Methodenartikel

Bewertung der Stoffwechselaktivität ganzer regenerierender Zebrafischventrikel ex vivo mittels eines extrazellulären Flusstests

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DOI:

10.3791/70459

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17. April 2026

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1Department of Physiology, Anatomy and Genetics, University of Oxford, 2Institute of Developmental and Regenerative Medicine, University of Oxford, 3King Faisal Specialist Hospital & Research Centre, 4Department of Chemistry, University of Oxford

In diesem Artikel

Zusammenfassung

In diesem Artikel beschreiben wir ein detailliertes Protokoll zur Quantifizierung der Sauerstoffverbrauchsrate und der extrazellulären Versauerungsrate der ex-vivo erwachsenen Zebrafischventrikel, um deren oxidative und glykolytische Stoffwechselkapazität zu charakterisieren.

Zusammenfassung

Die Fähigkeit der Zebrafische, ihr Herz im Erwachsenenalter zu regenerieren, wird teilweise auf Stoffwechselanpassungen zurückgeführt. Obwohl angenommen wurde, dass das Fischherz stark von der Glykolyse abhängig ist, haben neuere Studien ein komplexeres Stoffwechselprofil aufgedeckt, bei dem der oxidative Stoffwechsel als wesentlicher Bestandteil der Kardiomyozyten-Redifferenzierung und einer erfolgreichen späten Herzregeneration entsteht. Im Jahr 2025 haben wir eine Hochdurchsatzmethode entwickelt, um das Stoffwechselprofil ganzer Zebrafischventrikel ex vivo zu bewerten, mithilfe des Seahorse-Tests (extrazellulärer Flussassay). Diese Methode ermöglicht eine schnelle, Echtzeit-Bewertung der basalen und maximalen Sauerstoffverbrauchsrate (OCR) sowie der extrazellulären Versauerungsrate (ECAR) mittels des XF Mito Stresstests auf dem Seahorse XFe24-Analysator. In diesem Artikel beschreiben wir ein detailliertes Protokoll zur Durchführung der extrazellulären Flussanalyse an ganzen Zebrafischventrikeln. Die Fähigkeit, OCR und ECAR in lebenden Ganzherzen ex vivo zu quantifizieren, bietet die Möglichkeit, den Herzstoffwechsel zu kritischen Zeitpunkten während der Entwicklung, des Krankheitsverlaufs und der Regeneration zu klären.

Einleitung

Im Gegensatz zum Menschen behalten Zebrafische (Danio rerio) die Fähigkeit, verlorenes Herzgewebe während ihres gesamtenErwachsenenlebens zu regenerieren. Nach einer Herzverletzung dedifferenzieren die Kardiomyozyten in der Wundgrenzzone und treten wieder in den Zellzyklus 2,3 ein, um die Kardiomyozytenzahl4 wiederherzustellen und die Wunde neu zu besiedeln. Kürzlich wurde die Bedeutung der Kardiomyozyten-Redifferenzierung im regenerativen Prozess anerkannt5. Beide Prozesse werden durch metabolische Veränderungen im Zebrafischherzen streng reguliert, wobei die Glykolyse die Proliferation 6,7 und die oxidative Phosphorylierung (OXPHOS) die Redifferenzierung8 fördert. Obwohl pharmakologische und genetische Methoden zur Manipulation des Stoffwechsels im Bereich der Regeneration 6,7 weit verbreitet sind, bleibt die Validierung der metabolischen Effekte dieser Störungen aufgrund der geringen Größe des Zebrafischherzens schwierig, was eine komplexe, maßgeschneiderte Einrichtung für Kanulation 9,10,11 oder das Poolen mehrerer Herzen für Massenspektrometrie12 oder NMR-Spektroskopie8 erfordert. 13.

Um diese Einschränkungen zu umgehen, haben wir kürzlich den Einsatz des Seahorse XFe24 Analyzers für Hochdurchsatz-Metabolische Profilierung ganzer Zebrafischventrikel ex vivo8 beschrieben. Der extrazelluläre Flusstest ist darauf ausgelegt, die Sauerstoffverbrauchsrate (OCR) und die extrazelluläre Versauerungsrate (ECAR) von Zellen, Bauchspeicheldrüseninseln und Sphäroiden zu messen. Dies wird durch Festkörpersensoren erreicht, die Veränderungen der Sauerstoff- und Protonenkonzentration (pH) in den Medien erkennen, die durch die Nutzung von Sauerstoff und der glykolyseabhängigen Laktatproduktion durch die respiratorische Elektronentransportkette entstehen (Abbildung 1A)14.

Die extrazelluläre Flussanalyse kann auf einem 96-Well-Plattenaufbau (XFe96 und XF Pro), 8-Well-Miniplatten oder verschiedenen Iterationen von 24-Well-Platten (XFe24) durchgeführt werden. Obwohl die 96-Well-Platten einen höheren Durchsatz bieten, ist der Arbeitsabstand zwischen dem Sensor und dem Brunnenboden nicht geeignet, um einen ganzen Zebrafischventrikel aufzunehmen. Außerdem gibt es beim 96-Well-Plattenformat keine Möglichkeit, den Ventrikel am Boden des Lochs zu sichern, um zu verhindern, dass er im Medium schwebt und die Sensoren stört. Die XFe24-Inselfang-Mikroplatte hingegen wurde ursprünglich für die metabolische Charakterisierung primärer Pankreasinselchen entwickelt und ermöglicht dadurch die Ablagerung des Gewebes am Boden des Brunnens, die dann durch ein Raster gesichert wird. Aufgrund der geringen Größe des Zebrafischherzens konnten wir die Mikroplatte für die Inselfang-Mikroplatte an Zebrafischventrikel anpassen, die während des gesamten Tests unter dem Gitter gesichert bleiben.

Zur Bewertung der mitochondrialen Atemkapazität verwendeten wir den Mito-Stresstest, bei dem vier Inhibitoren der Elektronentransportkette und die Adenosintriphosphat-(ATP)-Synthase verwendet wurden (Abbildung 1A). Zunächst werden Basismessungen der OCR erfasst (Abbildung 1B, Magenta). Anschließend wird Oligomycin, ein Komplex-V-Inhibitor, injiziert. Oligomycin hemmt die ATP-Synthaseaktivität und führt somit zu einer Verringerung des OCR, was auf die ATP-Produktion zurückzuführen ist (Abbildung 1B, grün). Der verbleibende Sauerstoffverbrauch ist das Ergebnis der ungekoppelten Atmung und des nicht-mitochondrialen Sauerstoffverbrauchs (Abbildung 1B, orange bzw. grau)15. Nach Oligomycin wird FCCP injiziert, wodurch der Protonengradient über die mitochondriale Membran verteilt wird (Abbildung 1A). Um den Protonengradienten wiederherzustellen, erhöhen die Mitochondrien ihren Sauerstoffverbrauch auf ihre maximale Kapazität (Abbildung 1B, blau). Schließlich wird eine Mischung aus Rotenon und Antimycin A verwendet, die die Komplexe I bzw. III hemmt (Abbildung 1A). Diese Medikamentenkombination führt zum vollständigen Stillstand der mitochondrialen respiratorischen Elektronentransportkette, da der Elektronenfluss von den Komplexen I und III zu Komplex IV15 fehlt. Dies ermöglicht die Messung des Sauerstoffverbrauchs außerhalb der Mitochondrien (Abbildung 1B, grau).

Insgesamt konnten wir mithilfe der Islet-Capture-Mikroplatte mit dem Mito-Stresstest schnell und reproduzierbar die oxidative und glykolytische Stoffwechselkapazität ganzer Zebrafischventrikel ex vivo bewerten. Wir beschreiben das detaillierte Protokoll für dieses Verfahren im Folgenden. Abschließend zeigen wir das Überleben unverletzter, wildtypischer isolierter Ventrikel ex vivo im extrazellulären Flussanalysator und validieren den Mito-Stresstest an 14 Tagen nach der Kryoschädigung (DPCI) transgenen Zebrafischventrikel8.

Protokoll

Alle unten beschriebenen Verfahren, die Tiere betreffen, wurden in Übereinstimmung mit dem überarbeiteten Animals (Scientific Procedures) Act 1986 im Vereinigten Königreich und der Richtlinie 2010/63/EU in Europa durchgeführt und vom Zentralkomitee für Tierpflege und ethische Überprüfung der Universität Oxford genehmigt.

HINWEIS: Dieses Protokoll wurde mit einem Seahorse XFe24-Analysator und dem Seahorse DMEM-Medium ohne Phenolrot und Bicarbonat durchgeführt.

1. Zebrafisch-Herzkryoverletzung (optional)

  1. Holen Sie vor Beginn des Experiments die entsprechende ethische Genehmigung von der örtlichen Institution und den nationalen Behörden ein.
  2. Führen Sie Kryoverletzung an den Herzen der Zebrafische wie zuvor beschriebendurch 16,17,18.

2. Befeuchtung der Sensorpatrone

  1. Öffnen Sie das extrazelluläre Flussassay-Set und laden Sie die 24-Bohrloch-Versorgungsplatte (Abbildung 2A), indem Sie pro Bohrloch 500 μL der Kaliberlösung pipettieren.
  2. Schließen Sie die Versorgungsplatte mit der Sensorpatrone und dem Hydro-Booster (Abbildung 2A).
  3. Inkubieren Sie die Kartusche und die Versorgungsplatte in einem befeuchteten Inkubator bei 37 °C über Nacht (18–72 H). Behalte den Deckel während der gesamten Inkubation auf der Sensorkartusche.

3. Vorbereitung der Arzneimittellösungen und Medien

  1. Lagerlösungen der Arzneimittel herzustellen: Lösen Sie das Oligomycin in Dimethylsulfoxid (DMSO) auf eine Konzentration von 10 mM, das Carbonylcyanid 4-(Trifluoromethoxy)phenylhydrazon (FCCP) in DMSO auf eine Konzentration von 5 mM, das Rotenon in DMSO auf eine Konzentration von 10 mM und das Antimycin A in Ethanol auf eine Konzentration von 10 mM und lagern Sie es bei -20 °C, wenn es nicht sofort verwendet wird.
    HINWEIS: Die Herstellung frischer Oligomycin-, Rotenon- und Antimycinlösungen alle 2–3 Monate sowie jede FCCP-Lösung vor dem Assay wird empfohlen.
  2. Bereite die Arbeitskonzentration der Medikamente (500 μM Oligomycin, 300 μM FCCP, je 450 μM Rotenon/Antimycin-A-Mischung) durch Verdünnung der Grundlösung in DMEM-Medien vor. Stellen Sie sicher, dass das Endvolumen für die Arbeitskonzentrationen 1,5 mL für Oligomycin, 1,65 mL für FCCP und 1,8 mL für Rotenon/Antimycin A beträgt, sodass 30 Ports geladen werden können (24 Ports pro Inhibitor auf der Kartusche plus 6 zusätzliche Ports pro Medikament zur Korrektur von Pipettierungsfehlern).
    HINWEIS: Im Rotenon/Antimycin A wird etwas Niederschlag erscheinen, aber nach gutem Mischen wird dies minimiert. Beachten Sie, dass die in 3.2 genannten Konzentrationen zehnmal so hoch sind wie die Endkonzentration der Medikamente, wenn sie in die Brunnen injiziert werden.
  3. Bereiten Sie das DMEM-Medium (pH 7,4) so vor, dass es 10 mM Glukose, 1 mM Pyruvat und 2 mM Glutamin enthält, und lagern Sie es bis zur Anwendung bei -20 °C.

4. Einschalten des extrazellulären Flussanalysators

  1. Schalten Sie den Analysator über Nacht vor dem Assay vom Seitenknopf ein, um die Temperatur mit der Umgebung auszugleichen.
  2. Schalte den Computer ein und öffne die Wave-Software.
  3. Wähle den Mito-Stresstest in der Software aus.
  4. Schalten Sie die Heizung in der unteren linken Ecke der Software aus, sodass die Temperatur im Analysator unter 37 °C fällt und 28–29 °C erreicht, um sich der Standardtemperatur der Zebrafischzucht19 zu nähern.
  5. Stellen Sie die Injektionsstrategie auf der Seite Gruppendefinitionen (unter dem Reiter Injektionsstrategien ) fest, indem Sie die Verbindungen hinzufügen, die in jedem Port deponiert werden, aus dem Verbindungskatalog. Für den Mito-Stresstest füge Oligomycin in Port A, FCCP in Port B und Rotenon/Antimycin in Port C hinzu. Es gibt Kapazitäten für die Hinzufügung eines weiteren Medikaments in Port D, das in diesem Protokoll nicht verwendet wird.
  6. Löschen Sie alle anderen vorgefertigten Strategien, die unter dem Tab Injektionsstrategien existieren, sobald die experimentelle Strategie definiert ist. Gib die experimentellen Gruppen (z. B. Wildtyp und Mutant) auf der Gruppenseite der Seite an und gib die Injektionsstrategie an, die sie erhalten werden (die in Schritt 4.5 definiert). Stellen Sie sicher, dass die Injektionsstrategien zwischen den Gruppen übereinstimmen und die entwickelte Injektionsstrategie übereinstimmen.
  7. Auf der Plattenkartenseite geben Sie die Position jeder Probe auf der 24-Well-Platte an, indem Sie auf jede Gruppe klicken und dann auf die Bohrlöcher klicken, die die Proben enthalten werden.
    1. Beachten Sie, dass vier der Bohrungen nicht für die Probenablagerung geeignet sind (Abbildung 2B) und als Rohlinge dienen, die zur Hintergrundkorrektur verwendet werden. Stellen Sie sicher, dass die Proben jeder Gruppe gleichmäßig über die Platte verteilt sind, um potenzielle Positionsverspannungen bei Messungen oder Umweltbedingungen auszugleichen.
  8. Auf der Protokollseite entfernen Sie den Kontroll- oder Experimentellen-Tab , falls kein zusätzlicher Inhibitor verwendet wird, und stellen Sie sicher, dass die Softwareports mit den Positionen der Medikamente auf der Kartusche übereinstimmen.
  9. Die Software legt automatisch 3 Zyklen aus Mischen, Warten und Messen pro Bedingung ein. Ändern Sie die Anzahl der Zyklen auf 10 Baseline-Messungen (unbehandelt), 3 Oligomycin-, 7 FCCP- und 9 Rotenon/Antimycin-A-Messungen, um stabile Spuren zu ermöglichen und die Inhibitoren auf das 3D-Gewebe wirken zu lassen. Stelle sicher, dass jeder Zyklus aus 3 Minuten Mischen, 2 Minuten Wartezeit und 3 Minuten Messung besteht.

5. Kalibrierung des Analysators

  1. Entfernen Sie die Kartusche und die Versorgungsplatte aus dem befeuchteten Inkubator (siehe Schritte 2.1–2.3).
  2. Entferne den Hydro-Booster und den Deckel (Abbildung 2A) von der Kartusche und lege die Sensorkartusche auf die Versorgungsplatte mit dem Kaliber.
  3. Pipettieren Sie die Inhibitoren vorsichtig in ihre jeweiligen Kanäle, während Sie die Seitenwand des Ports mit der Pipettenspitze berühren, um einen gleichmäßigen Flüssigkeitsfluss zu gewährleisten: 50 μL Oligomycin in Port A, 55 μL FCCP in Port B und 60 μL Rotenon/Antimycin A in Port C (Abbildung 2C).
    1. Beachten Sie, dass die Flüssigkeit nur durch die Oberflächenspannung am Loch des Ports gehalten wird, daher sollten Sie ab diesem Schritt abruptes Pipettern oder das Abkleben der Kartusche vermeiden. Stellen Sie sicher, dass keine Flüssigkeit in den Sensorport gelangt (Abbildung 2C), da dies den Analysator beschädigen würde.
  4. Klicke auf Start Run in der Software, benennen Sie den Run und speichern Sie ihn am Computer. An diesem Punkt öffnet sich das Fach des Analysators, um die Kartusche und die Versorgungsplatte einzusetzen.
  5. Legen Sie die mit den Medikamenten geladene Patrone und die Sicherungsplatte mit dem Kaliber gemäß der Plattenkarte auf das Analysefach (A1-Schacht oben links) und stellen Sie sicher, dass es richtig passt. Entferne den Hydrantenverstärker und den Deckel (Abbildung 2A) von der Platte, bevor du ihn auf das Tablett legst. Macht man dies nicht, wird der Analysator beschädigt.
  6. Sobald es bereit ist, weist man die Software an, den Test zu starten, indem man auf den Lauf-Test drückt. An diesem Punkt nimmt der Analysator das geladene Tablett auf und beginnt die Kalibrierung.
  7. Beginnen Sie mit der Herzisolation (siehe Schritte 6.1–6.12). Die Kalibrierung dauert etwa 40 Minuten, aber die Platte kann so lange im Analysator verbleiben, wie nötig ist, um die Herzen zu isolieren und in die Insel-Fang-Mikroplatte zu legen (Abbildung 2B,D).

6. Isolierung der Fischherzen und Verladen auf die 24-Well-Inselplatte

  1. Öffnen Sie die Inselaufnahme-Mikroplatte und laden Sie die 24-Well-Inselplatte bei Raumtemperatur mit 500 μL DMEM (10 mM Glukose, 1 mM Pyruvat, 2 mM Glutamin) auf.
  2. Legen Sie alle Gitter in eine 35-mm-Petrischale mit DMEM-Medien bei Raumtemperatur, um sicherzustellen, dass sie vollständig eingetaucht und frei von großen Blasen sind.
  3. Bereiten Sie eine zusätzliche 35 mm Petrischale mit DMEM (10 mM Glukose, 1 mM Pyruvat, 2 mM Glutamin) bei Raumtemperatur vor. Dies dient dazu, die Herzen beim Sammeln auszuspülen und den Ventrikel von den Vorhöfen und der arteriosus bulbus zu sezieren.
  4. Töten Sie einen Fisch in 5 g/L MS-222 und prüfen Sie das Fehlen von Reflexen.
  5. Legen Sie den Fisch auf einen Schwamm, der an einer 92-mm-Petrischale befestigt ist, öffnen Sie die Herzhöhle und sezieren Sie das Herz wie zuvor beschrieben16,20.
  6. Spülen Sie die Herzen in der 35-mm-Petrischale mit DMEM (10 mM Glukose, 1 mM Pyruvat, 2 mM Glutamin) bei Raumtemperatur.
  7. Entfernen Sie das Atrium und den arteriosus bulbus mit der Pinzette in der 35 mm Petrischale.
  8. Schüttle und drücke sanft die Herzkammer, damit das Blut aus ihrem Lumen abfließt. Beschädigen Sie die Ventrikelwand beim Waschen des Herzens nicht.
  9. Übertragen Sie das Herz in den vorgesehenen Brunnen auf der Inselaufnahme-Mikroplatte und lassen Sie es gemäß der Plattenkarte in die Mitte des entsprechenden Brunnens sinken. Halten Sie den Teller bei Zimmertemperatur. Beziehen Sie alle Herzkammern in den Test ein, auch wenn sie sichtbar nicht mehr schlagen.
  10. Wiederholen Sie den Vorgang für alle verfügbaren Fische. Wenn man die Stoffwechselaktivität verschiedener experimenteller Gruppen vergleicht, empfehlen wir, ein Herz pro Gruppe zu isolieren, anstatt alle Herzen aus einer Gruppe, bevor man zur nächsten übergeht. Obwohl die Herzen im Analysator mindestens 180 Minuten überleben können (Abbildung 3A), schlagen wir vor, dass die Isolation jeweils ein Herz pro Gruppe erfolgt, um eine gleichmäßige Zeitverteilung im Medium zwischen den Gruppen sicherzustellen.
  11. Sobald alle Herzen isoliert sind (ca. 60 Minuten für eine Platte mit 20 Herzen), legen Sie sie am Boden der Mikroplatten-Insel-Erfassungsbohrungen (Abbildung 2B) und positionieren sie mit dünner Zange in der Mitte des Brunnens (Abbildung 2D,E).
  12. Benutze eine Pinzette, um sie mit dem Raster abzudecken (etwa 20 Minuten) (Abbildung 2D). Achten Sie darauf, dass das Gitter in der richtigen Ausrichtung ist (Netz nach unten zum Herzen hin) und keine großen Blasen enthält, da dies die Messungen stören könnte (Abbildung 2E).
    1. Sobald das Gitter in Position ist, benutze die Pinzette, um es von den Rändern an Ort und Stelle zu schieben, bis ein leises Klicken zu hören ist. Achte darauf, das Herz nicht mit der Pinzette durch das Gitter zu rammen.

7. Laden der Proben auf den Analysator und Erfassung von Messungen

  1. Sobald die Herzen in der Inselerfassungs-Mikroplatte eingeschlossen sind, überprüfen Sie in der Software, ob alle Brunnen erfolgreich kalibriert wurden, wie die grünen Häkchen auf dem Computerbildschirm zeigen. Jetzt wirf die Versorgungsplatte aus, indem du auf das offene Tablett drückst.
    HINWEIS: Die Patrone wird zu diesem Zeitpunkt nicht ausgeworfen, und nur die Versorgungsplatte mit dem Kalibranten wird angezeigt.
  2. Tauschen Sie die Utility-Platte gegen die Mikroplatte der Insel, die die Proben auf dem Analysator-Tablett enthält. Stellen Sie sicher, dass die Mikroplatte der Insel korrekt positioniert ist (A1 oben links) und dass der Deckel entfernt wurde. Wenn der Deckel nicht entfernt wird, wird der Analysator beschädigt.
  3. Sobald die Inselplatte positioniert ist, weist die Software an, das Experiment durch Drücken der Lastzellenplatte zu starten. Während der ersten 10 Minuten führen die Sensoren einen Gleichgewichtsschritt durch, und dann beginnen die Messungen.
  4. Sobald das Experiment abgeschlossen ist (ca. 4 Stunden), drücken Sie die Auswurfpatrone , damit sich das Tray öffnet und die Mikroplatte und die Kartusche des Insels ausgeworfen werden.
  5. Entfernen Sie die Mikroplatte und die Kartusche der Insel und drücken Sie fertig , damit das Tablett geschlossen ist. An dieser Stelle drücken Sie die Ergebnisse an, um die gesammelten Daten zu sehen.
  6. Speichere die Messungen, exportiere sie vom Analysator-Computer und lade sie zur weiteren Analyse und Verarbeitung über die Analyseoberfläche hoch. Dies löst die Exzision der Inselplatte und der Kartusche aus dem Analysator aus.
  7. Entferne die Inselplatte und die Kartusche vom Analysator und schließe die Kartusche mit dem Deckel.
  8. Die Inselplatte auf Trockeneis einfrieren oder die Herzen aus den Brunnen entfernen (siehe Schritt 8.2) und bei -20 °C lagern, falls die Proteinisolation zur Normalisierung (Schritt 8) nicht sofort durchgeführt wird.
  9. Sobald die Daten gespeichert sind, schalten Sie die Software, den Analysator und den Computer aus.
  10. Laden Sie die Daten über die Analyseoberfläche hoch und visualisieren Sie sie, indem Sie den OCR-Graphen aus der Standardansichtsoption auswählen. Auf der Schnittstelle betrachten Sie die Daten als OCR- und ECAR-Niveau oder -Rate, korrigieren Sie den Hintergrund basierend auf den leeren Bohrlöchern und wählen Sie die Bohrlöcher zum Visualisieren aus, indem Sie auf die Plattenkarte klicken, um sie erscheinen oder verschwinden zu lassen.

8. Proteinisolation und Quantifizierung zur Normalisierung

  1. Bereiten Sie einen proteaseinhibitorhaltigen Radioimmunpräzipitations-Puffer (RIPA) vor, indem Sie eine Proteaseinhibitor-Tablette in 10 ml RIPA-Puffer auflösen und gut mischen.
  2. Falls noch nicht erledigt (Schritt 7.8), entferne mit dem Islet-Capture-Bildschirmeinführungstool (Abbildung 2F) die Gitter von der Inselplatte, um die Herzen freizugeben. Entferne die Herzen vorsichtig, da sie am Raster hängen könnten. Wenn das der Fall ist, benutze die Pinzette, um sie zu lösen. Wenn das Gitter mit dem Siebeinsatzwerkzeug nicht entfernt werden kann, wird die Platte unter das Stereoskop gelegt und mit einer Mikrodissektionsschere vorsichtig das Gitter geschnitten, um das Herz freizugeben.
  3. Jeden Ventrikel in ein 1,5-ml-Rohr mit 200 μL RIPA-Puffer einbauen, angereichert mit Proteaseinhibitor auf Eis.
  4. Homogenisiere das Herz mit einem Homogenisator und Einwegstößeln auf Eis.
  5. Bereite die Standards vor, indem das bereitgestellte Rinderserumalbumin (BSA) im RIPA-Puffer in folgenden Konzentrationen verdünnt wird: 2000 μg/mL, 1500 μg/mL, 1000 μg/mL, 750 μg/mL, 500 μg/mL, 250 μg/mL, 125 μg/mL, 25 μg/mL, 0 μg/mL.
  6. Bereiten Sie die Pierce BCA-Arbeitslösung vor (50:1, Reagenz A: Reagenz B, gemäß den Anweisungen des Herstellers). Berechnen Sie das benötigte Volumen des Arbeitsreagens mit folgender Formel:
    (Anzahl der Standards + Anzahl der Proben) × 2 × 200 μL
    HINWEIS: Dieses Volumen ermöglicht die Verwendung von 200 μL Arbeitslösung pro Probe und Standard und ermöglicht die Erfassung doppelter Messungen pro Probe und Standard.
  7. In einer 96-Well-Platte fügen Sie 25 μL von jedem Standard und jede Probe pro Bohrung in Duplikaten hinzu.
  8. Fügen Sie pro Bohrloch 200 μL der Arbeitslösung hinzu.
  9. Den Teller bei 37 °C 30 Minuten inkubieren.
  10. Lassen Sie die Platte 10 Minuten auf Zimmertemperatur abkühlen und versiegeln Sie sie mit einem Plattenversiegelungsmittel. Achten Sie darauf, dass keine Blasen in den Bohrlöchern sind, da dies den Kennzeichenleser blockieren könnte. Wenn sich nur eine begrenzte Anzahl von Blasen bildet, benutze eine Spitze oder die dünne Pinzette, um sie zum Platzen zu bringen.
  11. Messen Sie die Absorption bei 562 nm mit einem Plattenleser.
  12. Erstellen Sie eine Standardkurve basierend auf der Absorption der Standards und berechnen Sie die Proteinkonzentration der Proben.
  13. Protokollieren Sie die Proteinkonzentration im Normalisierungstab (Abbildung 2G) der Analytikschnittstelle für jedes Bohrloch.

9. Datenanalyse

  1. Nach der Normalisierung mit dem Proteingehalt exportieren Sie die Daten aus der Analyseoberfläche als Excel- oder Prism-Dateien zur weiteren Analyse mit dem Cloud-Button oben rechts im Diagramm.
  2. Mit den normalisierten Daten berechnet man die Basis-OCR und ECAR als Mittelwert der Basismessungen, ohne die ersten drei Aufnahmen, da das Signal bei den ersten Messungen instabil sein könnte.
  3. Mit den normalisierten Daten berechnet man zur Festlegung des maximalen OCR und ECAR die durchschnittlichen Messungen der drei wichtigsten Erwerbungen der FCCP-Behandlung.

Ergebnisse

Dieses Protokoll ermöglicht die Quantifizierung von OCR und ECAR ganzer Zebrafischventrikel. Wir validierten die Überlebensfähigkeit der Ventrikel in einer ex vivo Umgebung, indem wir unverletzte Wildtyp-KCL-Ventrikel im Analyzer ohne jegliche medikamentöse Behandlung inkubierten (Abbildung 3A). Die Daten zeigen, dass die Ventrikel eine stabile OCR und ECAR aufweisen, die für mindestens 180 Minuten deutlich höher sind als die Basismessungen der leeren Bohrlöcher (Abbildung 3A). Diese Daten deuten darauf hin, dass die Ventrikel eine normale Atemfunktion und Überlebensfähigkeit in diesem ex vivo Setting zeigen.

Wir führten mehrere OCR-Messungen mit unterschiedlichen Arzneimittelkonzentrationen und Medienformulierungen durch, um die optimale Dosierung für die Ventrikel zu bestimmen (Abbildung 3B). Wir beobachteten einen leichten Anstieg der OCR-Faltenänderung (FCCP/basal) bei Verwendung der Kombinationen [Oligomycin] 10 μM, [FCCP] 8 μM und [Rotenon/Antimycin] 25 μM, sowie einen leicht größeren Anstieg von [Oligomycin] 50 μM, [FCCP] 30 μM und [Rotenon/Antimycin] 45 μM (Abbildung 3B). Daher haben wir für unsere Experimente mit letzteren Konzentrationen übergegangen. Da der Ventrikel eine 3D-Struktur ist, ist es möglich, dass die Medikamente stark auf die äußeren Zellen des Gewebes wirken, ohne die Zellen auf der luminalen Seite des Ventrikels zu erreichen. Um dies zu beheben, führten wir einen Permeabilisierungsschritt durch, bei dem wir die Herzen mit Saponin 0,5 % für 30 Minuten vor der Inkubation in DMEM (10 mM Galactose, 1 mM Pyruvat, 4 mM Glutamin) behandelten. Dies führte zu einer anhaltenden Reduktion des OCR und zum Ausbleiben des erwarteten Anstiegs nach der FCCP-Injektion (Abbildung 3C), was darauf hindeutet, dass die Herzen metabolisch versagten. Folglich haben wir die Ventrikel für unsere Experimente nicht permeabilisiert.

Außerdem präsentieren wir hier die normalisierten Spuren aus unserem ursprünglichen Experiment8. Indem wir die natürliche Variation des regenerativen Potenzials von sieben Wildtyp-Zebrafischstämmen nutzten, identifizierten wir mdh1ab, die zytosolische Malatdehydrogenase 1Ab, die eine positive Wirkung auf die Regeneration durch Kardiomyozyten-Redifferenzierung hat. Um diese Erkenntnis zu bestätigen, produzierten wir transgene Zebrafische, die mdh1ab auf kardiomyozytenspezifische Weise überexprimierten (mdh1ab cOE) und kontrollierten das grüne fluoreszierende Protein (GFP cOE). Wir haben ihre Ventrikel kryoinisiert, sie mit 14 dpci aufgenommen und ihren Stoffwechsel mit dem Mito-Stresstest untersucht (Abbildung 3D). Die Oligomycin-Behandlung veränderte die OCR nicht signifikant, obwohl ein leichter Anstieg des ECAR beobachtet wurde. Die Injektion von FCCP in die Medien führte zu einem erwarteten Anstieg von OCR und ECAR, wobei die mdh1ab cOE-Proben die höchste maximale Atemkapazität aufrechterhielten (Abbildung 3D). Schließlich führte Rotenon/Antimycin in beiden Gruppen zum vollständigen Stillstand des Stoffwechsels. Insgesamt ermöglichte uns diese Methode, signifikante Unterschiede in der metabolischen Kapazität der überexprimierenden Ventrikel und zwischen sieben verschiedenen Wildtyp-Zebrafischstämmenzu identifizieren.

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Abbildung 1: Glukosestoffwechsel während eines Mito-Stresstests. (A) Schematische Darstellung des Glukosestoffwechsels. Glukose gelangt über die GLUT-Transporter in die Zelle und wird durch Glykolyse in Pyruvat umgewandelt. Laktatdehydrogenase (LDH) wandelt Pyruvat in Laktat um, und die entstehenden Protonen werden aus der Zelle ausgeschieden. Pyruvat wird in Acetyl-CoA umgewandelt und gelangt in den Mitochondrien- und TCA-Zyklus, um die respiratorische Elektronentransportkette in der inneren mitochondrialen Membran zu betreiben. Die Inhibitoren der Komplexe I, III und V sowie der Entkoppler FCCP sind rot gekennzeichnet. Elektronen, die durch die respiratorische Elektronentransportkette übertragen werden, werden durch blaue Pfeile bezeichnet, die schließlich zur Umwandlung von Sauerstoff und Protonen in Wasser führen. (B) Mito-Stresstestergebnisse schematisch. Die basale Atmung wird in Magenta beobachtet. Bei der Oligomycin-Injektion sinkt die OCR, was die Berechnung der ATP-gebundenen Atmung (grün) sowie des Protonenlecks (orange) ermöglicht. FCCP erhöht die OCR auf die maximale Atemkapazität der Zellen (blau). Rotenon und Antimycin A-Injektionen führen zum Stillstand der mitochondrialen Atmung und ermöglichen nur nicht-mitochondriale Atmung (Grey). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.

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Abbildung 2: Mikroplatten-Layout der Sensorpatrone und der Inselerfassung. (A) Bild des Deckel-Sensor-Kartuschen-Hydro-Booster-Utility-Platten-Komplexes (oben) und der umgekehrten Sensorkartusche (unten). Schuppenbalken: 1 cm. (B) Bild einer Insel-Mikroplatte, die mit Zebrafischventrikeln beladen ist. Die roten Kreise kennzeichnen die leeren Brunnen, die keine Ventrikel enthalten, und dienen während der Analyse als Hintergrundkorrektur. Skalenbalken: 1 cm. (C) Schematische Darstellung des Portlayouts im XFe24-Sensormodul. Port A enthält Oligomycin, B enthält FCCP und C enthält die Rotenon/Antimycin-Mischung. Port D kann leer bleiben oder ein zusätzliches Medikament hinzugefügt werden. S bezeichnet den Sensoranschluss, der keine Flüssigkeit enthalten darf, um den Analysator nicht zu beschädigen. (D) Repräsentatives Bild eines Zebrafischventrikels am Boden des Brunnens, umschlossen vom Gitter (links) und ohne Gitter (rechts). Skalenbalken: 5 mm. (E) Schematischer Querschnitt der Mikroplatte der Inselaufnahme, die einen Ventrikel, das Gitter (gelb) und die Sensorkartusche (grün) enthält. P bezeichnet die Anschlüsse und S den Sensor. Die wellenförmige Linie steht für das Medium. (F) Das Insel-Capture-Bildschirm-Einführungstool. Skalenleiste: 1 cm. (G) Normalisierungs-Tab-Symbol auf der Analyseoberfläche. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.

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Abbildung 3: Repräsentative OCR- und ECAR-Messungen der Zebrafischventrikel. (A) Repräsentative OCR- und ECAR-Spuren unverletzter Wildtyp-Zebrafischventrikel (KCL-Stamm), die nicht mit den im Test verwendeten Inhibitoren behandelt wurden (n = 2, rote Linie). Die Spuren, die aus leeren Bohrlöchern entstehen, die kein biologisches Material enthalten, werden in Grau dargestellt (n = 4); OCR, zweiseitige wiederholte Messungen ANOVA, Zeitfaktor P = 0,0200, Zeit × Bohrlochinteraktion P = 0,0196, Bohrlochfaktor P < 0,0001, Gruppenfaktor P < 0,0001; ECAR zweiweg-wiederholte Messungen ANOVA, Zeitfaktor P = 0,1323, Zeit × Bohrlochinteraktion P = 0,0216, Bohrlochfaktor P = 0,0009, Gruppenfaktor P<0,0001; Die Daten werden als Mittelwert ± SEM dargestellt. (B) OCR-Faltungsänderung bei verschiedenen Arzneimittelkonzentrationen und verwendeten Medien. Einweg-ANOVA (P = 0,0032) mit Tukeys Mehrfachvergleichstest. [O] 5 μM, [F] 4 μM, [RA] 2 μM, n = 6; [O] 10 μM, [F] 8 μM, [RA] 25 μM, n = 8; [O] 25 μM, [F] 16 μM, [RA] 45 μM, n = 8; [O] 50 μM, [F] 30 μM, [RA] 45 μM, n = 8; [O] 100 μM, [F] 60 μM, [RA] 90 μM, n = 8. O, Oligomycin; F, FCCP; RA, Rotenon/Antimycin. (C) Spuren von saponin-permeabilisierten Ventrikeln (rot, n = 4) im Vergleich zu unbehandelten Ventrikeln (grau, n = 4); zweiseige wiederholte Messungen ANOVA, Zeitfaktor P < 0,0001, Zeit × Probeninteraktion P < 0,0001, Behandlungsfaktor P < 0,0001, Stichprobenfaktor P = 0,824; Daten präsentiert als Mittelwert ± SEM. OCR-Maximum der saponinbehandelten Ventrikel im Vergleich zu unbehandelten Ventrikeln; ungepaarter Schüler-T-Test (P = 0,0850). (D) Repräsentative OCR- und ECAR-Spuren von mdh1ab cOE (rot, n = 8) und GFP cOE (grau, n = 8) 14dpci Ventrikeln. OCR, zweiseitige wiederholte Messungen ANOVA, Zeitfaktor P < 0,0001, Zeit × Probeninteraktion P < 0,0001, Genotypfaktor P < 0,0001, Stichprobenfaktor P = 0,1098; ECAR, zweiseitige wiederholte Messungen ANOVA-Zeitfaktor P < 0,0001, Zeit × Probeninteraktion P = 0,7507, Stichprobenfaktor P = 0,2154, Genotypfaktor P < 0,0001. Daten adaptiert aus Lekkos et al., 20258 und als Mittelwert ± SEM dargestellt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.

Diskussion

Hier beschreiben wir ausführlich das Protokoll zur Analyse von OCR und ECAR der ex vivo Zebrafischventrikel mit dem Seahorse XFe24-Analysator und dem Mito-Stresstest. Der Stoffwechsel der Kardiomyozyten spielt eine wesentliche Rolle bei der Herzregeneration 21,22,23,24. Die Validierung des metabolischen Phänotyps des regenerierenden Zebrafischherzens war jedoch herausfordernd und fehlt in den Publikationen 6,7 häufig. Aufgrund der geringen Größe des Zebrafischherzens erfordern Techniken wie NMR-Spektroskopie oder Massenspektrometrie das Zusammenlegen mehrerer Herzkammern, um ein ausreichendes Signal 8,12,13 zu erhalten. Im Gegensatz dazu ermöglicht die hier beschriebene Methode die Erfassung von OCR- und ECAR-Messungen aus mehreren einzelnen Ventrikeln, wodurch die statistische Stärke erhöht wird.

Klassische metabolische Profilierungsmethoden, wie die Metabolomik, liefern einen Überblick über das metabolische Profil des Gewebes zum Zeitpunkt der Entnahme. Durch den Mito-Stresstest konnten wir Echtzeit-Live-Daten darüber sammeln, wie sich die Ventrikel an verschiedene metabolische Herausforderungen anpassen, einschließlich ihrer maximalen Atemkapazität, was bei anderen Methoden nicht offensichtlich ist. Um eine lebende Phänotypisierung der Zebrafischventrikel zu erreichen, wurde versucht, das Zebrafischherz zu perfusionieren. Dies erfordert komplexe, maßgeschneiderte Ausrüstung und hochqualifizierte Techniker, um die Kanulierung bei geringem Durchsatz zu erreichen. Der Analysator bietet eine einfachere Alternative mit einem kommerziell erhältlichen Gerät für die Hochdurchsatzphänotypisierung (20 Ventrikel gleichzeitig). Soweit wir wissen, gab es keinen direkten Vergleich der in diesem Artikel beschriebenen Methode mit anderen Techniken der Live-Oximetrie, wie einer Clark-Elektrode.

Wichtig ist, dass die von uns beschriebene Methode je nach Forschungsfrage anpassbar ist. Der Assay wurde bereits zuvor verwendet, um ganze Zebrafisch-Embryonenzu charakterisieren 25,26. Zusätzlich zum hier beschriebenen Mito-Stresstest wurde der Mito Fuel Flex Test optimiert, um die metabolische Kraftstoffnutzung menschlicher Herzschnittezu bewerten. Darüber hinaus wurde der Cell Energy Phenotype Test angepasst, um die glykolytische Kapazität der Regeneration von Astyanax mexicanus Herzen28 zu charakterisieren. Wir erwarten, dass dieses Protokoll für andere 3D-Strukturen wie kardiale Organoide verwendet wird und nützlich sein wird, um genetische Störungen der Stoffwechselwege in unverletzten Zebrafischherzen zu validieren.

Wir erkennen an, dass diese Technik gewisse Einschränkungen hat. Was technische Herausforderungen betrifft, wurden die Herzen nach der Isolierung in einem DMEM-Medium behandelt, das bei Raumtemperatur war und nicht bei 28 °C gehalten wurde, was die optimale Temperatur für Zebrafish19 ist. Die Senkung der Wassertemperatur auf 18 °C kann erhebliche Auswirkungen auf die Funktion des Zebrafischherzens in situ29,30 haben. Wir erwarten jedoch nicht, dass eine kurzfristige Exposition gegenüber Raumtemperatur einen signifikanten Einfluss auf die Physiologie der isolierten Ventrikel hat, da die Ventrikel schnell zum 28 °C-Analysator zurückkehren. In unseren Händen hörten die meisten Herzkammern bei der Dissektion des Vorhofs sichtbar auf zu schlagen, was auf das Fehlen eines Herzschrittmachers als Ursache der Nicht-Kontraktion hinweist. Außerdem war das Medium während der Isolationsphase nicht mit Sauerstoff versorgt, was möglicherweise zu einer leichten Hypoxie führte, die sich nach dem Mischen im Analysator vor der ersten Messung wieder auf normale Sauerstoffwerte erholt.

Ein weiterer praktischer Aspekt bezüglich der Herztemperatur betrifft auch das Ausschalten des Heizgeräts im Analysator, was zu einer Temperatursenkung von 37 °C auf 28–29 °C führt. Der Analysator erlaubt keine Reduzierung der Heizleistung auf die gewünschte Temperatur. Dennoch liegt die Temperatur im Inneren des Trays 6–7 °C höher als die Raumtemperatur, wenn der Analysator in Betrieb ist. Dieser Temperaturbereich fällt mit der optimalen Zebrafischhaltung19 zusammen.

Dieser Test wird an den Ventrikeln von Zebrafischen durchgeführt. Daher ist es unmöglich, die Beiträge einzelner Zelltypen zu den in OCR und ECAR beobachteten Veränderungen zu unterscheiden. Dies könnte sich als von erheblicher Bedeutung erweisen, wenn man die Stoffwechselraten früher regenerativer Zeitpunkte untersucht, an denen der hohe Zustrom von Immunzellen31 die OCR-Veränderungen der Kardiomyozyten überdecken könnte. Zusätzlich kann das verbliebene Blut im ventrikulären Lumen die Stoffwechselwerte beeinflussen. Die Blutung der Herzen in Gegenwart von Heparin7 könnte den Einfluss der Blutgerinnung im Herzen weiter verringern. Um die Diffusion der Inhibitoren zu den inneren Zellen des Ventrikels zu verbessern, versuchten wir zudem einen Permeabilisierungsschritt mit Saponin. Die Permeabilisierung von Saponin führte während des gesamten Tests zu einem anhaltenden Abfall der OCR, was zu Atemversagen führte. Diese Einschränkungen könnten durch die Isolierung, Kultur und Analyse isolierter Kardiomyozyten vermieden werden, obwohl dieser Ansatz eine längere Kultur von Zellen32 erfordert, die für eine regenerative Umgebung möglicherweise nicht optimal ist.

Das verletzte Gewebe könnte die verwendete Normalisierungsmethode beeinflussen. In dieser Studie normalisieren wir die OCR um μg-Protein/mL mit dem BCA-Test. Obwohl der BCA-Test aufgrund ihrer hydroxyprolin- und prolinreichen Zusammensetzung, die mit Coper schlecht nachgewiesen werden, nicht stark mit Kollagenproteinen reagiert, könnte das Vorhandensein anderer zellleerer Wundkomponenten die Normalisierung beeinflussen. Zukünftige Studien könnten die Verwendung von Total DNA33 als genaue Spiegelung lebender Zellen im Ventrikel betrachten.

Außerdem konnten wir die erwartete Reduktion der OCR, verursacht durch die oligomycinabhängige Hemmung des Komplexes V15, nicht reproduzieren. Obwohl bestimmte Studien eine Verringerung der OCR durch Oligomycin-Behandlung isolierter Kardiomyozytenzeigen 32,34,35, ähneln die hier vorhandenen Daten der fehlenden Antwort, die in einer aktuellen Studie an isolierten adulten Maus-Kardiomyozyten36 berichtet wurde. Da die von uns verwendete Oligomycinkonzentration signifikant höher ist als die in den oben genannten Studien berichtete, ist unklar, ob eine Erhöhung der Endkonzentration auf mehr als 50 μM eine Wirkung haben würde.

Obwohl der Sauerstoffverbrauch hauptsächlich von der Atmung abhängt, wird die extrazelluläre Versauerung nicht ausschließlich durch das durch die Glykolyse produzierte Laktat angetrieben, sondern auch durch die Umwandlung von Kohlendioxid in Kohlensäure. Es wurde berichtet, dass in glukosegespeisten Myoblasten ein Drittel der extrazellulären Versauerung unter Ausgangsbedingungen durch Kohlendioxid verursachtwird 37. Daher raten wir zur Vorsicht bei der Interpretation der ECAR-Messungen des Seahorse-Analysators, falls keine Korrektur für den Anteil der atmungsbedingten Versauerung durchgeführt wurde38.

Offenlegungen

Die Autoren erklären keinen Interessenkonflikt.

Danksagungen

Wir sind Nick Howe (Agilent Technologies) und Thomas Nicol (Universität Oxford) dankbar für ihre Unterstützung und kritische Diskussion während der Entwicklung dieser Methode. Wir möchten das Personal unserer Tiereinrichtung auf Level 1 (University of Oxford, Biomedical Services Unit) und des Institute of Developmental and Regenerative Medicine (University of Oxford) für die Pflege und Übertragung des Zebrafischs würdigen. Diese Arbeit wurde vom Medical Research Council (MR/W006731/1 an KL), dem King Faisal Specialist Hospital & Research Centre (Postdoktorandenstipendium an RA), dem Wellcome Institutional Strategic Support Fund (204826/Z/16/Z bis JSOM), der British Heart Foundation IBSRF (FS/17./58/33072 an LCH), dem Europäischen Forschungsrat (ERC) im Rahmen des Forschungs- und Innovationsprogramms Horizon 2020 der Europäischen Union (715895) unterstützt, CAVEHEART, ERC-2016-STG an MTMM), Projektzuschüsse der British Heart Foundation (PG/15/111/31939 und PG/23/11189 an MTMM), MTMM würdigt Unterstützung durch das BHF Oxford Centre of Research Excellence, University of Oxford (RE/24/130024) und das BHF Centre of Regenerative Medicine (RM/13/3/30159).

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
1,5 ml Eppendorf-Röhren StarlabS1615-5550
96-Well-Platten ThermoFisherAB-0800
Antimycin AChemCruz sc-202467A
DMEM-MediumAgilent1035755-100
DMSOSigma-Aldrich D2650-100mL
Trockeneis  
EthanolSupelco1.00983.2500
Extrazelluläres Flussassay Kit Agilent103518-100Pack enthält Utility-Platte, Hydro-Booster, Sensorkartusche, Deckel (wird mit den Inselplatten geliefert)
FCCPSigma-Aldrich C2920
GlukoseAgilent103577-100
GlutaminAgilent103579-100
Inkubator
Insel-Capture-MikroplatteAgilent101122-10025 Startfelder sind im Feld enthalten
Islet-Capture-Bildschirm-Inster-ToolAgilent101135-100
Mikrodissektionszangenideal-tek3131760Größe 5-S (2x werden benötigt, um den Ventrikel vom Bulbus arteriosus und dem Vorhof zu isolieren)
MikrodissektionsschereFST15009-08
MS-222Sigma-Aldrich E10521
OligomycinMP 151786
Schockelmottor-Homogenisierer VWR431-0100
StößelVWR431-0094
Petrischaal 35mmGreiner Bio-One627102
Petrischale 92mmStarstedt82.1473
Pierce BCA Assay KitThermowissenschaftlich23227
Pierce Protease und Phosphataseinhibitor Mini-Tabletten, frei von EDTAThermowissenschaftlichA32961
PyruvatAgilent103578-100
RIPA-LysepufferSanta-crusSC-364162
RotenonMP 02150154-CF
Seahorse Analytics Agilent InterphaseAgilenthttps://www.agilent.com/en/product/cell-analysis/real-time-cell-metabolic-analysis/xf-software/agilent-seahorse-analytics-787485
Seahorse XFe24 AnalysatorAgilenthttps://www.agilent.com/en/product/cell-analysis/real-time-cell-metabolic-analysis/xf-analyzers/seahorse-xfe24-analyzer-740878
VersiegelungThermowissenschaftlichAB-0558
SPECTROstar NanoMG LABTECH GmbH601-0298
SchwammMachen Sie einen Schnitt, der lang und tief genug ist, damit die Bauchseite des Fisches nach oben passt
Wave (Version 2.6.1.56)Agilenthttps://www.agilent.com/en/products/cell-analysis/software-download-for-wave-desktop
XF Kalibrant Agilent100840-000

Referenzen

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Herzregeneration beim Zebrab rblingSeahorse Assayoxidativer MetabolismusGlykolyseSauerstoffverbrauchrateextrazellul re Ans uerungsrateRedifferenzierung von KardiomyozytenHerzstoffwechsel
Bewertung der Stoffwechselaktivität ganzer regenerierender Zebrafischventrikel ex vivo mittels eines extrazellulären Flusstests
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