schlüsselmerkmale: die Verdauung von gemischten Enzymen zur Förderung einer effizienten Gewebedissoziation, einen wesentlichen Schritt zur Erythrozytenlyse zur Reduzierung früher Kontamination und zur Förderung der Epithelbindung sowie kontinuierliche Supplementierung mit Y-27632 zur Unterdrückung der Apoptose, zur Unterstützung der Adhäsion und zur Verbesserung der Proliferationskapazität. Mit dieser Strategie können HEECs über mehrere Durchgänge erweitert werden, wobei die Epithelmorphologie und die hohe Expression von CK18 und E-Cadherin ^9,10 erhalten bleiben. Bemerkenswert ist, dass das serielle Passaging über mindestens drei Generationen nicht zu nachweisbarer phänotypischer Drift führte, was die Stabilität und Skalierbarkeit des Kultursystems demonstriert.

Diese Methode adressiert direkt langjährige technische Herausforderungen in der primären HEEC-Kultur, darunter hohe Gewebeeingangsanforderungen, komplexe Arbeitsabläufe, geringe Reproduzierbarkeit und begrenztes Expansionspotenzial. Durch die Erhaltung der epithelalen Identität und funktionellen Eigenschaften während des gesamten Passagings bietet das Protokoll eine verlässliche Grundlage für Forschung zur Endometriumregeneration, Pathophysiologie, Hochdurchsatz-Medikamentenscreening und Zell-Biomaterial-Interaktionen. Durch die Integration von Gewebeverarbeitung mit serieller Expansion adressiert dieser standardisierte Arbeitsablauf einen langjährigen Engpass in der Reproduktionsbiologie und unterstützt zukünftige Anwendungen in der Tissue Engineering, regenerativer Medizin und personalisierter Therapie.

Dieses Protokoll erfordert frische Gewebeproben, die vorzugsweise innerhalb von 24 Stunden nach der Entnahme verarbeitet werden. Zellausbeute und Wachstumseigenschaften können je nach Gewebequelle variieren, wie zum Beispiel Endometriumpolypen im Vergleich zu normalem Endometrium. Häufige Ursachen des Versagens sind eine unvollständige Gewebeverdauung, übermäßige Erythrozytenkontamination oder unzureichende Y-27632-Supplementierung. Obwohl das System die Expansion über mehrere Durchgänge unterstützt, kann eine weitere Optimierung erforderlich sein, um die phänotypische Stabilität während der erweiterten Kultur aufrechtzuerhalten.

Protocol

Frische Endometriumgewebeproben wurden aus Gebärmutterpolypenproben entnommen, die chirurgisch von Patienten im Ersten Angeschlossenen Krankenhaus der Zhejiang Chinese Medical University entfernt wurden. Alle Verfahren wurden gemäß den vom Medizinischen Ethikkomitee des ersten angeschlossenen Krankenhauses der Chinesischen Medizinischen Universität Zhejiang genehmigten Richtlinien durchgeführt (Protokoll Nr. 2025-KLS-569-01; genehmigt am 14. September 2025). Die Handhabung der primären menschlichen Proben erfolgte in einem biologischen Sicherheitsschrank der Klasse II unter Verwendung geeigneter persönlicher Schutzausrüstung, darunter Laborkittel, Handschuhe und Augenschutz. Alle enzymatischen Reagenzien wurden gemäß institutionellen Sicherheitsvorschriften und den Richtlinien der Materialsicherheitsdatenblätter (MSDS) behandelt.

1. Gewebegewinnung

1. Sammeln Sie frisches Endometriumgewebe aus chirurgischen Proben, die von erwachsenen Frauen stammen. Das Gewebe wird in sterile Röhren übertragen, die 10 ml phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS) enthalten, ergänzt mit 3 % Penicillin/Streptomycin (P/S).
   HINWEIS: Das gesamte Gewebe sollte innerhalb von 24 Stunden nach der chirurgischen Entnahme verarbeitet werden.

2. Vorbehandlung von Gewebe

1. Rühren Sie das Gewebe in der Waschlösung (Tabelle 1) für zwei aufeinanderfolgende Waschen von jeweils 2 Minuten durch, um Schleim und Blutgerinnsel zu entfernen.
2. Spülen Sie das Gewebe kurz mit 5 ml 75% Ethanol für 5 Sekunden aus, um die Oberfläche zu desinfizieren.
3. Das Gewebe wird sofort in 20 ml Waschlösung übertragen und zwei Waschgänge von jeweils 5 Minuten gewaschen, um Reste von Ethanol zu entfernen.
   HINWEIS: Da Ethanol brennbar ist, sollten Sie diesen Schritt fernab von offenen Feuern durchführen und ethanolhaltige Abfälle gemäß den institutionellen chemischen Sicherheitsrichtlinien entsorgen.

3. Gewebeverdauung und Zellentnahme

1. Gewebekleinerung
   1. Zerkleinern Sie das Endometriumgewebe mit zwei sterilen Klingen, bis Fragmente (~2 mm³) durch eine 1 ml Pipettenspitze aspiriert werden können (ca. 10 Min).
   2. Transferiere das gehackte Gewebe in ein 50-mL-Zentrifugenrohr.
2. Enzymatische Verdauung
   1. Fügen Sie 10 ml Verdauungslösung (Tabelle 1) in das Rohr mit den Gewebefragmenten ein.
   2. Inkubieren Sie das Rohr in einem 37 °C Wasserbad für 30 Minuten. Schütteln Sie die Sonde alle 15 Minuten sanft, um die Verdauung zu erleichtern.
   3. Die Inkubation wird fortgesetzt, bis die Gewebefragmente sichtbar dissoziiert sind und die Lösung durch freigesetzte Zellen trüb erscheint.
3. Beendigung der Verdauung
   1. Fügen Sie 10 ml neutralisierende Lösung hinzu, um die enzymatische Verdauung zu beenden.
   2. Gründlich mischen, indem man etwa 15 Mal mit einer auf 800 μL eingestellten P1000-Pipette pipettert.
4. Filtration und Zentrifugation
   1. Filtern Sie die verdaute Suspension durch einen 100-μm-Gitterfilter.
   2. Zentrifugiere bei 156 × g für 5 Minuten bei 25 °C.
5. Lyse der roten Blutkörperchen (RBC)
   1. Saugen Sie das Supernatant vorsichtig ein, ohne das Pellet zu stören.
   2. Setzen Sie das Zellpellet in 2 mL vorgekühltem RBC-Lysepuffer wieder auf.
   3. Inkubieren Sie auf Eis (ca. 4 °C) für 3–5 Minuten mit sanftem Umrühren.
6. Beendigung der Lyse
   1. Fügen Sie ≥10 ml PBS oder vollständiges Medium hinzu, um die Lysereaktion zu stoppen.
   2. Zentrifugiere bei 156 × g für 5 Minuten bei 25 °C.

4. Initiierung der Primärkultur

1. Waschen und Zentrifugation
   1. Saugen Sie das Supernatant vorsichtig ein, ohne das Pellet zu stören.
   2. Setzen Sie die Kugel in 20 mL neutralisierender Lösung wieder auf.
   3. Rühren Sie etwa 15 Mal durch Pipetten.
   4. Zentrifugiere bei 156 × g für 5 Minuten bei 25 °C.
2. Resuspension und Aussaaten
   1. Aspiriere das Supernatant.
   2. Lassen Sie das Zellpellet vorsichtig in 10 mL Anfangskulturmedium mit 10 μM Y-27632 wieder suspendieren, indem Sie 8–10 Mal langsam mit einer 1-mL-Pipette auf und ab pipettieren.
   3. Plattieren Sie die Zellsuspension in eine 100 mm große Kulturschale.
      HINWEIS: Für die optimale anfängliche Aussaatdichte wählen Sie das Kulturgefäß entsprechend der geschätzten Zellerträge. Wenn die erwartete Ausbeute >1 × 10^{6 Zellen} beträgt, verwenden Sie eine 100-mm-Schüssel und für geringere Sprengmengen eine 60-mm-Schüssel. Stellen Sie das mittlere Volumen entsprechend an (z. B. 10 ml für eine 100-mm-Schüssel; 4 ml für eine 60-mm-Schüssel).
3. Kulturbedingungen
   1. Inkubieren Sie die Schale bei 37 °C in einer befeuchteten Atmosphäre mit 5 %_CO2.
   2. Ersetze das Medium alle 3 Tage durch frisches epitheliales Kulturmedium ohne Y-27632.
      HINWEIS: Überwachen Sie die Zellbindung und -morphologie; Erneuere das Medium alle zwei Tage, sobald die Zellen zu vermehren beginnen.

5. Zellübergabe

1. Vorbereitung auf die Trypsinisierung
   1. Wenn die Kulturen eine Konfluenz von 80 % bis 90 % erreichen, wird die 100 mm große Schale aus dem Inkubator entfernt.
   2. Entsorge das verbrauchte Medium.
   3. Spülen Sie die Zellen zweimal mit 2 ml PBS.
   4. Aspirieren Sie vorsichtig und entfernen Sie alle verbleibenden PBS.
2. Trypsinisierung
   1. Gib 2 ml 0,05 % Trypsin in die Schale.
   2. Sanft wirbeln, um eine gleichmäßige Abdeckung der Zellschicht zu gewährleisten.
   3. Inkubieren Sie bei 37 °C für 7 Minuten.
   4. Untersuchen Sie die Zellen unter einem Mikroskop (40-faches Ziel), um die Ablösung zu bestätigen.
3. Neutralisierung und Sammlung
   1. Fügen Sie 8 ml neutralisierende Lösung hinzu, um die Verdauung von Trypsin zu stoppen.
   2. Übertragen Sie die Zellsuspension in ein 15-mL-Zentrifugenrohr.
   3. Pipette etwa 15 Mal, um eine Einzelzellsuspension zu erhalten.
   4. Zentrifugiere mit 156 × g für 5 Minuten bei 25 °C.
4. Neuauffederung und Nachbesaat
   1. Saugen Sie das Supernatant ab, ohne das Pellet zu stören.
   2. Lassen Sie das Zellpellet vorsichtig in 10 mL epithelialem Zellmedium wieder suspendieren, indem Sie etwa 10 Mal mit einer 1-ml-Pipette auf und ab pipettieren.
   3. Samen 1 × 10^{6 Zellen in} 10 ml Epithelzellmedium in eine neue 100-mm-Schale.
   4. Passen Sie die Saatdichte an, um am nächsten Tag isolierte, gut verteilte Einzelzellen oder kleine Cluster zu fördern und so Überfüllung zu vermeiden.
5. Wartungsarbeiten nach der Durchfahrt
   1. Inkubieren unter Standardkulturbedingungen (37 °C, 5 %_CO2).
   2. Beobachten Sie die Kultur regelmäßig und ersetzen Sie das Epithelzellmedium alle zwei Tage.
      HINWEIS: Die Zellen sind typischerweise nach dem ersten oder zweiten Durchgang bereit für nachgelagerte Anwendungen, sobald eine gesunde, adhärente Monoschicht mit ≥80%-Konfluenz erreicht ist.
      VORSICHT: Alle Materialien, die mit primären menschlichen Zellen in Kontakt kamen, wurden als potenzielle Biohazards behandelt. Vor der Entsorgung oder weiteren Verarbeitung wurden diese Materialien mit 10 % Bleichmittel desinfiziert, um den institutionellen Biosicherheitsrichtlinien zu entsprechen.

Results

Die erfolgreiche Etablierung des primären HEEC-Kultursystems wurde durch morphologische, proliferative und molekulare Bewertungen bestätigt, wie in Abbildung 1 dargestellt. Durch die Kombination der Mischenzymverdauung, Erythrozytenlyse und eines ROCK-Inhibitors ermöglichte dieses Protokoll eine effiziente Isolierung und stabile Expansion von Epithelzellen aus menschlichem Endometriumgewebe.

Morphologische Beobachtungen zeigten di...

Discussion

Die Etablierung eines zuverlässigen in-vitro-Modells menschlicher endometrialer Epithelzellen (HEECs) ist entscheidend für die Untersuchung der endometrialen Biologie und Pathologie¹¹. Obwohl mehrere Methoden zur HEEC-Isolierung entwickelt wurden, bleiben die meisten durch technische Komplexität, geringe Effizienz und begrenztes Ausdehnungspotenzial^{von 4,5} begrenzt. Viele Protokolle basieren auch ...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Dispase	Solarbio	CAS:42613-33-2	Für HEECs Isolation
Kollagenase Typ I	Merck	SKU:SCR103	Für HEECs Isolation
100 & Mikro; m-Mesh-Filter	Solarbio	431752	Für HEECs-Filtration
Kaninchen Anti CK18	abcam	ab133263	Zur Immunfluoreszenzfärbung zur Überprüfung des Differenzierungsmarkers von HEECs
Kaninchen gegen CDH1	abcam	ab40772	Zur Immunfluoreszenzfärbung zur Überprüfung des Differenzierungsmarkers von HEECs
Kaninchen Anti-VIM	abcam	ab16700	Zur Immunfluoreszenzfärbung zur Überprüfung des Differenzierungsmarkers von HEECs
4 % Paraformaldehyd	Solarbio	P0099	Zur Immunfluoreszenzfärbung zur Überprüfung des Differenzierungsmarkers von HEECs
CO2-Inkubator	Thermowissenschaftlich	42820906	Für die Zellinkubation
Zentrifuge	Eppendorf	5404HN133048	Zellzentrifuge
100 mm Zellkulturschüssel	Corning	430167	Für Zellkultur
50-ml-Zentrifugenröhre	Corning	430829	Für die Zellzentrifugation
1,5-ml-Mikrozentrifugenröhren	NEST	081722CK01	Für die Zellverdauung
Zell-Sieb	Solarbio	431752	Zellfiltration
Phosphatgepufferte Lösung	Tecono	20201033	Waschlösung
DMEM	Gibco	8122622	Komponente des Neutralisierungsmediums
Penicillin/Streptomycin	Thermowissenschaftlich	15140-122	Antibiotika
Fetales Rinderserum	Gibco	2556132P	Komponente des Neutralisierungsmediums
0,05 % Trypsin	Basalmedia	K431010	Für HEECS  Dissoziation
Y-27632	Solarbio	IY0040	ROCK-Inhibitor
Puffer für rote Blutkörperchen-Lyse	Solarbio	R1010	Lyse roter Blutkörperchen
1 % Triton X-100	Thermowissenschaftlich	HFH10	Membranpermeabilisierung
Esel-Anti-Kaninchen-IgG	Thermowissenschaftlich	A32790TR	Sekundärer Antikörper
DAPI	Thermowissenschaftlich	62248	DNA-Färbung
1 x PBST	Solarbio	P1031	Waschpuffer
Spezielles Medium für primäre HEECs	iCell	iCell-f004-002h	Für die HEEC-Kultur
Invertiertes konfokales Mikroskop	Zeiss	LSM880	Verwendet zur Aufnahme von Immunfluoreszenzbildern; Ausgestattet mit 40X
MRC-5-Zelllinie	iCell	iCell-h146	Zelllinie des humanen endometriumen Adenokarzinoms; STR-Profil.
Ishikawa-Zelllinie	iCell	iCell-h113	Zelllinie des humanen endometriumen Adenokarzinoms; STR-Profil.