Verwendung von Lösungs-NMR zur Charakterisierung biomolekularer Kondensate unter biphasischen Bedingungen

Zusammenfassung

Hier präsentieren wir Protokolle für NMR-Methoden, REstricted DIFfusion von INvisible-Species (REDIFINE) und CONdensate DEtectioN mittels SEmi-solid Magnetization Transfer (CONDENSE-MT), die eine labelfreie, quantitative Charakterisierung biomolekularer Kondensate unter biphasischen Bedingungen ermöglichen, wodurch molekulare Partitionierung, Austauschdynamik, Kondensathydration und Tröpfchenstruktur ohne Sedimentation oder Markierung offenbart werden.

Zusammenfassung

Biomolekulare Kondensate, die durch Flüssig-Flüssig-Phasentrennung (LLPS) entstehen, organisieren die intrazelluläre Umgebung und regulieren verschiedene biochemische Prozesse. Trotz ihrer Bedeutung bleibt die Untersuchung der Kondensatzusammensetzung, der Austauschdynamik und der internen Organisation eine Herausforderung, insbesondere ohne externe Tags. Die Kernspinresonanzspektroskopie (NMR) kann ein einzigartiges, labelfreies Fenster in diese mesoskaligen Baugruppen bieten und sowohl molekulare Bewegung als auch Umweltheterogenität erfassen. Zwei komplementäre NMR-Methoden ermöglichen eine umfassende Charakterisierung von Kondensaten direkt in ihrem biphasischen Zustand. Für Kondensate, die dynamisch genug sind, um mit NMR beobachtbar zu sein, nutzt der Diffusionsaustauschansatz, REstricted DIffusion of INvisible speciEs, abgekürzt REDIFINE, den Diffusionskontrast mit chemischem Austausch, um den Anteil der Moleküle zu quantifizieren, die zwischen kondensierten und verdünnten Phasen aufgeteilt sind, Tröpfchengröße und Grenzflächenpermeabilität zu bestimmen und molekulare Austauschraten über die Phasengrenze hinweg zu extrahieren. Für starrere Kondensate, die NMR-unsichtbar sind, nutzt die wasser-detektierte halbfeste Magnetisierungs-Übertragungsmethode, CONdensate DEtectioN durch SEmi-feste Magnetisierungsübertragung, kurz CONDENSE-MT, den Relaxationskontrast und Protonenaustausch zwischen kondensierten Biomolekülen und verdünntem Phasenlösungsmittel, um Kondensate auf die Massenprotonen des Wassers zu überwachen und so Zugang zu relativer Partitionierung, molekularen Tumblingraten, Hydratationsdynamik und gebundenem Wassergehalt zu ermöglichen. Zusammen liefern diese Ansätze eine multidimensionale, quantitative Sicht der Kondensatstruktur und -dynamik unter nahezu natürlichen biphasischen Bedingungen ohne fluoreszierende oder Detektionsmarkierungen. Ihre Integration erweitert den NMR-Werkzeugkasten zur Untersuchung biomolekularer Phasentrennung und legt eine Grundlage für die Verbindung physikalisch-chemischer Eigenschaften von Kondensaten mit ihrer biologischen Funktion und pathologischer Fehlregulation.

Einleitung

Zellen erreichen ihre außergewöhnliche räumliche und zeitliche Organisation, indem sie biochemische Reaktionen kompartimentieren ^1,2,3. Neben membrangebundenen Organellen finden viele wichtige zelluläre Prozesse in membranlosen Kompartimenten statt, die durch Flüssig-Flüssig-Phasentrennung (LLPS) von Proteinen und Nukleinsäuren gebildet^{werden 4}. Diese dynamischen Assemblierungen, oft als biomolekulare Kondensate bezeichnet, umfassen den Nukleol, Stressgranulate, Kernspeckles und Prozesskörper, die eine wesentliche Rolle spielen, z. B. im RNA-Stoffwechsel, in der Transkriptionsregulation oder in der Signaltransduktion ^5,6. Ihre Fähigkeit, Komponenten als Reaktion auf Umweltsignale zu bilden, aufzulösen und auszutauschen, bietet den Zellen einen vielseitigen Mechanismus zur Organisation biochemischer Aktivitäten, ohne auf Lipidmembranen angewiesen zu sein.

Ein großer Teil biomolekularer Kondensate entsteht aus RNA-bindenden Proteinen (RBPs), die intrinsisch ungeordnete Regionen (IDRs) und RNA-bindende Domänen (RBDs^{) enthalten7,8}. Diese Proteine können entweder einzeln oder im Komplex mit RNA phasentrennen, wodurch Kondensate mit unterschiedlichen Materialeigenschaften und biologischen Funktionen entstehen. Zum Beispiel bildet das SARS-CoV-2-Nukleokapsidprotein (N) RNA-abhängige biomolekulare Kondensate⁹, die an der Verpackung und Assemblage des viralen Genoms beteiligt sind, während das Polypyrimidin-Traktbindungsprotein 1 (PTBP1) nukleare Kondensate bildet, die zur Gen-Silencing¹⁰ beitragen. Darüber hinaus durchlaufen Proteine wie FUS und DDX4 LLPS, die von ihren ungeordneten Regionen gesteuert werden, was den RNA-Stoffwechsel und die Stressgranulatbildung^{beeinflusst 11,12}. Die Dysregulation dieser Prozesse steht im Zusammenhang mit neurodegenerativen Erkrankungen wie amyotropher Lateralsklerose (ALS) und frontotemporaler Demenz, bei denen abweichende Phasenübergänge zu Aggregation und Funktionsverlust führen^{können 13}.

Die Kondensation beschränkt sich nicht auf Proteine und Protein-RNA-Komplexe. RNA allein kann LLPS durchlaufen, insbesondere im Zusammenhang mit wiederholten Expansionssequenzen, die mit mehreren neurodegenerativen Erkrankungen assoziiert^{sind 14,15}. Trinukleotid- und Hexanukleotid-Wiederholungsentwicklungen, wie CAG bei Huntington-Krankheit oder CUG bei myotonischer Dystrophie, können sowohl in vitro als auch in Zellen¹⁴ tropfenähnliche Kondensate bilden. Das Verständnis der physikalischen Grundlage der RNA-Kondensation sowie deren Unterschiede von protein- und protein-RNA-getriebenen Kondensaten ist entscheidend, um die molekularen Mechanismen hinter Wiederholungs-Expansionskrankheiten aufzuklären.

Trotz ihrer biologischen Bedeutung bleibt die quantitative und labelfreie Charakterisierung biomolekularer Kondensate eine gewaltige Herausforderung¹⁶. Konventionelle Fluoreszenzmikroskopie- und Spektroskopietechniken basieren auf externen Markierungen, die die Struktur, Dynamik oder Phasenverhalten von Biomolekülen beeinflussen können^17,18. Außerdem sind einige Kondensate aufgrund eingeschränkter molekularer Bewegung und breiter Linienformen NMR-unsichtbar, was die durch traditionelle NMR-Ansätze zugängliche Informationen einschränkt. Daher besteht ein dringender Bedarf an experimentellen Strategien, die Kondensate direkt in ihrem biphasischen, nativ-ähnlichen Zustand ohne Etikettierung untersuchen können. Angesichts der wichtigen Rolle der Tröpfchenphasengrenze in Austauschprozessen und der Kondensatreifung ist es ebenso wichtig, biomolekulare Tröpfchen innerhalb eines gegebenen Probenvolumens zu stabilisieren, um so die Sedimentation der dichten Phase zu verhindern. Dies kann leicht mit den zytoskelett-nachahmenden Agarose-Hydrogelen erreicht werden.

Jüngste Entwicklungen in NMR-basierten Methodologien bieten eine solche Lösung. Der REDIFINE (REstricted DIffusion of INvisible speciEs) Ansatz¹⁹ kombiniert Diffusions-NMR mit chemischer Austauschanalyse, um molekulare Partitionierung, Austauschkinetik und Tröpfchengröße in Protein- und Protein-RNA-Kondensaten zu quantifizieren. Ergänzend dazu erkennt die CONDENSE-MT (CONdensate DEtectioN by SEmi-solid Magnetization Transfer) Technik²⁰ NMR-unsichtbare Kondensate mittels Wassermagnetisierungstransfer, wodurch die Quantifizierung der Menge an kondensierter Materie unter gegebenen Bedingungen quantifiziert und die Hydratationsdynamik sowie molekularen Tumblierungsraten im Kondensat weiter sichtbar wird. Zusammen ermöglichen diese Methoden labelfreie, nicht-invasive Untersuchungen verschiedener Kondensattypen, Protein-reine Protein-, Protein-RNA- und RNA-reine Kondensate unter gleichgewichtsbiphasischen Bedingungen. Durch die Erweiterung des NMR-Werkzeugkastens öffnen sie die Tür zu einer systematischen, quantitativen Erforschung der Kondensatstruktur, der Dynamik und ihrer Verbindungen zu biologischer Funktion und Krankheit.

Protokoll

1. Probenvorbereitung

1. Pufferwahl: Verwenden Sie getestete Puffer, in denen die Biomoleküle am stabilsten sind.
   HINWEIS: NMR-Signale sind bei niedrigem pH-Wert typischerweise stärker. Als technische Anforderung fügen Sie 5 % D₂O als Feldsperre zu allen NMR-Proben hinzu (finales v/v).
2. Stabilisieren Sie die biphasische Probe mit einem zytoskelettähnlichen Agarose-Hydrogel als Medium. Wiegen Sie Agarosepulver, um einen 1,5 % (w/v) Agarose-Fond im selben Puffer herzustellen. Verwenden Sie reguläre Agarose als günstigere Alternative zu biomolekularen Kondensaten, die von intrinsisch ungeordneten Proteinen (IDPs) und RNAs gebildet werden, die höhere Temperaturen aushalten. Verwenden Sie Agarose mit niedrigem Schmelzen bei der Herstellung empfindlicher Kondensate mit Proteinen, die gefaltete Domänen^{enthalten 19}.
3. Zubereitung von Agarose-Fond: Die Suspension auf ca. 80 °C für 10 Minuten erhitzen und die Agarose vollständig durch Mischen oder Vortexen auflösen.
   VORSICHT: Geschmolzene Agarose ist heiß und kann brennen; Wird mit hitzebeständigen Handschuhen gehandhabt.
   HINWEIS: Halten Sie die geschmolzene Agarose warm (z. B. 55 °C für normales Agarose und 37 °C für niedrigschmelzende Agarose) in einem Wasserbad, um vor der Vermischung mit der biologischen Probe flüssig zu bleiben.
   Geschmolzene Agarose kann mehrere Dutzende^{Minuten warm} gehalten ^werden.
4. Bereite die finale biphasische Probe vor:
   1. Um eine biphasische Probe herzustellen, die durch Agarose-Hydrogel stabilisiert wird, mischt man Protein- (und/oder RNA-)Bestände mit dem jeweiligen warmen Agarosepuffer in einem 1,5-ml-Mikrozentrifugenrohr.
      HINWEIS: Die endgültige Protein-/RNA-Konzentration liegt typischerweise bei 50–500 μM, um für den NMR-Nachweis geeignet zu sein.
   2. Die Mischung wird sofort mit einer langen Glaspipette in ein 3-mm-NMR-Rohr übertragen. Lass Agarose kurz nach der Übertragung festigen.
      HINWEIS: Ohne Agarose setzt sich die biphasische Probe im Laufe der Zeit ab, was die Erfassung und Analyse von NMR-Daten erschwert, da sich die Probe physisch im Zeitmaßstab des Experiments verändert.
5. Visuelle Inspektion durchführen: Inspizieren Sie die Probe visuell. Tritt eine Phasentrennung auf, erscheint die Probe sofort trüb und bleibt so. Dies deutet darauf hin, dass die biphasische Probe erfolgreich in Agarose stabilisiert wurde.
6. Wenn Sie CONDENSE-MT durchführen möchten, bereiten Sie eine zusätzliche Agarose-Referenzprobe vor, indem Sie dieselben Schritte ausführen, nur ohne das Hinzufügen des Biomoleküls. Füge stattdessen den Puffer hinzu, um das gleiche Sample-Volumen zu erhalten. Bereiten Sie diese Probe erst vor, nachdem Sie die Kondensatprobe vorbereitet und alle darauf befindlichen Daten gemessen haben, um sicherzustellen, dass die Agarose-Referenzprobe nicht länger inkubiert wird.

2. Aufzeichnung von REDIFINE-Experimenten

1. Den ^1H-Kanalwie gewohnt einstellen, shimlen, anpassen und abstimmen. Kalibrieren Sie die 90°-Pulslänge auf ¹H mit Ihrem allgemeinen Verfahren.
2. Nehmen Sie ein 1D-wasserunterdrücktes Spektrum auf. Idealerweise wird ein starkes biomolekulares Signal beobachtet (ergänzende Abbildung 1A).
   1. Wenn kein oder nur sehr wenig Signal beobachtet wird, wird angenommen, dass das kondensierte Protein/RNA nicht NMR-beobachtbar ist und die Partitionierung in die kondensierte Phase hoch ist. In diesem Fall sollten Sie nicht mit REDIFINE fortfahren, da diese Methodik auf einem beobachtbaren biomolekularen Signal basiert.
   2. In dieser Situation sollten CONDENSE-MT-Experimente prinzipiell sehr gut funktionieren, also springen Sie sofort zu Schritt 4 (Aufzeichnung von CONDENSE-MT-Experimenten).
3. Laden Sie das konventionelle Diffusion Ordered Spectroscopy (DOSY)-Experiment, das auf einem konventionellen 2D-Stimulated-Echo-Verfahren mit bipolaren Gradienten basiert (Bruker-Pulssequenz: stebpgp1s19). Weitere Details finden Sie in den Benutzerhandbüchern von Bruker DOSY und Diffusion.
4. Stellen Sie P0, P1 und P27 auf die kalibrierte Pulslänge von 90° ein. Als Faustregel wird NS auf 32 Scans, DS auf 16, TD1 auf 16 eingestellt und TD2 sowie SW2 angepasst, um eine Aufnahmezeit von 80-100 ms zu erhalten. Stellen Sie d1 auf 1,5 Sekunden ein.
   HINWEIS: Die Farbverläufe sollten richtig kalibriert sein.
5. Optimieren Sie die Watergate-d19-Verzögerung wie üblich entsprechend Ihrem Magnetfeld, um maximale Anregung bei Aromaten (ca. 7 ppm) oder Aliphatik (ca. 1 ppm) zu erzielen. Stelle d20 auf 75 ms. Die Wahl von p30 hängt von der Größe des Proteins bzw. der RNA ab. Für Proteine >20 kDa verwenden Sie 5 ms; Für kleinere Proteine nehmen Sie 3,5 ms als Faustregel.
6. Zeichnen Sie ein DOSY-Experiment mit dem Befehl "xau dosy 2 95 16 l y y" auf, das die Diffusionsgradientenstärke in 16 Schritten linear von 2 bis 95 % anordnet.
   1. Idealerweise sollte man den anfänglichen Abfall des Signals aus der verdünnten Phase beobachten, während der Abfall des kondensierten Phasensignals stagnieren sollte (Abbildung 1A und ergänzende Abbildung 1B).
7. Um weiterhin Daten für das vollständige REDIFINE-Set zu sammeln, erstelle 9 neue stebpgp1s19, indem du die Parameter aus dem ursprünglichen Satz kopierst, das du gerade ausgeführt hast. In jedem aufeinanderfolgenden Experiment sollte nur die d20-Diffusionsverzögerung in variablen Schritten geändert werden, um den Bereich von 100–1000 ms (d. h. 100, 150, 200, 250, 300, 400, 500, 700, 1.000 ms) abzudecken.
8. Führe jedes dieser Experimente mit dem Befehl 'xau dosy 2 95 16 l y n' aus. Das letzte "n" sorgt dafür, dass die Empfängerverstärkung während der 10 Experimente erhalten bleibt.

3. Verarbeitung von REDIFINE-Datensätzen und Visualisierung der Ergebnisse

1. Verarbeiten Sie jedes Experiment (insgesamt 10) auf folgende Weise:
   1. Setze qsine von SSB 2 als Fensterfunktion, extrahiere 5^{. Scheibe} mit qsin; fp, das 1D zu phasen und die Phasenparameter im 2D-Datensatz zu speichern.
   2. Dann wird 2D mit xf2 verarbeitet, Basiskorrektur abs2 durchgeführt und diese 16 Schnitte mit Split2D extrahiert (weitere Eingaben im Pop-up-Fenster: r – 16 – 11). Dabei werden 16 Spektren, die mit unterschiedlichen Gradientenstärken gewonnen wurden, extrahiert und als 1D-verarbeitete Experimente von 11 bis 26 innerhalb desselben Datensatzes gespeichert.
   3. Wiederhole das Gleiche bei den verbleibenden 9 Experimenten. Manchmal ist es entscheidend, mindestens die ersten 4-5 Schnitte zu überprüfen, um sicherzustellen, dass die Phasierung und die Baseline-Korrektur korrekt sind. Wenn nötig, korrigieren Sie manuell – gute Phasenbildung und Basislinien sind Voraussetzung für eine korrekte Quantifizierung (Abbildung 1B).
2. Verwenden Sie den bereitgestellten Matlab-Code LLPS_REDIFINE_fit für die Analyse (ergänzende Abbildung 2A). Im Code passen Sie gemäß Ihren Experimenten Folgendes an: 'Delta' (Diffusion mal d20), 'P.d' (Gesamtgradientendauer 2*p30), exp(1,:) bis exp(10,:) basierend auf dem # der durchgeführten Experimente. Dann setze P.g entsprechend der Gradientenstärke deiner Sonde (zugänglich im TopSpin-Experimentordner unter der Datei "difflist").
3. Passe den 'Ordner' und den 'Pfad' basierend auf deinem Datenstandort an. Führe den Code bis Zeile 40 durch. Das ergibt dir den 1D-Schnitt – von hier aus wählst du die Integrationsregionen aus; Diese sollten Aromatische oder Aliphatische Stoffe umfassen und den Bereich so eng wie möglich wählen, ohne verschiedene molekulare Gruppen wie Amide zu berücksichtigen.
4. Geben Sie die Integrationsgrenzen in Punkten in den Variablen 'links' und 'rechts' entsprechend ein (ergänzende Abbildung 2A). Dies dient dazu, die Daten für die quantitative Analyse zu integrieren (Abbildung 1C). Wähle den Matrixnamen entsprechend deiner Probe, dem Laufdatum und einigen experimentellen Details aus.
5. Führe den ganzen Code aus. In 'fit0' können Sie die Startparameter auswählen, die die Optimierungsfunktion verwendet, um die Minimierung zu initiieren. Beginne mit den Standardwerten und ändere dann, falls keine Konvergenz erreicht wird, den zweiten fit0-Wert (Population in der kondensierten Phase) in Schritten von 0,1 von 0,1 auf 1.
   HINWEIS: Manchmal hat der Datensatz mehrere lokale Minima, und man muss die Startparameter stark variieren, um zum globaleren Minimum zu konvergieren.
6. Wenn eine zufriedenstellende Anpassung erreicht wurde, werden die Anpassungswerte in die Abbildung (Abbildung 1D und ergänzende Abbildung 2B) geschrieben und können in der Variablen 'Fit' abgerufen werden. Anschließend werden diese Parameter als statistisches Diagramm für eine bessere Visualisierung dargestellt.

4. Aufzeichnung von CONDENSE-MT-Experimenten

HINWEIS: Ziel des Experiments ist es, die Kondensate indirekt durch ihre Beobachtung auf das Lösungsmittel-Wasser-Signal über Protonenaustausch²⁰ zu detektieren. Im CONDENSE-MT-Experiment wird ein Fingerabdruck-MT-Profil erfasst und analysiert (Abbildung 2A)²⁰.

1. Nimm dein Lieblings-1D-Wasserunterdrückungsspektrum auf. Wenn nur sehr wenig Signal beobachtet wird, ist es sehr wahrscheinlich, dass das CONDENSE-MT-Experiment sehr gut funktioniert.
2. Eine quantitative CONDENSE-MT-Analyse erfordert vorherige Bestimmung der R1-Rate des Wassers. Bestimmen Sie die_R1-Rate mittels_{T-1-Inversionswiederherstellung} . Kopieren Sie die bereitgestellte Pulssequenz, den Bruker-Parametersatz und die vd-Liste in die jeweiligen Ordner. Laden Sie den Parametersatz "T1_inversion_recovery" und passen Sie Leistung und Frequenzen an Ihrem NMR-Spektrometer an (laut "edprosol").
   1. Kalibriere den 1H 90°-Puls (p1), stelle NS auf 2, DS auf 0, d1 auf 20 s, SW auf 10 ppm, TD2 auf 16k und TD1 auf 24 (von der Länge deiner angepassten VD-Liste). Aktivieren Sie einen schwachen Gradienten entlang Z (GPZ0 = 0,1 %), um Strahlungsdämpfungseffekte zu vermeiden.
3. Für das CONDENSE-MT-Experiment,
   1. Kopiere den bereitgestellten Bruker-Parametersatz, die Sequenz und die Frequenzliste in die Bruker-spezifischen Ordner, lade den Parametersatz "CONDENSE-MT" und passe die Frequenzen und Leistungen entsprechend deinem Spektrometer an.
   2. Stellen Sie P1 auf die kalibrierte 90°-Pulslänge und P4 auf 1 μs für den Anregungsimpuls ein, um Strahlungsdämpfung zu vermeiden. Stellen Sie NS auf 2, DS auf 16, d1 auf 4 s, SW2 auf 20 ppm, TD2 auf 8k, TD1 auf die Länge der Frequenzliste (typischerweise 46). Setze SPNAM10 auf Squa100,1000 und seine Dauer p10 auf 5 Sekunden.
   3. Finde die SP10-Leistung so, dass sie 100 Hz Bestrahlung liefert (der Befehl 'Pulse 100 Hz' berechnet deine Leistung sowohl in Watt als auch in dB). Passen Sie die SP10-Leistung des Bestrahlungsimpulses entsprechend an und führen Sie dieses pseudo-2D-Experiment mit dem Befehl 'zg' aus.
      HINWEIS: Das Experiment wird die bereitgestellte Frequenzliste verwenden, die die Strahlungsversätze von der Einresonanz mit Wasser bis zur sehr weit entfernten Resonanz (100000 Hz) umfasst, um das Wassersignal bei verschiedenen Bestrahlungsverschiebungen zu erkennen (Abbildung 2B). Ein Diagramm von Wasserintegralen (stellen Sie eine korrekte Phasierung der Spektren sicher; Abbildung 2C) bezüglich des Bestrahlungsoffset ergibt das in Abbildung 2A dargestellte CONDENSE-MT-Profil.
4. Erstellen Sie 7 neue Experimente und erhöhen Sie in jedem aufeinanderfolgenden nur die Bestrahlungsleistung, um den Bereich von 170 Hz bis 1000 Hz abzudecken (d. h. 170, 250, 330, 500, 650, 780, 1.000 Hz). Verwenden Sie in jedem Experiment den Befehl aus dem vorherigen Punkt. Für jede Sättigungsleistung wird die gesamte Offset-Liste erhalten (Abbildung 2D).
   HINWEIS: Die Condense-MT-Fitting erfordert die Referenzdaten, die auf der ausschließlich Agarose-Probe (Medium ohne biomolekulare Kondensate) erhoben wurden. Sicherstellen Sie das gleiche Zeitintervall zwischen Probenvorbereitung und Datenerfassung und erwerben Sie denselben Datensatz aus 8 Experimenten auf einer Agarose-Referenzprobe. Dies soll sicherstellen, dass sowohl die Agarose-Referenz als auch die biphasische Probe für die gleiche Zeit inkubiert wurden.

5. Verarbeitung von CONDENSE-MT-Datensätzen und Visualisierung der Ergebnisse

1. Verarbeiten Sie jedes CONDENSE-MT-Experiment (insgesamt 8, ergänzende Abbildung 3A) auf folgende Weise.
   1. Setze qsine von SSB 2 als Fensterfunktion, extrahiere den 46^. Schnitt mit qsin; fp, den Wasserpeak in 1D zu phasen, die Phasenparameter im 2D-Datensatz zu speichern, dann 2D mit xf2 zu verarbeiten und diese 46 Schnitte mit Split2D zu extrahieren (weitere Eingaben im Pop-up-Fenster: r – 46 – 11).
      HINWEIS: Hierbei werden 46 1D-Spektren extrahiert, die mit verschiedenen Strahlungsoffsets erfasst wurden, und als 1D-verarbeitete Experimente von 11 bis 56 im selben Datensatz gespeichert (ergänzende Abbildung 3A, gezeigt für das 1000-Hz-CONDENSE-MT-Experiment).
   2. Wiederhole das Gleiche für die verbleibenden 7 Experimente. Überprüfen Sie mehrere Schnitte aus jedem Experiment, um sicherzustellen, dass Phasen- und Ausgangsstufen korrekt sind (Abbildung 2C). Falls nötig, korrigieren Sie manuell – gute Phasenbildung und Baseline sind Voraussetzungen für eine korrekte Quantifizierung!
2. Wiederholen Sie dieselben Schritte bei den mit der Agarose-Referenzprobe erhobenen Daten und für die Inversionswiederherstellungsexperimente, wobei der 24. Schnitt zur Phasierung extrahiert und split2D verwendet wird (r – 24 – 11).
3. Passe die erfassten Daten mit dem bereitgestellten Matlab-Code ein. Befolgen Sie die spezifischen Anweisungen im Skript.
4. Führen Sie zunächst die Fitting-Analyse für die Agarose-Referenzprobe durch, um die Hintergrundparameter in Abwesenheit von Kondensaten zu erhalten. Der read_CONDENSE_MT_data-Code liest zunächst die verarbeiteten NMR-Daten aus und integriert das Wasserresonanzsignal in die 1D-Schnitte, die durch den Split2D-Befehl erzeugt werden (ergänzende Abbildung 3B).
5. Setzen Sie die Integrationsgrenzen einzeln; ein Referenz-1D-Spektrum wird in Matlab dargestellt, um die Integrationsgrenzen zu bewerten (ergänzende Abbildung 3C). Der Code wird die Daten weiter normalisieren und die normalisierten Integrale von Wasser als Funktion von Bestrahlungsoffset und Leistung an das CONDENSE-MT Modell²⁰ anpassen. Die read_CONDENSE_MT_data speichert die normalisierten Integrale in der variablen integral_water_real_all, die dann für die anschließende Anpassung verwendet wird.
6. Bestimmen Sie die_{R1-Relaxationsrate} von Wasser in Anwesenheit von Agarose oder Kondensaten, bevor Sie die CONDENSE-MT-Daten anpassen.
   HINWEIS: Die Anpassung des Wasserinversions-Wiederherstellungsexperiments kann im ersten Abschnitt des CONDENSE-MT_full Matlab-Skripts (oder im CONDENSE_MT_referenceMTpool Skript im Fall der Agarose-Referenzdaten) durchgeführt werden. Der Dateiname und der Pfad des Experiments sowie die Experiment-ID des Experiments können eingegeben werden, um das Inversion_Recovery Matlab-Skript auszuführen (ergänzende Abbildung 4A, Abschnitt 1). Falls erforderlich, können die Anzahl der 1D-Schnitte und die Integrationsgrenzen in diesem Skript angepasst werden; letzteres hängt von den in TopSpin verwendeten Verarbeitungsparametern ab. Dieser Abschnitt bestimmt die R1-Wasserrate und speichert sie in der Variable P.R1w , die für die spätere Anpassung der CONDENSE-MT-Daten erforderlich ist.
7. Für Agarose-Daten verwenden Sie die normalisierten Integrale direkt zum Fitting mit dem CONDENSE_MT_referenceMTpool-Skript (das die function_1MT-Funktion aufruft).
8. Für die Kondensatquantifizierung verwenden Sie die angepassten Parameter von Agarose als Eingabe für die globale Anpassung der auf der kondensierten Probe erfassten Daten (ergänzende Abbildung 4A). Dies wird die physikalischen Eigenschaften des Agarose-Netzwerks als konstante Werte zur Passung festlegen und so die Quantifizierung des kondensatvermittelten, zusätzlichen Effekts eines im Agarose-Netz eingebetteten Kondensats ermöglichen (Abbildung 2E).
9. Führen Sie die Kondensatquantifizierung mit dem CONDENSE-MT_full-Skript durch, das die function_2MT Matlab-Funktion aufruft. Die Startparameter für die rechnergestützte Optimierung werden über fit0 angegeben (ergänzende Abbildung 4B). Die Parameterunsicherheit der Passung wird mit der Jacobianmatrix berechnet, aus der die Varianz-Kovarianz-Matrix abgeleitet wird (ergänzende Abbildung 4B).
10. Bewerten Sie die Qualität der Passung anhand der Passabweichung, die der Restabweichung der Modellvorhersage von experimentellen Daten ähnelt. Zur weiteren Qualitätskontrolle werden die Passungen mit experimentellen Daten zusammengeführt (ergänzende Abbildung 4C).

Ergebnisse

Das hier beschriebene LLPS REDIFINE-Protokoll wurde auf die FUS N-Terminaldomäne (NTD) angewendet. FUS NTD trennt sich unter Umgebungsbedingungen bei mikromolaren^{Konzentrationen 19,21} leicht phasenfrei. Diese spezielle Probe wurde bei einer Konzentration von 200 μM in einem 30 mM HEPES-Puffer mit 200 mM KCl bei pH 7,5 und 0,5 % regulärer Agarose hergestellt. Nach der Phasentrennung bleiben FUS-NTD-Signale in der kondensierten Phase beobachtbar (Abbildung 1A,B). Das macht es zu einem perfekten Kandidaten für LLPS REDIFINE zum Studium. Nämlich enthalten die meisten LLPS-anfälligen Proteine lange, intrinsisch ungeordnete Regionen, die in der Regel in der kondensierten Phase sichtbar bleiben; Bei strukturierteren Proteinen ist dies jedoch nicht der Fall.

Die REDIFINE-Anpassung (Abbildung 1D und Abbildung 3A,B) zeigte mehrere eindeutige Parameter für diese FUS-NTD-Probe. Konkret bestimmte sie die Diffusionskoeffizienten in der verdünnten und kondensierten Phase (D_dil und D_cond), die Proteinpopulation in der kondensierten Phase (ν_cond), die durchschnittliche Tröpfchengröße R und die Interphasenpermeabilität p. Tröpfchengröße und Permeabilität definieren den Wechselkurs zwischen den Phasen von der kondensierten in die verdünnte Phase k_cd=3p/R, was es uns ermöglicht, Informationen über die Austauschdynamik¹⁹ zu erhalten.

Diese Ergebnisse können auf verschiedene Weise visualisiert werden (Abbildung 3B). Mit einem Spinnenplot könnte man Ergebnisse über verschiedene Bedingungen oder Proben hinweg vergleichen. Andererseits kann man die REDIFINE-Parameter im Modell bildlich darstellen, um sie am effektivsten darzustellen. Beachten Sie, dass REDIFINE all diese Ergebnisse etikettfrei in nur wenigen Stunden mit nur einer Probe liefert.

Da das NMR-Signal von FUS NTD in der kondensierten Phase nachweisbar bleibt (Abbildung 3C), wird das CONDENSE-MT höchstwahrscheinlich aufgrund des fehlenden Relaxationskontrasts nicht anwendbar sein. Wir haben den CONDENSE-MT-Datensatz auf FUS NTD aufgezeichnet, und tatsächlich ist kein Unterschied im MT-Profil zwischen der Agarose-Referenz und der FUS NTD biphasischen Probe beobachtet (Abbildung 3C). Dadurch ist die CONDENSE-MT-Methodik auf diese spezielle FUS-NTD-Probe nicht mehr anwendbar.

Der CONDENSE-MT liefert jedoch eine dynamische Charakterisierung von Kondensaten von RNA-Wiederholungsexpansionen (Abbildung 3C,D)²⁰. Beachten Sie, dass CONDENSE-MT mehrere Parameter liefern könnte, die die RNA in der kondensierten Phase eindeutig charakterisieren (Abbildung 3D), obwohl sein Signal in herkömmlicher NMR nicht beobachtbar ist (Abbildung 3C). Die erhaltenen Parameter sind die Protonenaustauschkinetik zwischen Kondensat und Massenwasser (k_{Kondensat, H2O} und k_{H2O, Kondensat}), die_{T2-Relaxationsrate} für das Kondensat (T_{2, Kondensat}), die das Ausmaß des dynamischen Arrests der Biomoleküle bei der Kondensation widerspiegelt, sowie die scheinbare_R2-Rate des Bulkwassers (R_{2, Wasser}). Dieser letzte Parameter ist eine lineare Kombination aus der Umschlagsrate von Bulk, verdünntem Wasser und langsam strömendem, kondensiertem Wasser. Höhere_{R2-Wasserwerte} deuten auf eine höhere Wasserpopulation im Kondensat hin, was die scheinbare Gesamt-R2-Wasserrate ^{um 20} erhöht (Abbildung 2E und Abbildung 3D).

VERFÜGBARKEIT VON DATEN UND CODE

LLPS REDIFINE-Rohdaten und Verarbeitungscodes sind im Zenodo-Repository verfügbar: https://doi.org/10.5281/zenodo.15228787 . CONDENSE-MT Rohdaten und Verarbeitungscodes wurden https://doi.org/10.5281/zenodo.15789697 in das Zenodo-Repository eingelagert. MATLAB ist für die Verarbeitung erforderlich. Sie sind auch in diesem Artikel (Supplementary Coding Files) enthalten.

Abbildung 1: REDIFINE-Workflow. (A) Diffusionsmessungen liefern komplexe biphasische Diffusionsabfallkurven in kondensierten Proben. Der resultierende Zerfall enthält dekonvolvierte Parameter, die die Diffusionskoeffizienten der Spezies in der kondensierten und verdünnten Phase, ihre Populationen, Tröpfchengröße und die Wechselrate zwischen den Phasen beschreiben. (B) Um diese isolierten Parameter zu dekodieren, muss man einen Pseudo-3D-Datensatz aufzeichnen, indem nicht nur die Gradientenstärke, sondern auch die Diffusionsverzögerungen variiert werden. Für die Quantifizierung ist es absolut unerlässlich, dass jeder Schnitt dieser Messungen richtig phasenweise und baseline-korrigiert wird. (C) Nach Überprüfung der Qualität der gemessenen und verarbeiteten Daten werden diese 1D-Schnitte in den MATLAB-Code zur Analyse und endgültigen Zeichnung eingespeist. (D) Die Daten werden dann durch einen nichtlinearen Programmierlösungsapparat angepasst. Die Anpassung und die resultierenden Parameter sind für die biphasische FUS-NTD-Probe dargestellt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.

Abbildung 2: CONDENSE-MT Workflow (A) Ein einzigartiges CONDENSE-MT-Profil, das an der Wasserresonanz beobachtet wurde und die Verbreiterung durch das Vorhandensein kondensierter Biomoleküle und Wasser veranschaulicht. (B) Wasser wird bei jedem Strahlungsoffset beobachtet. (C) Zur Quantifizierung ist es unerlässlich, dass alle Spektren korrekt phasenweise sind. (D) Nach der Erfassung der Wasserresonanz bei verschiedenen Bestrahlungsoffsets wird das Experiment mit unterschiedlichen Bestrahlungsleistungen wiederholt. Dies liefert einen Datensatz des relativen Wassersignals als Funktion sowohl des Strahlungsoffset als auch der Bestrahlungsleistung (E). Die Daten werden dann von einem nichtlinearen Programmlösungsversuch angepasst. Die Anpassung und die resultierenden Parameter sind für die biphasische 31xCAG-RNA-Probe dargestellt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.

Abbildung 3: Präsentation der REDIFINE- und CONDENSE-MT-Ergebnisse. (A) Spider-Plot-Darstellung der REDIFINE-Parameter für vergleichende Analysen über Proben oder Bedingungen hinweg. (B) Schematisches Modell, das REDIFINE-abgeleitete Parameter illustriert, einschließlich Diffusionskoeffizienten, Tröpfchenradius, Partitionierung und Wechselrate zwischen den Phasen. (C) Vergleich von CONDENSE-MT-Profilen, die für Agarose-Referenz und biphasische FUS NTD in Agarose bei 500-Hz-Bestrahlung gewonnen wurden.
(D) CONDENSE-MT-Analyse von 31xCAG-Wiederholungs-Expansions-RNA-Kondensaten, die Parameterextraktion und Visualisierung der kondensatassoziierten Magnetisierungstransfereffekte zeigt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.

Ergänzende Abbildung 1: REDIFINE-Setup. (A) Die FUS-N-terminale Domäne bleibt bei der Vorbereitung der biphasischen kondensierten Probe beobachtbar. Ein starkes Amid-/Amino- und aromatisches Protonensignal wird beobachtet. (B) Der im Diffusions-DOSY-Experiment beobachtete Signalabfall zeigt einen schnelleren Zerfall der Population des verdünnten Proteins und einen langsameren Zerfall des Proteins in der kondensierten Phase. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Ergänzende Abbildung 2: REDIFINE-Verarbeitung. (A) Matlab-Code, der für die REDIFINE-Anpassung verwendet wird, mit hervorgehobenen Parametern, wo die spezifische Eingabe benötigt wird. Das Inset zeigt, wie man den Integrationsbereich auswählt. (B) Minimierung der Fitting-Funktion und der daraus resultierenden Ergebnisse. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Ergänzende Abbildung 3: CONDENSE-MT-Aufbau. (A) Überblick über die für die CONDENSE-MT-Analyse erforderlichen NMR-Experimente, einschließlich des Wasserinversions-Rückgewinnungsexperiments (Expno. 5) und der CONDENSE-MT-Experimente bei unterschiedlichen Bestrahlungsleistungen (Expno 11-18). (B), (C) Überblick über das Matlab-Skript zum Lesen und Integrieren der Wasser-1D-Spektren für CONDENSE-MT-Datensätze. Die CONDENSE-MT-Experimente sind als Haupt – Haupt8 angegeben. Die Integrationsgrenzen werden als water_left und water_right eingetragen. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Ergänzende Abbildung 4: CONDENSE-MT-Verarbeitung. (A) Erster Abschnitt des CONDENSE-MT-Fitting-Skripts, der die Wasserinversionsrückgewinnung (Abschnitt 1) und die Eingabe der zuvor festgelegten Agarose-Hintergrundparameter umfasst. (B) Fitting und Bestimmung der Parameterunsicherheit von CONDENSE-MT-Datensätzen. Startparameter für die Passung können innerhalb fit0 gesetzt werden. (C) Plottabschnitt des CONDENSE-MT-Fitting-Ergebnisses. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Ergänzende Codierungsdateien: MATLAB-Skripte für REDIFINE- und CONDENSE-MT-Analyse. Bruker Topspin programmiert, um das CONDENSE-MT-Experiment und MATLAB-Skripte einzurichten, die für die Verarbeitung und Anpassung von REDIFINE-Diffusionsdatensätzen und CONDENSE-MT-Magnetisierungs-Transfer-Datensätzen verwendet werden, einschließlich Datenintegration, Relaxationsanalyse und globaler Modellanpassungsroutinen. MATLAB ist erforderlich, um die Skripte auszuführen. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Diskussion

Hier stellten wir detaillierte Protokolle für die etikettfreie, NMR-Charakterisierung biphasischer biomolekularer Kondensate vor. Diese umfassen die beiden aufkommenden Methoden, LLPS REDIFINE und ein komplementäres, aber orthogonales Experiment namens CONDENSE-MT. Obwohl allgemein anwendbar, basiert LLPS REDIFINE auf biomolekularer Detektion und benötigt ein beobachtbares Signal bei Phasentrennung für eine ordnungsgemäße Analyse. Obwohl dies die Anwendbarkeit von REDIFINE einschränken kann, enthalten die meisten Kondensate Proteine mit intrinsisch ungeordneten Regionen, die üblicherweise durch NMR beobachtbar sind. Insbesondere bei Protein:RNA- und RNA-reinen Kondensaten erweitert sich das Signal der Biomoleküle in der kondensierten Phase über die Nachweisgrenzen hinaus bei der Phasentrennung. Ist der Teilungskoeffizient in die kondensierte Phase hoch, wird mit herkömmlicher NMR fast kein Signal beobachtet. CONDENSE-MT umgeht diese Nachweisbeschränkung, indem es eine wasserbeobachtete Technik ist, die auf einem signifikanten Unterschied in der Relaxation zwischen Molekularspezies in verdünnten und kondensierten Phasen basiert.

Eine ordnungsgemäße Probenvorbereitung ist entscheidend für die erfolgreiche Anwendung sowohl von REDIFINE als auch von CONDENSE-MT. Daher ist es wichtig, sicherzustellen, dass die Agarose vollständig geschmolzen ist, bevor sie in das Gemisch übertragen wird, um die starke Bildung von Luftblasen während des Transfers zu vermeiden und genügend Material bereitzustellen, um ein NMR-Rohr zuverlässig mit biphasischen Gemischen zu füllen, die zunächst an der Glaswand haften. Für CONDENSE-MT ist es entscheidend, ein gegebenes Volumen Agarose reproduzierbar zu übertragen, da der Agarose-Hintergrund separat quantifiziert wird. Wenn die Verteilung der Biomoleküle zwischen kondensierten und verdünnten Phasen stark verzerrt ist oder der Austausch zwischen den Phasen sehr langsam oder schnell erfolgt, könnten REDIFINE- oder CONDENSE-MT-Effekte fehlen oder zu schwach für eine zuverlässige Quantifizierung sein. Dies kann eine wesentliche Einschränkung dieser Techniken darstellen. In einem solchen Fall kann jedoch das Erhöhen oder Absenken der Temperatur helfen, da die Temperatur ein mächtiger Modulator der molekularen Partitionierung und chemischer Austauschraten ist. Sobald Datensätze erfasst sind, werden optimale Anpassungsergebnisse oft iterativ erzielt, indem die rechnerische Optimierung unter Verwendung der bestpassenden Parameter aus der ursprünglichen oder vorherigen Anpassung als Eingabewerte wiederholt wird.

Für Systeme, die starke REDIFINE- und CONDENSE-MT-Effekte erzielen, können diese Experimente labelfreie Einblicke in molekulare Partitionierung, Wechselkurse und molekulare Dynamik liefern, die mit anderen labelfreien Methoden schwer zu erreichen sind. Darüber hinaus sind NMR-basierte Methoden im Allgemeinen nicht-invasiv, was es ermöglicht, Proben mehrfach zu analysieren oder über längere Zeiträume zu lagern, was die Überwachung der Kondensateigenschaften über die Zeit ermöglicht. Dies ist besonders interessant im Kontext der pathologischen Kondensatreifung der Fibrilisation, die mit komplementären Methoden über sehr lange Zeiträume zu untersuchen ist.

Da membranlose zelluläre Organellen im Allgemeinen mehrkomponentenbasierte Baugruppen mit komplexer Architektur sind, werden zukünftige Anwendungen dieser Technik den Nachweis und die Charakterisierung immer ausgefeilterer Mehrkomponenten-Kondensatmodellsysteme sowie Kondensatanalysen im zellulären Kontext mittels In-Cell-NMR umfassen. Dies erfordert jedoch eine Anpassung von REDIFINE oder CONDENSE-MT an solch komplexe Systeme, und es werden Bemühungen zur Umsetzung dieser Systeme durchgeführt.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
700 MHz Avance NEO NMR-Spektrometer	Bruker Biospin	https://www.bruker.com/en.html	Die Daten werden auf einem 700-MHz-NMR-Spektrometer erfasst.
Topspin	Bruekr Biospin	https://www.bruker.com/en.html	Die Daten werden mit dieser Software verarbeitet.
FUS NTD-Protein		N/A	Dieses Protein wird in unserem Labor exprimiert und gereinigt
31xCAG RNA		N/A	RNA wird in unserem Labor produziert und gereinigt.
MATLAB	MathWorks	https://www.mathworks.com/products/matlab.html	Die Daten werden mit dieser Software verarbeitet und visualisiert.