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Methodenartikel

Ein neuartiges, serumfreies 2D- und 3D-Kultursystem, bestehend aus zwei kleinen Molekülen zur Kultivierung der Apithelzellen der Maus-Lacrimaldrüse

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DOI:

10.3791/70438

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10. Februar 2026

 ,  , 
1Department of Ophthalmology Optometry Center, China-Japan Union Hospital of Jilin University, 2Eye Institute & Affiliated Xiamen Eye Center, School of Medicine, Xiamen University, 3Huaxia Eye Hospital of Quanzhou, 4Shen Zhen Research Institute of Xiamen University

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Ein neuartiges, serumfreies Kultursystem, das die Kleinmolekül-Kombination 2C (Y27632 und SB431542) verwendet, wird eingeführt, um die Tränendrüsepithelzellen (LGECs) sowohl in 2D- als auch in 3D-Kulturen effizient zu expandieren und so eine präzise Kontrolle ihrer Proliferation und Differenzierung zu ermöglichen.

Zusammenfassung

Laprimaldrüsen- (LG)-Dysfunktion ist eine Hauptursache für eine wässrig-defiziente trockene Augenerkrankung, und zellbasierte sowie gewebstechnische Therapien zeigen ein erhebliches Potenzial für diese Erkrankung. Die begrenzte Verfügbarkeit ausreichend Samenzellen, die unter serumfreien Bedingungen kultiviert werden, hat jedoch ihre breite Anwendung behindert. In dieser Studie entwickelten wir ein neuartiges, serumfreies Kultursystem mit zwei kleinen Molekülen, Y27632 und SB431542 (2C), um LG-Epithelzellen (LGECs) effizient zu erweitern. Für die 2D-Primärkultur der LGECs wurden LGs aus 6-8 Wochen alten Mäusen isoliert und enzymatisch mit Dispase II und Kollagenase A verdaut. Die daraus resultierende Zellsuspension wurde in Kulturschalen mit einer Dichte von 7.500 Zellen/cm² gesät und mit 2C 12–14 Tage kultiviert. Als die Zellkonfluenz 80–90 % erreichte, wurde die Subkultur im Verhältnis 1:2 eingeleitet. Für die 3D-Kultur wurden 10.000 P1-LGECs in 10 μL 2C und 10 μL Matrixgel neu suspendiert und dann in der Mitte einer 24-Well-Platte ausgesät. Nach einer 30-minütigen Verfestigungsphase bei 37 °C wurden 600 μL 2°C für die weitere Kultur hinzugefügt. Zur Differenzierung wurden die 3D-Sphäroide 7 Tage lang mit 2C kultiviert, anschließend 2C entfernt und weitere 7 Tage fortgesetzt. LGECs, die mit 2C kultiviert wurden, zeigten eine hohe Proliferation mit erhöhter Expression von Stamm- und Proliferationsmarkern (Ki67, K14, P63, K5, K15 [P = 0,0011, 0,0002, 0,0012, 0,0003, 0,0014 jeweils]) und behielten Morphologie und Proliferationskapazität auch nach zehn Durchgängen bei. Darüber hinaus bildeten LGECs unter 3D-Bedingungen Sphäroide mit Stamm-/Vorläufereigenschaften, die sich nach der Entfernung von 2C weiter in Mikrodrüsenstrukturen mit mehreren LG-Zelltypen (AQP5, K19, α-SMA-positiv) und ausgereiften sekretorischen Funktionen differenzierten. Dieser Ansatz soll eine stabile Quelle von Samenzellen für die Tissue Engineering bieten und ein neues in-vitro-Modell zur Untersuchung der LG-Physiologie bieten.

Einleitung

Die Tränendrüse (LG) ist entscheidend für die Bildung der wässrigen Schicht des Tränenfilms, die für die Aufrechterhaltung der Homöostase der Augenoberfläche1 entscheidend ist. Eine Funktionsstörung des LG, verursacht durch Verletzungen oder Entzündungen, führt zu einer wässrig-defizienten trockenen Augenerkrankung (ADDE). Diese Erkrankung kann zu schwerer Entzündung der Augenoberfläche, chronischen Hornhauterkrankungen und in schweren Fällen zu dauerhaftemSehverlust führen. Aktuelle Behandlungen für ADDE behandeln hauptsächlich die Symptome, ohne die zugrunde liegende Drüsenfunktionsstörung anzugehen, die ihre langfristigeWirksamkeit einschränkt. Die Entwicklung gezielter Therapien für LG-Dysfunktion bringt mehrere Herausforderungen mit sich, darunter das Fehlen langfristiger, einfacher In-vitro-Modelle, die das Verständnis der LG-Pathophysiologie einschränken und die Entwicklung wirksamer Therapien behindern. Obwohl die Zelltransplantation Potenzial zur Förderung der LG-Regeneration gezeigt hat, stellen die begrenzte Expansionskapazität von Zellen in vitro und die Komplexität bestehender Kultursysteme erhebliche Hindernisse für die klinische Anwendungdar 1,3. Daher ist es unerlässlich, ein einfaches, langfristiges Kultursystem für erwachsene Maus-LGs zu etablieren, um das Verständnis der LG-Physiologie und -Pathologie zu fördern sowie eine zuverlässige Quelle von LG-Stamm-/Vorläuferzellen für die Reparatur und Regeneration von LG-Verletzungen bereitzustellen.

Bestehende In-vitro-Kultursysteme für LG haben erhebliche Fortschritte gemacht, stehen aber weiterhin vor erheblichen Einschränkungen. Viele dieser Methoden basieren auf serum-supplementierten Medien, was mehrere Probleme mit sich bringt, wie Batch-zu-Batch-Variabilität, undefinierte Komponenten und das Risiko einer Fibroblasten- oder mesenchymalen Cellkontamination 4,5,6,7,8. Zudem sind serumbasierte Systeme ungeeignet für die Untersuchung der pathogenen Mechanismen von LG-Erkrankungen und stellen aufgrund potenzieller Immunabstoßungsrisiken Herausforderungen für Zelltransplantationstherapiendar. Als Reaktion auf diese Einschränkungen wurden mehrere serumfreie Methoden entwickelt, um LG-Epithelzellen (LGECs) sowohl von Mäusen als auch von Menschen zu kultivieren. Zum Beispiel setzten Ueda et al. erfolgreich eine serumfreie Methode ein, um LGECs aus neugeborenenMäusen 10 zu kultivieren. Diese Methode war jedoch durch die Unfähigkeit eingeschränkt, die Zellen durch Subkulturen zu leiten, und durch die Notwendigkeit, dass eine große Anzahl neonataler Drüsen ausreichend LGECs erhalten konnte. Ähnlich entwickelten Kobayashi et al. ein serumfreies Kultursystem mit Choleratoxin, hatten jedoch Schwierigkeiten bei der Aufrechterhaltung der zellulären Morphologie währendAbschnitt 11. Neuere Fortschritte umfassen Zhang et al.s Entwicklung eines 3D-Kultursystems für Maus-LG-Stammzellen und das LG-Organoidkultursystem von Bannier-Hélaouët et al. für Mäuse und Menschen 12,13,14,15. Diese Systeme basieren jedoch auf komplexen Medienformulierungen mit mehreren kleinen Molekülen, Wachstumsfaktoren und Zusatzstoffen, was den Kulturprozess erschwert und die Skalierbarkeit einschränkt. Diese Herausforderungen unterstreichen die Notwendigkeit eines vereinfachten, effektiven serumfreien Kultursystems, das die effiziente Ausweitung von LGECs ermöglichen kann, während deren proliferative und Stamm-/Vorläufermerkmale für weitere therapeutische Anwendungen und Forschung erhalten bleiben.

In den letzten Jahren hat die rasante Entwicklung der kleinen molekülvermittelten chemischen Umprogrammierung neue Strategien zur Erhaltung und Erweiterung primärer adulter Zellen in vitro16 eingeführt. Durch die Regulierung intrazellulärer Signalwege, Zell-Matrix-Interaktionen und Zelladhäsion verbessern kleine Moleküle die Zellproliferation und Plastizität erheblich, was die Effizienz der Zellexpansion und die Kontrolle des Schicksalsverbessert 17. Aufgrund ihrer kontrollierbaren Produktion, niedrigen Immunogenität und nicht-genomischen Integration sind kleine Moleküle ideal für den Bau von In-vitro-Systemen zur Erweiterung adulter Epithelzellen16. Kombinationen verschiedener kleiner Moleküle haben gezeigt, dass sie die in-vitro-Expansion verschiedener primärer Zelltypen, einschließlich Haut-, Hornhaut- und konjunktivalen Epithelstammzellen, effektiv aufrechterhalten 18,19,20. Daher zeigt die Entwicklung einer auf kleinen Molekülen basierenden Strategie zur Erweiterung von LGECs Potenzial für zukünftige Anwendungen sowohl in der Forschung als auch in therapeutischen Umgebungen.

In diesem Protokoll wurde ein einfaches und effizientes, serumfreies Kultursystem entwickelt, das zwei kleine Moleküle, Y27632 und SB431542 (2C), verwendet, um die Expansion von LGECs zu unterstützen. Durch die Kombination der Vorteile dieser beiden Moleküle wurde ein serumfreies System für sowohl 2D- als auch 3D-Kulturen etabliert. LGECs, die mit 2C kultiviert wurden, zeigten eine hohe Proliferationskapazität und Stamm-/Vorläuferzellmerkmale und behielten die typische Epithelzellmorphologie nach mindestens 10 Passagen in vitro bei. In der 3D-Kultur behielten LGECs nicht nur Stamm-/Vorläuferzellmerkmale, sondern zeigten auch die Fähigkeit, nach der Entfernung von 2C weiter in sekretorische Strukturen zu differenzieren und so Mikrodrüsenstrukturen mit sekretorischer Funktion zu bilden. Dieses serumfreie System eignet sich für In-vitro-Modelle der LG-Physiologie und -Pathologie und bietet zugleich eine bedeutende Zellquelle für LG-Gewebetechnik und regenerative Anwendungen. Das vorliegende Protokoll bietet jedoch nur eine vorläufige Erkundung der 3D-Kultur. Langfristige 3D-Kultur liegt derzeit außerhalb des Rahmens dieser Forschung. Es ist wichtig zu beachten, dass diese Methode speziell für adulte Maus-LGECs entwickelt wurde und ohne weitere Optimierung möglicherweise nicht auf andere Arten anwendbar ist.

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Protokoll

Alle Experimente wurden in Übereinstimmung mit den Vorschriften der Association for Research in Vision and Ophthalmology (ARVO) sowie des Ethics Committee für experimentelle Tiere der Universität Jilin und der Universität Xiamen durchgeführt.

HINWEIS: Alle Zellkulturverfahren wurden in einem UV-sterilisierten Biosicherheitsschrank im Zelloperationsraum durchgeführt.

1. Primärkultur der LGECs

  1. Isolierung des LG-Gewebes
    1. Eliminieren Sie betäubte C57BL/6J-Mäuse (6–8 Wochen alt) durch eine zervikale Verrenkung und desinfizieren Sie den Ohrbereich (rund um den LG) mit 75 % Ethanol, um eine Kontamination zu vermeiden.
    2. Machen Sie einen Schnitt von der äußeren Kante bis zur Haut unter dem Ohr, um das LG freizulegen. Mit steriler, glatter Pinzette und Schere trennen Sie das LG sorgfältig vom umgebenden Gewebe (Parotidüsen und Bindegewebe) unter einem Sektionsmikroskop, um das LG zu erhalten.
    3. Platzieren Sie das LG in ein vorgekühltes Gewebeabnahmemedium (DMEM mit 10 % Penicillin-Streptomycin-Amphotericin) in einem 1,5-mL Mikrozentrifugenröhrchen, wobei das Gewebe auf Eis bleibt, um den Abbau zu minimieren.
  2. Gewebevorbereitung
    1. Übertragen Sie die LGs in ein neues kaltes Gewebe-Sammelmedium in einer 3,5 cm großen Schale.
    2. Entfernen Sie das restliche Mausfell und ziehen Sie dann die Bindegewebskapsel um die LGs ab. Isolieren Sie das Drüsengewebe, indem Sie glatte Pinzetten verwenden, um das Bindegewebe zwischen den Lobulen zu entfernen.
      HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass die Kapsel auf der Oberfläche des LG und das Bindegewebe zwischen den Lobulen gründlich entfernt werden, um die Kanäle zwischen den Lobulen freizulegen, was das Eindringen der Verdauungslösung während des anschließenden Verdauungsprozesses erleichtert.
    3. Das Gewebe in ein neues Sammelmedium überführen und 5–10 Minuten waschen, um eine Kontamination zu vermeiden.
  3. Enzymatische Verdauung
    1. Geben Sie die LGs in ein 1,5 ml Mikrozentrifugenrohr mit Verdauungslösung (serumfreies Medium, ergänzt mit 2 mg/mL Dispase II und 2 mg/mL Kollagenase A). (Ergänzende Tabelle 1).
      HINWEIS: Für 4 LGs wird 1 ml Verdauungslösung benötigt.
    2. Schneiden Sie das LG-Gewebe mit einer Mikroskopschere fein in kleine Stücke (etwa 0,5–1 mm³) innerhalb des Rohrs.
    3. Inkubieren Sie das Mikrozentrifugenröhrchen bei 37 °C mit 5 % CO2für 2,5–3 Stunden. Alle 30–60 Minuten wird das Gewebe vorsichtig in der Verdauungslösung vermischt, um eine gründliche enzymatische Verdauung zu gewährleisten.
  4. Isolierung und Ernte von LGECs
    1. Schütteln Sie das Mikrozentrifugenrohr mehrmals nach Abschluss der Verdauungszeit. Pipettieren Sie die Verdauungslösung mehrmals, um das Gewebe in Einzelzellen oder kleine Zellklumpen zu zerlegen. Beobachten Sie unter dem Mikroskop, um den Verdauungsfortschritt zu bestätigen.
      HINWEIS: Wenn keine sichtbaren Partikel mehr in der Verdauungslösung verbleiben und große Mengen einzelner Zellen sowie kanalartige Zellaggregate unter dem Mikroskop beobachtet werden, wird der Verdauungsprozess gestoppt.
    2. Zentrifugiere das Rohr bei 300 x g für 5 Minuten bei Raumtemperatur und entsorge dann das Verdauungsmedium.
    3. Setzen Sie das Zellpellet in 1 ml steriles DPBS und zentrifugieren Sie erneut bei 1000 x g für 3 Minuten bei Raumtemperatur, um verbleibende Verdauungsenzyme zu entfernen.
    4. Wiederholen Sie Schritt 1.4.3, entfernen Sie das Supernatant und suspendieren Sie das Zellpellet in 500 μL serumfreiem Medium.
  5. LGECs-Säzeugung und Primärkultur
    1. Bereiten Sie das LGEC-Kulturmedium vor, indem Sie serumfreies Medium mit 1 % Penicillin-Streptomycin und 2C (10 μM Y27632 und 10 μM SB431542) ergänzen. (Ergänzende Tabelle 1)
    2. Säen Sie die Zellen in standardmäßige, unbehandelte 24-Well-Kulturplatten mit einer Dichte von 7,5 x 10³ Zellen/cm² unter Verwendung eines serumfreien 2C-Mediums.
    3. Nach dem Aussäen klopfen Sie vorsichtig auf die Ränder der Kulturplatte, um eine gleichmäßige Zellverteilung zu gewährleisten. Stellen Sie die Platte in einen 37 °C Inkubator mit 5 %CO2.
    4. Wechsle das Kulturmedium zum ersten Mal 72 Stunden nach dem Aussaaten. Wechsle danach das Medium alle 2–3 Tage.
      HINWEIS: Vermeiden Sie es, die Kultur während der ersten 72 Stunden zu stören. Beim ersten Mediumwechsel sollten die Zellen nicht mit DPBS gewaschen werden. Entferne einfach das alte Medium und füge frisches Medium hinzu.

2. Subkultivierung von LGECs

HINWEIS: Subkultur, wenn die Zellkonfluenz 80–90 % erreicht, was typischerweise etwa 14 Tage nach der Primärkultur erfolgt.

  1. Entferne das Kulturmedium und wasche die Zellen vorsichtig zweimal mit sterilem DPB.
  2. Füge 250 μL 0,25 % Trypsin-EDTA hinzu und inkubiere bei 37 °C mit 5 % CO2für 10–15 Minuten. Sobald sich die Tight Junctions dissoziieren und die Zellen abgerundet sind, fügen Sie ein gleiches Volumen definierter Trypsininhibitorlösung hinzu, um die Verdauung zu beenden.
    HINWEIS: Wenn während der Primärkultur flache und große haftende Zellen beobachtet werden, behandeln Sie die Kultur mit 0,25 % Trypsin-EDTA für 5 Minuten, um diese heterogenen Zellen zu entfernen. Anschließend wird die Kultur erneut mit 0,25 % Trypsin-EDTA für weitere 5 Minuten behandelt, um sie weiter zu verdauen und eine reinere Population von LGECs für den späteren Verlauf zu erhalten.
  3. Die Zellsuspension wird durch Pipettieren mit einer 1-mL-Pipette gemischt, dann in ein 1,5-mL-Zentrifugenrohr übertragen und bei 1000 x g für 3 Minuten bei Raumtemperatur gezentrifugiert. Entsorge das Supernatant.
  4. Waschen Sie die Zellen mit sterilen DPBS und zentrifugieren Sie erneut, um die LGECs zu sammeln.
  5. Suspendiere die LGECs erneut in einem 2C-Kulturmedium und säe im Verhältnis 1:2 für die Subkultur. Die Zellen vorsichtig durch Schütteln der Kulturplatte mischen und bei 37 °C mit 5 % CO inkubieren.
    HINWEIS: Subkultivierung im Verhältnis 1:2 bedeutet, dass, sobald die Zellkonfluenz 80–90 % erreicht, die LGECs von einer Bohrlochplatte verdaut und gleichmäßig auf zwei neue Bohrlochplatten verteilt werden.
  6. Wechsle das Medium am dritten Tag nach der Aussaat und dann alle 2-3 Tage, je nach Zellzustand.
  7. Beobachte die Zellmorphologie täglich unter einem Invert-Phasenkontrastmikroskop und dokumentiere mit Fotos.

3. Dreidimensionale (3D) Kultur der LGECs

HINWEIS: Das 3D-Kulturexperiment verwendet P1-LGECs. Wenn die P1-LGECs nach 7 Tagen Kultur mit 2C 80-90 % Konfluenz erreichen, werden sie für die 3D-Kultur verwendet.

  1. Vorbereitungsschritte
    1. Matrixgel (Ergänzungstabelle 1) aus dem -20 °C Gefrierschrank in einen 4 °C Kühlschrank zum Auftauen über Nacht überführen.
    2. Stellen Sie die erforderlichen Pipettenspitzen in den -20 °C Gefrierfach, um eine ordnungsgemäße Vorkühlung zu gewährleisten.
    3. Vorwärmen Sie die 24-Brunnen-Kulturplatte, indem Sie sie 2 Stunden vor Beginn der 3D-Kultur in einen 37 °C, 5 %CO2-Inkubator legen.
    4. Bereiten Sie eine Eisbox vor und setzen Sie mehrere 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhren zur Vorkühlung hinein. Sterilisieren Sie die Eisbox vor der Verwendung in einem Biosicherheitsschrank.
  2. 3D-Kultur der LGECs
    1. Erhalten Sie P1-LGECs, wie in den Schritten 2.1 bis 2.4 beschrieben.
    2. Das Zellpellet in einem 2C-Kulturmedium wieder suspendieren und die Zelldichte auf 1 × 10⁴ Zellen pro 10 μL anpassen.
    3. Nehmen Sie das aufgetaute Matrix-Gel aus dem 4 °C-Kühlschrank und die vorgekühlten Pipettenspitzen aus dem -20 °C Gefrierschrank und legen Sie sie in die Eisbox im Biosicherheitsschrank.
    4. Entferne die vorgeheizte 24-Well-Kulturplatte aus dem Inkubator und stelle sie in den Biosicherheitsschrank.
    5. Fügen Sie ein entsprechendes Volumen der Zellsuspension hinzu, gemischt mit Matrixgel im Verhältnis 1:1, mit vorgekühlten Pipettenspitzen. Sanft mischen, um eine gleichmäßige Verteilung zu gewährleisten.
    6. Pipettieren Sie 20 μL der Mischung aus Schritt 3.2.5 vorsichtig in die Mitte jedes Muldes der vorgeheizten 24-Bohrloch-Platte.
    7. Invertieren Sie die Platte und inkubieren Sie sie 30 Minuten lang in einem 37 °C starkenInkubator mit 5 % CO2, damit das Matrixgel erstarren kann.
    8. Sobald das Matrizengel erstarrt ist, fügen Sie jedem Bohrloch 600 μL 2C-Kulturmedium hinzu.
    9. Inkubieren Sie die Kulturplatte 14 Tage lang ineinem Inkubator mit 37 °C und 5 % CO2. Wechsle das Medium am Tag 3 nach der Aussaat und danach alle 2-3 Tage, je nach Zellzustand.
    10. Beobachte täglich die 3D-Sphäroidenbildung unter einem Invert-Phasenkontrastmikroskop und mache Bilder zur Dokumentation.
  3. Differenzierung von 3D-LGEC-Sphäroiden
    1. Kultivieren Sie 3D-LGEC-Sphäroide, wie in Schritt 3.2 beschrieben.
    2. Nach 7 Tagen Kultur entfernen Sie das 2C-Kulturmedium und waschen Sie die Zellen vorsichtig zweimal mit DPBS, um die restlichen 2C zu entfernen. Achte darauf, das Matrix-Gel nicht zu stören.
    3. Fügen Sie serumfreies Medium ohne 2C (Null) hinzu und setzen Sie die Kultur weitere 7 Tage fort, um die Differenzierung zu induzieren.
    4. Wechsle das Medium alle 2-3 Tage während der Kulturzeit.
    5. Beobachte die morphologischen Veränderungen der induzierten 3D-Sphäroide täglich unter einem Invert-Phasenkontrastmikroskop und nimm Bilder zur Dokumentation auf.

4. Einbettung und Gefrorenschnitt differenzierter 3D-LGEC-Sphäroide

HINWEIS: Die Differenzierung von 3D-Sphäroiden wird wie in Abschnitt 3.3 beschrieben induziert. Nach 7 Tagen Differenzierung folgen Sie den folgenden Schritten für optimale Schneidetemperatur (OCT) Einbettung und gefrorene Schnitte der differenzierten 3D-Sphäroide.

  1. Aspirieren Sie das Kulturmedium entlang der Ränder des Brunnens. Waschen Sie die differenzierten Sphäroide vorsichtig dreimal mit sterilem DPBS.
  2. Gib 1 ml 4%-Paraformaldehyd (PFA) in den Brunnen in einem Biosicherheitsschrank oder Abzugshaube und fixiere die Sphäroide für 10 Minuten bei Raumtemperatur.
  3. Waschen Sie die Sphäroide vorsichtig dreimal mit steriler DPBS, jede Wäsche dauert 10 Minuten, um das Fixierungsmittel zu entfernen.
  4. Verwenden Sie einen Pfannenwender, um die 3D-Kugelmatrix-Gel-Kuppelstruktur vorsichtig abzuschaben und in ein 5-mL-Mikrozentrifugenrohr mit 20% Saccharoselösung zu übertragen.
  5. Inkubieren Sie das Rohr über Nacht bei 4 °C, bis sich die Kuppelstruktur am Boden des Rohrs absetzt.
  6. Entfernen Sie die Kuppelstruktur aus der Saccharoselösung, entfernen Sie vorsichtig eventuelle Restsaccharose und legen Sie sie in die OCT-Substanz ein. In flüssigem Stickstoff einfrieren und bei -80 °C lagern.
  7. Vor der Färbung bereiten Sie 10 μm dicke Schnitte mit einem Gefriermikrotom vor.

5. Nachweis der Sekretionsfunktion differenzierter 3D-LGEC-Sphäroide

  1. Probenentnahme
    1. Induziere die Differenzierung von 3D-Sphäroiden wie in Abschnitt 3.3 beschrieben.
    2. Nach 7 Tagen Differenzierung entferne das Kulturmedium und wasche die 3D-Sphäroide dreimal mit DPBS.
    3. Fügen Sie 500 μL serumfreies Medium ohne 2°C hinzu und inkubieren Sie bei 37 °C mit 5 % CO2für 2 Stunden.
    4. Sammeln Sie das Kulturmedium und übertragen Sie es als Basisprobe in ein 1,5-ml-Mikrozentrifugenrohr, um die Lactoferrin-(LTF)-Konzentration vor der Pilotarpinstimulation zu messen.
    5. Wasche die 3D-Sphäroide vorsichtig dreimal mit sterilem DPBS.
    6. Fügen Sie 500 μL serumfreies Medium mit 1 μg/mL Pilotarpin hinzu und inkubieren Sie die 3D-Sphäroide bei 37 °C mit 5 % CO2für 24 Stunden.
    7. Nach der Inkubation wird das Kulturmedium in ein 1,5-ml-Mikrozentrifugenrohr aufgenommen (zur Messung der LTF-Konzentration nach der Pilocarpin-Stimulation).
    8. Zentrifugieren Sie die gesammelten Kulturmediumproben bei 4 °C bei 1000 × g für 20 Minuten. Sammeln Sie das Supernatant ein und lagern es bei -80 °C für spätere Nutzung.
  2. Probenverdünnung
    1. Holen Sie die Proben aus dem -80 °C Gefrierschrank und lassen Sie sie bei Zimmertemperatur vollständig auftauen.
    2. Nehmen Sie 5 μL der Probe und verdünnen Sie sie mit 495 μL Probenverdünnungspuffer aus dem enzymgebundenen Immunsorbent-Assay-(ELISA)-Kit, um eine 100-fache Verdünnung herzustellen.
  3. Reagenzvorbereitung
    1. Bringen Sie alle Reagenzien des ELISA-Sets 20 Minuten vor der Verwendung auf Raumtemperatur.
    2. Bereite den Waschpuffer vor: Berechnen Sie die erforderliche Menge basierend auf der Anzahl der Proben und verdünnen Sie den konzentrierten Waschpuffer mit destilliertem Wasser (1:24).
    3. Bereiten Sie die Standardlösung vor:
      1. Zentrifugiere den lyophilisierten Standard bei 10.000 × g für 1 Minute. Gib 1 ml Referenzstandard und Probeverdünner hinzu, lasse es 10 Minuten stehen und kehre sanft mehrmals um.
      2. Nachdem es vollständig aufgelöst ist, vermischen Sie es gründlich mit einer Pipette. Diese Rekonstitution ergibt eine funktionierende Lösung von 2000 pg/mL.
    4. Führen Sie serielle Verdünnungen gemäß den Bausätzen vor, um den folgenden Standardkonzentrationsgradienten herzustellen: 2000, 1000, 500, 250, 125, 62,5, 31,25, 0 pg/mL.
    5. Bereiten Sie die biotinylierte Detektionsantikörper-Arbeitslösung vor:
      1. Berechnen Sie das erforderliche Volumen für den Assay (50 μL/Bohrloch). Zentrifugieren Sie den konzentrierten biotinylierten Detektionsantikörper bei 800 × g für 1 Minute, dann verdünnen Sie den 50× konzentrierten biotinylierten Detektionsantikörper zu einer 1× Arbeitslösung mit biotinyliertem Detektionsantikörper.
      2. Bereite die Lösung kurz vor der Anwendung vor, wobei etwas mehr als die berechnete Menge entsteht, typischerweise 100–200 μL mehr als nötig hinzugefügt werden.
    6. Bereiten Sie die Meerrettichperoxidase (HRP) konjugierte Arbeitslösung vor:
      1. Berechnen Sie das erforderliche Volumen für das Experiment (50 μL/Brunnen). Zentrifugieren Sie das konzentrierte HRP-Konjugat bei 800 × g für 1 Minute und verdünnen Sie es dann auf eine Arbeitskonzentration von 1x mit einem HRP-konjugierten Verdünner.
      2. Bereite die Lösung kurz vor der Anwendung vor, wobei etwas mehr als die berechnete Menge entsteht, typischerweise 100–200 μL mehr als nötig hinzugefügt werden.
  4. ELISA-Testverfahren
    1. Bestimmen Sie die Bohrungen für die verdünnten Standard-, Blank- und Proben, mit jeweils 3 Replikaten. Fügen Sie 25 μL der Standard-Arbeitslösung, Blanklösung oder verdünnte Probelösung in die entsprechenden Bohrlöcher ein. Decken Sie die Platte mit dem im Set mitgelieferten Versiegelungsmittel ab und inkubieren Sie 90 Minuten bei 37 °C.
      HINWEIS: Lösungen sollten am Boden des Micro-ELISA-Plattenschachts hinzugefügt werden. Vermeiden Sie es, die Innenwand zu berühren und so viel wie möglich Schaum zu verursachen.
    2. Geben Sie die Flüssigkeit aus den Brunnen ab, ohne zu waschen. Fügen Sie sofort 50 μL der biotinylierten Detektionsantikörper-Arbeitslösung zu jedem Bohrloch hinzu. Den Teller mit einem neuen Versiegelungsmittel abdecken und 60 Minuten bei 37 °C inkubieren.
    3. Dekantieren Sie die Flüssigkeit aus den Bohrlöchern und fügen Sie jedem Bohrloch 350 μL vorbereiteten Waschpuffer hinzu. 1 Minute einweichen, dann die Flüssigkeit aus jedem Brunnen absaugen oder dekantieren und mit sauberem, saugfähigem Papier trocken tupfen. Wiederhole diesen Wasch-Schritt dreimal.
      HINWEIS: Lassen Sie die Brunnen während des Waschvorgangs nicht austrocknen.
    4. Fügen Sie jedem Bohrloch 50 μL der vorbereiteten HRP-konjugierten Arbeitslösung hinzu. Decken Sie die Platte mit einem neuen Versiegelungsmittel ab und inkubieren Sie 30 Minuten bei 37 °C.
    5. Dekantieren Sie die Flüssigkeit aus den Brunnen und wiederholen Sie den Waschvorgang fünfmal mit Waschpuffer, wie in Schritt 5.4.3 beschrieben.
    6. Gib jedem Brunnen 50 μL Substratreagenz hinzu. Decken Sie die Platte mit einem neuen Versiegler ab und inkubieren Sie 15 Minuten bei 37 °C im Dunkeln.
    7. Fügen Sie jedem Bohrloch 25 μL Stoplösung hinzu, um die Reaktion zu beenden. Stellen Sie sicher, dass die Stop-Lösung in derselben Reihenfolge wie die Substratlösung hinzugefügt wird.
    8. Bestimmen Sie die optische Dichte (OD-Wert) jedes Bohrlochs sofort bei 450 nm mit einem Mikroplattenleser.

6. RNA-Isolierung

  1. Probenentnahme
    1. Für LG-Gewebe
      1. Isolieren Sie das extraorbitale LG-Gewebe aus adulten Mäusen, wie in Abschnitt 1.1.2-1.1.2 beschrieben.
      2. Tauchen Sie das frisch isolierte LG-Gewebe in PBS ein, um das Blut abzuwaschen.
      3. Tupfen Sie die Oberflächenfeuchtigkeit des LG mit Filterpapier ab und legen Sie das Gewebe in ein 1,5 ml Mikrozentrifugenrohr mit 1 ml RNA-Extraktionsreagenz (Ergänzungstabelle 1), wobei das Rohr auf Eis bleibt.
        HINWEIS: Führen Sie vor der RNA-Extraktion Mahlschritte durch, um eine vollständige Gewebelyse sicherzustellen.
      4. Fügen Sie zwei saubere Stahlschleifperlen in das Mikrozentrifugenrohr und legen Sie das Rohr dann in eine vorgekühlte Hochgeschwindigkeits-Mahlmaschine mit niedriger Temperatur.
      5. Stellen Sie die Mühlenparameter ein: Frequenz 70 Hz, Mahlzeit 45 Sekunden, Pausenzeit 15 Sekunden und Wiederholung für 10 Zyklen. Ziehen Sie den Kappengriff des Schleifers fest und beginnen Sie mit dem Schleifen.
      6. Stellen Sie das Rohr auf Eis oder lagern Sie es bei -80 °C für die spätere RNA-Extraktion nach Abschluss des Mahlvorgangs.
    2. Für LGECs
      1. Entfernen Sie das Kulturmedium und waschen Sie die Zellen dreimal mit steriler DPBS, wenn die LGECs eine Konfluenz von 80–90 % erreichen.
      2. Fügen Sie jedem Bohrloch 600 μL RNA-Extraktionsreagenz hinzu (für eine 24-Brunnen-Platte) und inkubieren Sie bei Raumtemperatur 5–10 Minuten.
      3. Verwenden Sie eine 1-mL-Pipette, um die RNA-Extraktionsreagenzlösung in jedem Brunnen wiederholt zu pipetten, um eine vollständige Zelllyse sicherzustellen.
      4. Übertragen Sie die Lösung in ein 1,5-ml-Mikrozentrifugenrohr.
      5. Stellen Sie das Rohr auf Eis oder lagern Sie es bei -80 °C für die spätere RNA-Extraktion.
    3. Für 3D-LGEC-Sphäroide
      1. Sammeln Sie undifferenzierte und differenzierte 3D-LGEC-Sphäroide, die 14 Tage lang kultiviert werden, wie in den Schritten 3.2-3.3 beschrieben. Fügen Sie jedem Brunnen 1 ml Verdauungslösung (serumfreies Medium mit 1 mg/mL Dispase II) hinzu, um sicherzustellen, dass die 3D-sphäroidmatrix-Gelkuppelstruktur vollständig abgedeckt ist. InkubierenSie bei 37 °C mit 5 % CO2 für 30 Minuten.
      2. Übertragen Sie die Verdauungslösung mit den 3D-Sphäroiden mit einer 1-ml-Pipette in ein 1,5-mL Mikrozentrifugenrohr. Zentrifugiere bei 1000 × g für 3 Minuten, um das sphäroide Pellet zu sammeln.
      3. Wasche das Pellet mit 1 ml DPBS und zentrifugiere es bei 1000 × g für 3 Minuten, um das Pellet erneut zu sammeln.
      4. Fügen Sie 600 μL RNA-Extraktionsreagenz (pro 20 μL Matrixgel) hinzu und inkubieren Sie bei Raumtemperatur für 5–10 Minuten.
      5. Sorgfältig mit einer 1-ml-Pipette mischen, um eine vollständige Lyse der 3D-Sphäroide sicherzustellen.
      6. Stellen Sie das Rohr auf Eis oder lagern Sie es bei -80 °C für die spätere RNA-Extraktion.
  2. RNA-Extraktion
    HINWEIS: Tragen Sie geeignete persönliche Schutzausrüstung (Laborkittel, Handschuhe, Maske) und führen Sie alle Verfahren mit Chloroform und Isopropanol in einer Abzugshaube durch. Entsorgen chemische Abfallströme in ausgewiesenen Behältern für gefährliche Abfälle, die für die Erzeugung von gefährlichen Abfällen gekennzeichnet sind, gemäß institutionellen Abfallentsorgungsprotokollen.
    1. Fügen Sie Chloroform (1/5 Volumen RNA-Extraktionsreagens) in das Zentrifugenrohr mit der RNA-Probe im RNA-Extraktionsreagenz (ab Schritt 6.1) hinzu.
      HINWEIS: Führen Sie den Eingriff in einer Abzugshaube durch.
    2. Gründlich mit einem Wirbel mischen und 10 Minuten bei Zimmertemperatur inkubieren, bis zur Phasentrennung.
    3. Zentrifugiere bei 14.000 x g für 10 Minuten bei 4 °C.
      HINWEIS: Nach der Zentrifugation trennt sich die Flüssigkeit in drei Schichten, wobei die RNA sich in der obersten transparenten wässrigen Phase befindet.
    4. Bereiten Sie ein neues 1,5 mL RNase-freies Zentrifugenrohr vor und fügen Sie Isopropanol (1/2 des Volumens des RNA-Extraktionsreagens) in eine Abzughaube hinzu.
    5. Pipettieren Sie die oberste transparente wässrige Phase (1/2 des Volumens des RNA-Extraktionsreagens) vorsichtig in das neue RNase-freie Rohr.
      HINWEIS: Achten Sie darauf, die mittlere Schicht beim Pipettern nicht zu kontaminieren.
    6. Wenden Sie das Rohr mehrmals um, um es zu mischen, und inkubieren Sie es 10 Minuten bei Raumtemperatur. Dann zentrifugiert man erneut mit 14.000 x g für 10 Minuten bei 4 °C.
    7. Entsorge das Supernatant und gib 500 μL 75 % Ethanol hinzu, um das Pellet durch Umkehren des Rohrs zu reinigen. Zentrifugiere erneut bei 14.000 x g für 5 Minuten bei 4 °C.
    8. Wiederholen Sie Schritt 6.2.7. Entsorgen Sie das Überlagerungsmittel und führen Sie eine schnelle Zentrifugation durch, um eventuelle Restflüssigkeiten zu entfernen.
    9. Legen Sie das Rohr auf Eis in die Dampfhaube, öffnen Sie den Deckel und lassen Sie es 10-20 Minuten an der Luft trocknen, bis das weiße Pellet halbdurchsichtig wird.
    10. Fügen Sie 20 μL RNase-freies Wasser hinzu, um das Pellet zu lösen. Missen Sie die RNA-Konzentration und -Reinheit mit einem Spektrophotometer.
      HINWEIS: Wenn die RNA-Konzentration zu hoch ist, verdünnen Sie mit einer angemessenen Menge RNase-freiem Wasser.
    11. Legen Sie die RNA-Lösung auf Eis oder lagern Sie sie bei -80 °C für den anschließenden Reverse-Transkriptionsprozess.

7. Quantitative RT-PCR (qRT-PCR)

  1. Umgekehrte Transkription
    1. Fügen Sie gemäß den Anweisungen des Herstellers folgende Komponenten dem PCR-Reaktionsröhrchen hinzu: 800 ng Gesamt-RNA (berechnet das Volumen basierend auf der Konzentration), 4 μL 5x All-in-One SuperMix für q-PCR, 1 μL gDNA-Entferner und RNase-freies Wasser, um das Gesamtvolumen auf 20 μL zu bringen.
    2. Verrühre die Komponenten vorsichtig. Stellen Sie die PCR-Maschine auf folgende Bedingungen ein: 55 °C für 6 Minuten, 80 °C für 1 Minute und dann 12 °C auf unbestimmte Zeit.
    3. Die cDNA wird bei -20 °C gelagert oder für den qRT-PCR-Prozess nach Abschluss der Reverse-Transkriptionsreaktion auf Eis gelegt.
  2. qRT-PCR
    1. Bereiten Sie die qRT-PCR-Premix-Lösung zur Zielerfassung verschiedener Gene wie folgt vor: 5 μL 2x Green qPCR SuperMix, 0,2 μL Forward Primer (10 μM), 0,2 μL Reverse Primer (10 μM) und 3,6 μL nukleasefreies Wasser. Vorsichtig verrühren und auf Eis legen.
    2. Fügen Sie gemäß dem experimentellen Design 9 μL der qRT-PCR-Vormischung (hergestellt in Schritt 7.2.1) und 1 μL cDNA (hergestellt in Schritt 7.1) in die qRT-PCR-Röhren ein.
    3. Zentrifugieren Sie die Röhren bei 1000 × g bei Raumtemperatur für 2 Minuten.
    4. Setzen Sie die Röhren zur Erkennung in das fluoreszenzquantitative PCR-Gerät ein.
      HINWEIS: Verwenden Sie eine Drei-Schritte-Methode mit folgendem Programm gemäß den Anweisungen des Reagenzherstellers: 94 °C für 30 Sekunden, 94 °C für 5 Sekunden, 60 °C für 15 Sekunden und 72 °C für 10 Sekunden. Beginne mit dem Zyklus von Schritt 2 für 40-45 Zyklen.
    5. Führen Sie quantitative Analysen mit der vergleichenden CT-Methode (2-ΔΔCt) durch.
      HINWEIS: Jeder Datensatz sollte mindestens dreimal unabhängig wiederholt werden, um die Zuverlässigkeit der Ergebnisse sicherzustellen.

8. Immunfluoreszenzfärbung

HINWEIS: Die Immunfluoreszenzfärbung erfolgt an LGECs, die in 24-Well-Platten mit Konfluenzraten von 70–80 % kultiviert wurden, oder an gefrorenen Schnitten differenzierter LGECs-3D-Strukturen.

  1. Für LGECs
    1. Entfernen Sie das Kulturmedium aus den Brunnen und waschen Sie die Zellen dreimal mit PBS.
    2. Fügen Sie 500 μL 4 % PFA zu jedem Brunnen in einem Biosicherheitsschrank oder Abzugshaube hinzu und inkubieren Sie 15 Minuten bei Raumtemperatur, um die Zellen zu reparieren.
    3. Wasche die Zellen dreimal mit PBS, jede Wasche dauert 5 Minuten.
    4. Fügen Sie 500 μL 0,2 % Triton X-100 hinzu, um die Zellen zu bedecken, und inkubieren Sie 20 Minuten bei Raumtemperatur, um die Zellmembran zu permeabilisieren.
    5. Wasche die Zellen dreimal mit PBS, jede Wasche dauert 10 Minuten.
    6. Entfernen Sie das PBS und verwenden Sie einen immunhistochemischen Marker, um jeden Brunnen der 24-Well-Platte einen Kreis zu zeichnen. Fügen Sie jedem Brunnen 50 μL 2 % BSA hinzu, um die Zellen zu bedecken. Inkubieren Sie 1 Stunde bei Zimmertemperatur zum Blocken.
    7. Entfernen Sie den BSA und fügen Sie 50 μL des verdünnten primären Antikörpers hinzu (ergänzende Tabelle 1), um die LGECs abzudecken. Inkubiere bei 4 °C für 16–18 Stunden.
    8. Entfernen Sie den primären Antikörper und wiederholen Sie Schritt 8.1.5.
    9. Fügen Sie jedem Bohrloch 50 μL fluoreszierenden sekundären Antikörper hinzu, um die LGECs zu bedecken. Inkubiere bei Zimmertemperatur im Dunkeln für 1 Stunde.
    10. Wiederholen Sie Schritt 8.1.5, vermeiden Sie Lichteinwirkung.
    11. Fügen Sie 50 μL 4',6-Diamidino-2-Phenylindol (DAPI)-Lösung hinzu, um die LGECs zu bedecken, und beobachten Sie die Färbung unter einem Fluoreszenzmikroskop.
  2. Für 3D-LGEC-Sphäroide
    1. Bereiten Sie die 3D-LGEC-Sphäroid-Tiefkühlschnitte wie in Schritt 4 beschrieben vor. Führen Sie die Immunfluoreszenzfärbung wie in den Schritten 8.1.2-8.1.11 beschrieben durch.

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Ergebnisse

Einrichtung eines serumfreien LGEC-Kultursystems mit 2C
Ziel dieses Protokolls war es, ein einfacheres und effizienteres Kultursystem zur Erweiterung der primären Maus-LGECs zu etablieren. Nach umfangreicher Screening wurde eine serumfreie 2C-Kombination, bestehend ausschließlich aus Y27632 und SB431542, erfolgreich entwickelt, was eine langfristige In-vitro-Expansion von LGECs ermöglichte. Nach der gemischten Enzymverdauung begannen primäre LGECs nach 3 Tage...

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Diskussion

Wie in der Einleitung beschrieben, wurden in den letzten Jahren mehrere serumfreie Kultursysteme für LG-Zellen entwickelt: 10,11,12,13. Viele dieser Methoden haben jedoch Einschränkungen, darunter schlechte Zellproliferation und die Unfähigkeit, eine großflächige Expansion in vitro10,11 zu erre...

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Offenlegungen

Die Autoren erklären keine konkurrierenden Interessen.

Danksagungen

Diese Arbeit wurde von der National Natural Science Foundation of China (82471048, 82271045) unterstützt; das Shenzhen Science and Technology Program (JCYJ20240813145510014); das Sonderprojekt Gesundheitsforschungstalente der Provinz Jilin (2023SCZ63, 2024SCZ53, 2025SCZ65); und das Projekt für den Wissenschafts- und Technologieentwicklungsplan der Provinz Jilin (YDZJ202601ZYTS389).

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
 -20 Grad; C Ultra-Niedrigtemperatur-KühlschrankHaier
 -80 °E°E; C Ultra-Niedrigtemperatur-KühlschrankHaier
0,25 % Trypsin-EDTAGibco25200056
1,5 mL Mikrozentrifugenröhre & nbsp;KirgenKG2211Rnasefrei
35 mm ZellkulturschüsselLABSELECT12111
4 & Grad; C-KühlschrankHaier
4 % Paraformaldehyd (PFA)ServicebioG1101
4',6-Diamidino-2-Phenylindol (DAPI)Yeasen708939ES03Lagern Sie bei -20 & Grad; C, Stock bei 1 mg/mL, 500x, verdünnen auf 1x mit 1x PBS
5 mL Zentrifugenröhre  ACMECAC17457
50 ml Zentrifugenröhre  LABSELECTCT-002-50-SS
Anti-Alpha-Aktin-Kanin-Antikörper mit glatter MuskulaturAbcamab5694Verdünnen Sie mit dem Antikörper-Verdünnungspuffer bei 1:100 & NBL;
Anti-AQP5-Kaninchenantikörper  ABklonalA9927Verdünnen Sie mit dem Antikörper-Verdünnungspuffer bei 1:100 & NBL;
Anti-Cytokeratin 14 KaninchenantikörperAbcamab181595Mit dem Antikörper-Verdünnungspuffer bei 1:200 verdünnen;
Anti-Zytokeratin 19  Kaninchen-AntikörperAbcamab52625Verdünnen Sie mit dem Antikörper-Verdünnungspuffer bei 1:400 & NBSP;
Anti-Ki67-KaninchenantikörperAbcamab16667Mit dem Antikörper-Verdünnungspuffer bei 1:200 verdünnen;
BiosicherheitsschrankSterilGARD
Rinderserumalbumin (BSA) Yeasen36101ES60Kaufen Sie bei 4&Deg; C
C57BL/6J-MäuseLabortierzentrum der Universität Xiamen
ZellkulturplatteLABSELECT1131224-Brunnen
ZellinkubatorEppendorf
ZentrifugeEppendorf
ChloroformHUSHI10006818VORSICHT, Durchführung von Operationen in einer Abzughaube
CO2  Inkubator bei konstanter TemperaturEppendorf
Kollagenase ARoche10103586001Lagern Sie bei -20 & Grad; C, auf 200 mg/mL, 100x
Definierte Trypsininhibitorlösung (DTI)GibcoR007100
DermaLife K Keratinocyte Medium Complete Kit (Serumfreies Medium) LebensaderLL-0007Kaufen Sie bei 4 & Deg; C
D-HanksBiosharpBL559A Verwendet zum Verdünnen von Dispase II
Dimethylsulfoxid (DMSO)SigmaD4540Verwendet zum Verdünnen von Y27632 und SB431542
Dispase IISigmaD4693Lagern Sie bei -20 & Grad; C, auf 200 mg/mL, 100x
DMEM Basic (1X)GibcoC11995500BT
Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L) hoch kreuzadsorbierter sekundärer Antikörper, Alexa Fluor 488InvitrogenA-21206Verdünnen Sie mit dem Antikörper-Verdünnungspuffer bei 1:300
Dulbeccos phosphatgepufferte Kochsalzlösung (DPBS)ServicebioG4200
Ethanol-AbsoluterHUSHI10009218VORSICHT, Verwenden Sie zur Herstellung anderer Ethanolverdünnungen 
Einfrieren des MikrotomsLeica
Hochgeschwindigkeits-NiedertemperaturmühleServicebio
Invertiertes FluoreszenzmikroskopLeica
Invertiertes MikroskopOlympus
Isopropanol HUSHI80109270
Laser-Scanning-Konfokalmikroskop FV3000OLYMPUS
Niedertemperatur-HochgeschwindigkeitszentrifugeEppendorf
LTF enzymgebundener Immunsorbent-Assay (ELISA) Kit ElabscienceE-MSEL-M0047Lagern Sie bei -20 & Grad; C
Matrixgel (Matrigel)82703MogengelAliquot und Lagerung bei -20 °F einkaufen; C
MikropipettorEppendorf
Mikroplatten-LeserThermo Fisher Scientific
Nukleasefreies WasserBiosharpBL510B
OCT-VerbindungScigen4586
PBS,1× (pH7,4)ServicebioG4202
PCR-VerstärkerBIO-RAD
Penicillin-StreptomycinBiosharpBL505A
Penicillin-Streptomycin-AmphotericinBiosharpBL142A
PerfectStart Green qPCR SuperMix-KitTransGen BiotechAQ601-01-V2Lagern Sie bei -20 & Grad; C
PerfectStart Uni RT& qPCR-KitTransGen BiotechAUQ-01Lagern Sie bei -20 & Grad; C
Pilocarpin AladdinP424663Lagern Sie bei -20 & Grad; C, 2500x
Primer AQP5  Sequenz:
Vorwärts:CATGAACCCAGCCCGATC
TT
Rückwärts:CTTCTGCTCCCATC
CC		Sangon Biotech
Primer K14  Sequenz:
Vorwärts:CCCACCTTTCATCTTCC
CAATT
Rückwärts: AAGCCTGAGCAGCATGTAGCAG		Sangon Biotech
Primer K15  Sequenz:
Vorwärts:GAGGTGGCGTCTAACACA
GA
Umkehr:TCTGAGCCTCCATCTCAC
AG		Sangon Biotech
Primer K19  Sequenz:
Vorwärts:ATTACTGCCCTGAGGAGC
CA
Rückwärts:TTCAGCTCCTCAATCCGA
GC		Sangon Biotech
Primer K5  Sequenz:
Vorwärts:CTCAGAGCTGAGGAACAT
GC
Rückwärts:AGCTCCGCATCAAAGAAC
AT		Sangon Biotech
Primer Ki67  Sequenz:
Vorwärts:ACCATCATTGACCGCTCC
TT
Rückwärts:TTGACCTTCCCCATCAGG
GT		Sangon Biotech
Primer LTF  Sequenz:
Vorwärts:CAGGAGCCAAAAATGTG
CC
Rückwärts:TTGTACTGGTCCCTTTCG
GC		Sangon Biotech
Primer P63  Sequenz:
Vorwärts:ATGTCACCGAGGTTGTG
AAA
Rückwärts: GAATTCAGTGCCAACCTGTG		Sangon Biotech
Primer SOX10  Sequenz:
Vorwärts:ATCAGCCACGAGGTAATG
TCCAAC
Rückwärts:ACTGCCCAGCCCGTAGCC		Sangon Biotech
Primer α-SMA  Sequenz:
Vorwärts:CTCCCTGGAGAAGAGCTA
CG
Rückwärts:CGCTGACTCCATCCCAAT
GA		Sangon Biotech
Echtzeit-Fluoreszenz-quantitatives PCR-InstrumentRoche
RNA-Isolater Total-RNA-ExtraktionsreagenzVazymeR401-01VORSICHT, Durchführung von Operationen in einer Abzughaube
SB431542 ApexbioA8249Lagern Sie bei -20 & Grad; C, Serienzustand bei 20 mM, 2000x
Spektrophotometer NanoDrop 1000Thermo Fisher ScientificRNA-Konzentration messen
SucroseMacklinS818046Mit destilliertem Wasser auflösen
Triton X-100SolarbioT8200
Ultrareines WasseraufbereitungssystemMillipore
Universeller Antikörper-VerdünnungspufferEpizymPS119Kaufen Sie bei 4 & Deg; C
Y27632 ApexbioB1293Lagern Sie bei -20 & Grad; C, Serienzustand bei 20 mM, 2000x

Referenzen

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