Entwicklung eines hochpräzisen präklinischen Mausmodells für Gehirnmetastasen mit Interlock Pulsatile Injektionstechnik und mikrochirurgischer Gefäßreparatur

Zusammenfassung

Diese Studie etabliert hochpräzise Mausmodelle von Hirnmetastasen durch vorübergehende intrakarotis-Injektion von Tumorzellen mit Interlock-Pulsatilinjektion und mikrochirurgischer Reparatur. Es erhält den zerebralen Blutfluss, verhindert eine Verschlusserscheinung der Arteria Halsschlagader und bietet überlegene präklinische Modelle mit verbesserten Tumormetastaserraten und reduzierter Sterblichkeit.

Zusammenfassung

Hirnmetastasen bleiben ein verheerendes klinisches Problem. Eine große Herausforderung in der Hirnmetastaseforschung ist das Fehlen hochwertiger Modelle, die den metastatischen Prozess genau nachbilden und so mechanistische Einblicke darin ermöglichen, wie Krebszellen im Gehirn kolonisieren. Traditionelle Injektionsmodelle der Intrakarotisarterie bei Hirnmetastasen erfordern oft eine dauerhafte Ligatur der Arterie Halsschlagader (CCA), was die zerebrale Hämodynamik verändert und die Integrität der Blut-Hirn-Schranke (BBB) beeinträchtigt. Das Protokoll stellt eine verfeinerte Methode zur Erstellung eines hochpräzisen Mausmodells der Gehirnmetastasen vor. Die zentrale Innovation umfasst die Interlock Pulsatile Injection (IPI)-Technik zur Tumorzellabgabe, gefolgt von mikrochirurgischer arterieller Rekonstruktion an der Punktionsstelle zur Wiederherstellung des physiologischen Blutflusses im CCA. Im Vergleich zum konventionellen CCA-Ligationsmodell reduzierte der IPI–mikrochirurgische Reparaturansatz die perioperative Sterblichkeit signifikant (2,86 % gegenüber 25,71 %) und erhöhte die Rate der Etablierung von Hirnmetastasen (94,12 % vs. 65,38 %). Die IPI-Technik verwendet eine Tandem-Spritzenkonfiguration, um die Zellregurgitation während der Intrakarotisinjektion zu minimieren. Nach der Tumorzellinfusion wird das CCA sorgfältig mittels mikrochirurgischer Nähte unter einem Stereomikroskop repariert, wodurch eine dauerhafte Verschlusserscheinung vermieden wird. Dies bewahrt die native zerebrale Hämodynamik und die Integrität des BBB zum Zeitpunkt des Eintritts in die Tumorzelle, verbessert die chirurgischen Erfolgsraten signifikant und senkt die Sterblichkeit. Die metastatischen intrakraniellen Läsionen werden durch serielle Biolumineszenzbildgebung und Histopathologie validiert. Die Methode bietet eine überlegene Plattform zur Untersuchung der Pathophysiologie von Hirnmetastasen und zur präklinischen therapeutischen Evaluation, wodurch der metastatische Prozess wiederholt wird.

Einleitung

Hirnmetastasen stellen die häufigste Form eines bösartigen Hirntumors bei Erwachsenen dar und treten etwa zehnmal häufiger auf als primäre Hirntumoren¹. Es wird geschätzt, dass 10–20 % der Patienten mit systemischem Krebs während fortgeschrittener Krankheitsstadien Hirnmetastasen entwickeln, was eine der Hauptursachen für die Sterblichkeit^{ist 1,2}. Trotz bedeutender Fortschritte in der Behandlung von Primärkrebsarten bleibt die Prognose für Patienten mit Hirnmetastasen weiterhin schlecht. Die Einjahresüberlebensrate von Patienten mit Hirnmetastasen liegt bei weniger als 20 ^%. Der Mechanismus, warum und wie manche Krebsarten ins Gehirn metastasieren, bleibt unbekannt. Die therapeutische Herausforderung wird durch die einzigartige Biologie der Hirnmetastasen noch verstärkt, darunter das Vorhandensein der BBB, die besondere Immun-Mikroumgebung im Gehirn und komplexe Tumorzellinteraktionen mit neuroglialen Zellen ^4,5.

Sowohl pharmakodynamische als auch pathogenesische Forschung zur Hirnmetastasierung stützt sich stark auf präzise präklinische Tiermodelle, die den menschlichen Krankheitsprozess genau nachbilden. Aktuelle Tiermodelle der Gehirnmetastasen basieren zwar weit verbreitet, basieren hauptsächlich auf intrakranieller orthotopischer Implantation, intravenöser oder Schwanzveneninjektion, intrakardialer Injektion oder intrakarotisarterieinjektion 6,7,8,9,10. Diese Modelle spiegeln jedoch den menschlichen Krankheitsverlauf unvollkommen wider und erfassen oft keine wichtigen Schritte wie die Extravasation von Tumorzellen über eine intakte BBB unter physiologischen Flussbedingungen¹¹. Intravenöse und intrakardiale Injektionen führen zu einer geringen Effizienz der hirnspezifischen Tumorbildung und führen oft zu weit verbreiteten extrakraniellen Metastasen, was zu einem vorzeitigen Tiertod führt, bevor sich erhebliche Hirnmetastasen entwickeln¹². Die traditionelle Injektion der arterie intracarotis erhöht die Tumorbildung im Schädel, erfordert jedoch eine dauerhafte Ligierung der CCA. Durch die Veränderung der zerebralen Hämodynamik kann diese Ligation eine Ischämie in ipsilateralen Hirnregionen auslösen und die physiologischen Blutflussmuster beeinträchtigen, die für die Tumorzelllieferung notwendig sind, wodurch deren räumliche Verteilung und Kolonisierungsnische im Gehirn beeinflusst^13,14.

Hochwertige Tiermodelle, die die Pathophysiologie der Hirnmetastasen getreuer nachahmen können, sind entscheidend¹⁵. Ein ideales Hirnmetastasemodell sollte die gesamte metastatische Kaskade wiederholen, einschließlich der Tumorzellen-Heimkehr zur Gehirngefäße, der Extravasation über die Blut-Hirn-Schranke (BBB) und dynamischen Interaktionen mit der Gehirnmikroumgebung¹⁶. Eine hohe Modelltreue ist sowohl für mechanistische Studien als auch für therapeutische Evaluation^{entscheidend 6}. Bestehende Modelle für intrakarotis-Injektionen reproduzieren jedoch nicht vollständig die wichtigsten physiologischen Bedingungen, insbesondere die Erhaltung des normalen zerebralen Blutflusses und die natürliche Verteilung zirkulierlicher Tumorzellen.

Um die Einschränkungen bestehender präklinischer Modelle der Gehirnmetastasen zu überwinden, wurde ein hochpräzises Tiermodell entwickelt, das die metastatische Kaskade genauer repapituliert, basierend auf der IPI-Technik und der mikrochirurgischen arteriellen Reparatur. Diese Methode beinhaltet eine vorübergehende arterielle Okklusion nach der Tumorzellinjektion, gefolgt von sorgfältiger Reparatur der arteriellen Punktionsstelle, um den physiologischen Blutfluss zum ipsilateralen CCA wiederherzustellen. Dieser Ansatz verbessert nicht nur die Modellkonsistenz und Erfolgsraten, sondern erhält auch, was entscheidend ist, das BBB durch die Aufrechterhaltung der nativen zerebralen Hämodynamik. Durch die Minimierung der Störung des zerebralen Blutflusses bietet das modifizierte Intrakarotis-Injektionsmodell eine hochpräzise Plattform, die den natürlichen Prozess der metastasierten Kolonisierung im Gehirn genauer wiedergibt und so ein verbessertes Werkzeug zur Untersuchung von Mechanismen der Gehirnmetastasen und zur Bewertung potenzieller Therapeutika bietet.

Protokoll

Alle Tierversuche wurden vom Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) des Instituts für Biophysik, Chinesische Akademie der Wissenschaften (Genehmigungsnummer: SYXK2021124) genehmigt. Tiere, die vordefinierte Endpunkte erreichten, wurden gemäß den Richtlinien für die Euthanasie von Tieren des Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) des Instituts für Biophysik der Chinesischen Akademie der Wissenschaften und den AVMA-Richtlinien für die Euthanasie von Tieren (2020)¹⁷ eingeschläfert.

1. Vorbereitung der Einzelzell-Suspension

1. Kultur der B16F10- und 4T1-Zellen im vollständigen RPMI-1640-Medium, ergänzt mit 10 % fetalem Rinderserum (FBS) und 1 % Penicillin-Streptomycin.
2. Halten Sie die Zellen bei 37 °C in einem befeuchteten Inkubator mit 5 % CO₂.
3. Bestätigen Sie die Luciferase-Expression und überprüfen Sie das Fehlen einer Mykoplasma-Kontamination einen Tag vor dem operativen Eingriff.
4. Am Tag des chirurgischen Eingriffs entnehmen Sie die Zellen, wenn sie 80 % Zusammenfluss erreichen, indem Sie zuerst mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) waschen, bevor sie Trypsinisierung (0,25 %) für weniger als 3 Minuten bei 37 °C einnehmen.
5. Gib 10 % FBS-haltiges RPMI-1640-Medium in die Zellen, um das 0,25 % Trypsin zu dämpfen.
6. Zentrifugiere die Zellen bei 300 × g für 3 Minuten. Waschen Sie die Zellen zweimal in PBS, um Restserum zu entfernen, und zählen Sie sie dann mit einem Hämozytometer.
7. Verwenden Sie den Trypan-blauen Ausschlusstest, um zu bestätigen, dass die Zelllebensfähigkeit während der Injektion bei 90–95 % bleibt.
8. Resuspendiere Zellen in PBS bei 2 × 10^{6 Zellen} /mL. Lass die Zellen bis zur Injektion auf Eis.
   HINWEIS: Luciferase-markierte B16F10- und 4T1-Zellen können verwendet werden. B16F10 wird als repräsentatives Beispiel präsentiert.

2. Mäusevorbereitung und perioperative Vorbereitung

1. Verwenden Sie männliche C57BL/6-Mäuse von 7 bis 8 Wochen.
2. Platzieren Sie ein Heizkissen unter die OP-Platte, um Unterkühlung zu verhindern. Schalte das Wärmekissen 30 Minuten vor der Operation ein.
3. Sterilisiere alle chirurgischen Instrumente, die OP-Platte und den Käfig mit einem Autoklaven. Desinfizieren Sie das Stereomikroskop und den Operationstisch mit 75 % Ethanol.
4. Andere Gegenstände, die nicht durch Autoklavierung sterilisiert werden können, sollten mit UV-Bestrahlung und 75 % Ethanol desinfiziert werden (Abbildung 1A).
5. Wiegen Sie die Maus vor der Betäubung und notieren Sie das präoperative Gewicht als Ausgangswert.
6. Gib 10 g Tribromoethanol in ein Zentrifugenrohr und dann 10 ml tertiären Amylalkohol. Schütteln Sie das Rohr, bis das Tribromoethanol vollständig gelöst ist.
   HINWEIS: Tribromoethanol kann Nebenwirkungen verursachen, einschließlich der Sterblichkeit; Überwachen Sie die Tiefe der Anästhesie sorgfältig.
7. Filtern Sie die Lösung durch einen 0,22-μm-Filter, um eine 100%ige Bodenlösung herzustellen.
8. Verdünnen Sie die 100%ige Grundlösung mit 0,9% NaCl-Kochsalzlösung oder Verdünner zu einer 2,5%igen Arbeitslösung (1:40 Verdünnung). Die Wirksamkeit jeder frisch zubereiteten Arbeitslösung muss auf Anästhesie bei Mäusen getestet werden.
9. Mäuse werden durch intraperitoneale (i.p.) Injektion von 2,5 % Tribromoethanol bei 0,2 mL/10 g Körpergewicht betäubt. Bei Bedarf verlängern Sie die Anästhesie durch Verabreichung einer Nachdosierung von einem Drittel des ursprünglichen Anästhetikums (Abbildung 1B).
   HINWEIS: Passen Sie die Anästhesie-Dosierung an das Körpergewicht an und überwachen Sie kontinuierlich die Atmung.
10. Stellen Sie sicher, dass die Maus vollständig betäubt ist, indem Sie einen milden Reiz (z. B. Zehenkneifen) anwenden und keine motorische Reaktion beobachten.
11. Rasieren Sie das Fell im Nackenbereich und machen Sie nach der Narkose eine Zehenschnittspur.
12. Tragen Sie eine Augensalbe auf, um die Augen vor Trockenheit zu schützen.
13. Legen Sie die Maus auf eine Operationsplatte und sichern Sie die 4 Gliedmaßen sowie oberen Schneidezähne mit Klebeband (Abbildung 1C).
14. Überwachen Sie die Tiefe der Anästhesie, indem Sie die Atemfrequenz und den Kneifreflex beurteilen, um sicherzustellen, dass die Mäuse während des Eingriffs schmerzfrei und bewegungsunfähig bleiben.
15. Die Tiere werden zufällig experimentellen Gruppen zugeteilt, und eine bildgebende Analyse wurde von Forschern durchgeführt, die für die Gruppenzuweisung blind waren.

3. Standardchirurgische Verfahren der IPI-Technik und mikrochirurgische Reparatur

1. Desinfizieren Sie die Halsregion mit einer Povidon-Jod-Lösung und lassen Sie die Haut vollständig trocknen, bevor Sie fortfahren (Abbildung 1D).
2. Die Maus aseptisch mit einem sterilen chirurgischen Verband abdecken, wobei nur der Halsbereich freigelegt wird (Abbildung 1E).
3. Machen Sie mit einer sterilen chirurgischen Schere einen mittleren Halsschnitt von etwa 0,8–1 cm Länge und feinen Zangen zur Geweberückziehung (Abbildung 2A).
4. Führen Sie eine stumpfe Sektion der oberflächlichen Faszie und der darunterliegenden Muskeln mit feiner Winkelpinzet durch, um die rechte Halsschlagaderscheide freizulegen (Abbildung 2B1, Abbildung 2C1).
5. Isolieren Sie die rechte äußere Halsschlagader (ECA) von der Halsschlagaderscheide und ligatizieren Sie die rechte ECA, um ein Zellauslaufen in die extrakraniellen Äste zu verhindern (Abbildung 2B2, Abbildung 2C2).
6. Isolieren Sie vorsichtig die rechte CCA innerhalb der Halsschlagaderscheide, wobei der Vagusnerv seitlich und unter dem Gefäß liegende Vagusnerv erhalten bleibt (Abbildung 2C1).
7. Legen Sie ein kleines Stück eines Gummihandschuhs und einen mit Kochsalzlösung befeuchteten Wattebausch unter das isolierte rechte CCA als Kissen, um das Gefäß anzuheben und zu stabilisieren.
   HINWEIS: Das Anheben des CCA stabilisiert das Gefäß und ermöglicht eine präzise Punktion und Injektion. (Abbildung 2B4, Abbildung 2C4).
8. Legen Sie zwei nicht festgezogene Knoten mit offenen Schlaufen auf die CCA distal und proximal zum Wattebäusch und binden Sie dann den proximalen Knoten (Abbildung 2B3, Abbildung 2C3).
9. Setzen Sie einen mikrovaskulären Clip auf die CCA nahe dem distalen, nicht festgezogenen Knoten, um den Durchblutungsfluss des CCA vorübergehend zu blockieren (Abbildung 2B4, Abbildung 2C4).
10. Krebszellimplantation
    1. Interlock-Punktus
       1. Stechen Sie das erhöhte Segment des rechten CCA mit einer 32G-Nadel durch, wobei die Schrägung nach oben zeigt.
       2. Ziehen Sie die erste Spritze zurück, während Sie die Einstichstelle beibehalten.
       3. Wirbelmischen Sie die Krebszellsuspension und ziehen Sie 100 μL in die Mikroliter-Spritze, um sicherzustellen, dass keine Luftblasen aspiriert werden.
       4. Führen Sie die Nadelspitze der Mikroliter-Spritze in die in Schritt 3.10.1.1 geschaffene Stichstelle ein und halten Sie sie ruhig, ohne die Injektion zu beginnen, um eine stabile Positionierung vor der Zellabgabe sicherzustellen (Abbildung 2B5, Abbildung 2C5, ergänzende Abbildung 1).
          HINWEIS: Verwenden Sie eine 32G-Spritze für die Punktion und eine Mikroliter-Spritze für die Injektion, um eine stabile Positionierung und kontrollierte Verabreichung zu gewährleisten. Ergänzende Abbildung 1 zeigt die Parameter der beiden Spritzen. Der Außendurchmesser der 32G-Spritze beträgt 0,22 mm, während die Mikroliter-Spritzennadel 0,26 mm beträgt, was sicheres Einführen und kontrollierte Injektion ermöglicht.
    2. Pulsatile Injektion (Abbildung 2C5)
       1. Entfernen Sie den mikrovaskulären Clip, der in Schritt 3.9 angebracht wurde.
       2. Beginnen Sie mit der Injektion der Tumorzellsuspension in die ICA durch die Mikroliter-Spritze.
       3. Geben Sie die Suspension durch eine pulsierende Injektionsbewegung ab, wobei der Spritzenkolben sanft in kleinen Impulsen statt mit kontinuierlichem Druck vorgeschoben wird.
       4. Verabreichen Sie die Suspension nach einem der folgenden Kriterien: dem kardialen Zykluskriterium, wobei alle 8 Herzzyklen ~1 μL Zellsuspension injiziert wird, geleitet durch pulsatile retrograde Blutfluss an der distalen internen Halsschlagader; oder das Einspritzratekriterium, wobei ~1 μL/s injiziert wird, wobei die Geschwindigkeit nicht 60 μL/min überschreitet.
       5. Überwachen Sie das Gefäß während der Injektion. Eine erfolgreiche Abgabe wird angezeigt, wenn das rote Gefäß vorübergehend transparent wird, während die Suspension durch das Lumen fließt, ohne sichtbare Extravasation um die Einstichstelle.
       6. Nach Abschluss der Injektion ziehen Sie die Mikroliter-Spritze vorsichtig heraus.
       7. Ziehen Sie den distalen Knoten sofort kontrolliert fest, um das Gefäß abzudichten und das Erbrechen zu minimieren (Abbildung 2B6, Abbildung 2C6).
          HINWEIS: Die pulsierende Injektion reduziert Überdurchträgung und minimiert das Risiko einer Erhöhung des intrakraniellen Drucks.
11. Mikrochirurgische Reparatur (Abbildung 2B6, Abbildung 2C6)
    1. Verwenden Sie eine 10-0 Nylon-Mikrochirurgennaht, um die Einstichstelle wasserdicht zu schließen und die Nadelein- und Austrittspunkte unmittelbar neben dem Defektrand zu positionieren, um das Gefäßauslaufen zu minimieren und die Öffnung der Lumina zu erhalten.
    2. Führen Sie die mikrochirurgische Nahtnadel unter hoher Vergrößerung durch das Einstichloch in der Gefäßwand und lassen Sie die Naht vorübergehend ungebunden.
    3. Spülen Sie das Operationsfeld mit heparinisierter Kochsalzlösung.
    4. Sichern Sie die Naht mit zwei bis drei quadratischen Knoten.
    5. Schneiden Sie die freien Enden der Naht auf etwa 1–2 mm, um ein Lockern zu verhindern und gleichzeitig die Belastung des Fremdkörpers zu minimieren.
       HINWEIS: Standardchirurgische Verfahren der IPI-Technik und der mikrochirurgischen Reparatur sind im ergänzenden Video 1 beschrieben.

4. Wiederherstellung des Blutflusses des CCA

1. Lockere allmählich den proximalen Knoten.
2. Spülen Sie das Lumen, um mögliches mikroskopisches Gerinnsel zu entfernen. Setzen Sie einen trockenen Wattebäusch in den Operationsbereich, um auf übermäßige Blutungen zu achten.
3. Sobald kein aktiver Erguss von der Stichstelle bestätigt ist, lockern Sie vorsichtig den distalen Knoten, um den Halsschlagaderblutfluss wiederherzustellen (Abbildung 2B7, Abbildung 2C7).

5. Erfolgreiche Reparatur bestätigen

1. Wiederherstellung der Pulsation
   1. Beobachten Sie das CCA auf robuste Pulsationen, was auf eine erfolgreiche Reperfusion hinweist.
2. Überprüfen Sie die Öffnung und die Integrität des Schiffes
   1. Inspizieren Sie die Reparaturstelle, um sicherzustellen, dass sie frei von Stenose ist und das Lumen glatt und verbunden mit dem proximalen Gefäßsegment bleibt.

6. Wundspülung und Verschluss

1. Spülen Sie das Operationsfeld gründlich mit nicht-heparinisierter Kochsalzlösung , um Ablagerungen und Blutgerinnsel zu entfernen.
2. Schließen Sie den Hautschnitt mit einer kontinuierlichen Naht.
   HINWEIS: Pflegen Sie ein feuchtes Operationsfeld und führen Sie alle Manipulationen vorsichtig durch, um Gewebeschäden zu minimieren.

7. Postoperative Versorgung

1. Flüssigkeitsunterstützung: Unmittelbar nach der Operation verabreichen Sie 0,5–1 ml warme, sterile Kochsalzlösung subkutan, um den perioperativen Flüssigkeitsverlust auszugleichen.
2. Infektionsprophylaxe: Wenn die operative Dauer 40 Minuten überschreitet, verabreichen Sie Enrofloxacin (5 mg/kg, einmal täglich) für 3 aufeinanderfolgende Tage. Antibiotika sind nicht erforderlich, wenn der Eingriff weniger als 40 Minuten dauert.
3. Ernährung und Flüssigkeitszufuhr: Geben Sie mindestens eine Woche nach der Operation Hydrogel oder weiche Lebensmittel, um ausreichende Flüssigkeit und Ernährung sicherzustellen.
4. Tägliche Überwachung: Führen Sie tägliche Gesundheitsuntersuchungen durch, wobei Sie auf kreisendes Verhalten, neurologische Defizite, Wundinfektionen und Gewichtsverlust achten.
5. Erwarteter postoperativer Verlauf: Während der ersten 48 Stunden können Mäuse eine verminderte Aktivität, eine leichte Pilokerektion und Gewichtsverlust bis zu 15 % des präoperativen Ausgangswerts zeigen, gefolgt von einer allmählichen Erholung.
6. Analgesie: Meloxicam (5 mg/kg, subkutan) einmal täglich für 2–3 Tage verabreichen, um Schmerzen zu lindern und die Genesung zu fördern.

8. Bewertungskriterien für die erfolgreiche Etablierung eines Tiermodells

1. Körpergewichtsüberwachung
   1. Wiegen Sie die Mäuse täglich und nehmen Sie Ihr Körpergewicht auf.
2. Klinische Beurteilung
   1. Beurteile täglich klinische Anzeichen, einschließlich Haltung und Kreisverhalten.
3. Biolumineszenz-Bildgebung
   1. Schalten Sie die Einschaltschalter des Bildgebungsinstruments und des Computers ein.
   2. Starten Sie die Biolumineszenz-Bildanalyse-Software (Version 4.7.2) und klicken Sie auf "Initialisieren", um das Biolumineszenz-Bildgebungssystem zu initialisieren.
   3. Während der Initialisierung erscheint die Temperaturstatusleuchte auf dem Kontrollpanel des Bildgebungssystems rot. Führen Sie die Bildgebung erst durch, wenn die Temperaturstatusanzeige grün wird.
   4. Vermeiden Sie Mäuse 6 Stunden lang vor der Bildgebenden Nahrung und Wasser, um eine Aspiration während der Anästhesie zu verhindern.
   5. Bereiten Sie das Bildgebungssubstrat mit einer Konzentration von 10 mg/mL vor, das während des gesamten Eingriffs vor Licht geschützt ist. Berechnen Sie das Einspritzvolumen mit 10 μL/g Körpergewicht.
   6. Fesseln Sie die Maus für die Bildgebung. Reinigen Sie die Injektionsstelle im linken Unterbauch mit 75 % medizinischem Alkohol.
   7. Verwenden Sie einen Wattestäbchen, um die Bauchwand an der Injektionsstelle sanft zu stimulieren und so das Risiko zu minimieren, dass die Nadel in den Darm eindringt.
   8. Nach dem Durchstoßen der Bauchwand aspirieren Sie sanft, um das Blutfehlen zu bestätigen, und injizieren Sie dann langsam das bildgebende Substrat in vivo.
   9. Nach 4 Minuten und 30 Sekunden nach der Substratinjektion wird die Maus in eine Anästhesie-Induktionskammer überführt.
   10. Einleiten Sie eine Anästhesie mit 3 % Isofluran. Sobald die Aufricht- und Kneifreflexe verloren sind, reduzieren Sie die Isoflurankonzentration auf 2 % zur Erhaltung.
   11. Setzen Sie die betäubte Maus in die Bildaufnahmekammer und stellen Sie sicher, dass der Nasenkegel Mund und Nase vollständig bedeckt. Schließen Sie die Tür der Bildaufnahmekammer sicher.
   12. Im Bedienfeld des Bildgebungssystems wählen Sie "Lumineszent" als Bildgebungsmodus aus. Stelle die Belichtungszeit manuell auf 60 Sekunden ein. Wählen Sie "Fotografie", "Überlagerung" und "Ausrichtungsraster".
   13. Stellen Sie das Sichtfeld auf D ein, um drei Mäuse zu fotografieren. Stellen Sie die Bildaufnahmehöhe auf 1,5 cm ein. Wählen Sie "Block" für den Anregungsfilter und "Open" für den Emissionsfilter.
   14. 10 Minuten nach der Substratinjektion klicke auf "Acquire", um das Bild aufzunehmen.
   15. Nach der Bildaufnahme navigieren Sie zur Werkzeugpalette und wählen Sie "ROI Tools". Verwenden Sie das Werkzeug "Kreis", um das Interessengebiet (ROI) abzugrenzen, und klicken Sie dann auf "ROIs messen", um quantitative Daten zu erhalten.
4. Histologische Analyse
   1. Man entnimmt Hirngewebe am experimentellen Endpunkt und unterzieht es einer histologischen Analyse.
   2. Identifizieren und bestätigen Sie metastasierte Läsionen mittels Hämatoxylin- und Eosin-(H&E)-Färbung.

9. Humane Endpunkte

1. Um das Tierwohl und die Einhaltung ethischer Standards zu gewährleisten, wurden vordefinierte humane Endpunkte als Kriterien für sofortige Euthanasie festgelegt.
2. Mäuse werden durch Kohlendioxidinhalation (CO₂) eingeschläfert, gefolgt von einer zervikalen Verrenkung als sekundäre physikalische Methode zur Bestätigung des Todes.
3. Eine sofortige Euthanasie sollte durchgeführt werden, wenn eine der folgenden Bedingungen eintritt.
   1. Neurologische Defizite
      1. Motorische Dysfunktion: Ataxie (unsicherer Gang, Schwanken), Kreisen, Lähmung, Hemiparese oder Zittern.
      2. Verhaltens- oder Bewusstseinsänderungen: Lethargie, Benommenheit oder Koma.
      3. Anzeichen eines erhöhten intrakraniellen Drucks: abnormale Haltung (z. B. gekrümmter Rücken, was auf Belastung hinweist) oder Kopfneigung.
      4. Anfälle: generalisierte oder fokale Krampfanfälle.
   2. Veränderungen des Körpergewichts und der physiologischen Funktion
      1. Körpergewichtsverlust von über 20 % oder Unfähigkeit, eigenständig zu essen oder zu trinken, bedingt durch Tumorlast oder starke Schwäche.
      2. Dyspnoe (Keuchen oder Keuchen) oder Harn-/Stuhlinkontinenz.
   3. Tumorstatus
      1. Beenden Sie das Experiment sofort, wenn tumorassoziierte Ulzerationen, Infektionen oder Nekrose festgestellt werden.
   4. Maximal tolerierte Tumorlast
      1. Mäuse unterziehen sich zweimal wöchentlich einer Biolumineszenzbildgebung.
      2. Sobald das intrakranielle Tumorsignal in eine exponentielle Wachstumsphase eintritt (z. B. Verdopplung zwischen zwei aufeinanderfolgenden Bildgebenden), wird die neurologische Überwachung auf zweimal täglich erhöht.
      3. Die Euthanasie wurde unmittelbar nach Beginn von Ataxie oder Krampfanfällen durchgeführt, unabhängig vom Biolumineszenzsignalwert.

Ergebnisse

Biolumineszente Bildgebung und quantitative Analyse
Nach dem standardisierten chirurgischen Protokoll zeigte das optimierte Mausmodell der Gehirnmetastasen stabile intrakranielle biolumineszente Signale bei serieller in vivo Bildgebung postoperativ. Kontinuierliche biolumineszente Bildgebung in vivo (Abbildung 3A) und quantitative Analyse (Abbildung 3B) über 4 Wochen nach der intrakarotisen ...

Diskussion

Robuste präklinische Modelle, die Hirnmetastasen genau nachbilden, sind unerlässlich, um pathophysiologische Mechanismen aufzuklären und die therapeutische Wirksamkeit zu bewerten. Das traditionelle Modell der intrakarotiden Injektion erfordert eine Ligatur der arteria carotis (CCA), was den zerebralen Blutfluss auf nicht-physiologische Weise verändert, potenziell eine ipsilaterale ischämische Verletzung auslöst und die Blut-Hirn-Schranke (

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
10-0 mikrochirurgische Naht mit Nadel	Lingqiao	2650798	Mikrochirurgische Naht zur Reparatur der Punktionsstelle der A. carotis communis
100 µL Mikroliterspritze	Bolige Tools	100UL	Mikroliterspritze für die Tumorzell-Applikation während der pulsierenden Injektion
100 µL Pipette	Eppendorf	3123-000250	Pipette für die Kochsalzlösungsspülung des Operationsfeldes
32G 1 mL Insulinspritze	Kindly	YY0497	Insulinspritze zur Erzeugung der anfänglichen arteriellen Punktionstelle
4-0 Seidennaht	Ethicon	W501	Nähmaterial für den Verschluss des Hautschnitts
4T1 Brustkrebs-Zellinie	Erhalten vom Labor Shengdian Wang, Institut für Biophysik, Chinesische Akademie der Wissenschaften	CRL-2539	Tumorzelllinie zur Modellierung der intrakarotidalen Gehirnmetastasierung
75% Ethanol	Annjet	Q/371402AAJ008	Desinfektionsmittel zur Reinigung der Injektionsstelle
7–8-Wochen alte männliche C57BL/6J Mäuse	Charles River Laboratories	1.10011E+17	Experimentelle Tiere für das B16F10 Gehirnmetastasierungsmodell
8-Wochen alte weibliche BALB/c Mäuse	Charles River Laboratories	1.10011E+17	Experimentelle Tiere für das 4T1 Gehirnmetastasierungsmodell
Kreuzgezackte Zange	Kewo Tools	—	Mikrochirurgische Zange für Gewebedissektion und Gefäßmanipulation
B16F10 Melanom-Zellinie	Erhalten vom Labor Shengdian Wang, Institut für Biophysik, Chinesische Akademie der Wissenschaften	CRL-6475	Melanom-Zellinie zur Modellierung der intrakarotidalen Gehirnmetastasierung
Biolumineszenz-Imaging-Analyse-Software	Living Image (Version 4.7.2)	—	Software zur Analyse von Biolumineszenz-Imaging-Daten
DMEM	Xigong Bio Tech	M1805	Zellkulturmedium für die Erhaltung von Tumorzellen
Enrofloxacin (Antibiotikum)	MCE	HY-B0502	Antibiotikum zur postoperativen Infektionsprophylaxe
Eosin Y Lösung	Beyotime	E301879	Histologischer Färbemittel für die Eosin-Färbung
Augensalbe	Baiyunshan	H44023089	Augensalbe zum Schutz der Augen während der Narkose
Fötales Kalbsserum (FBS)	Pan Sera Tech	ST30-3302	Serumzusatz für Zellkulturmedium
GraphPad Prism	Version 4.7.2	—	Statistische Analyse-Software für Überlebenskurven und quantitative Datenanalyse
Hämatoxylin-Lösung	Beyotime	C0105S	Histologischer Färbemittel für Hämatoxylin-Färbung
Isofluran	H.F.Q. Biotechnology	101357015	Inhalationsanästhetikum, das während der Bildgebungsverfahren verwendet wird
IVIS Spectrum In-vivo-Imaging-System	Lumina Series III	—	Imaging-System für In-vivo-Biolumineszenz-Bildgebung
Meloxicam (Analgetikum)	Qilu Animal Health	150252467	Nichtsteroidales entzündungshemmendes Medikament zur postoperativen Analgesie
Mikrochirurgische Schere	Kewo Tools	—	Mikrochirurgische Schere zur Gewebedissektion
Mini-Gefäßklemme	Zheyong Tools	200521	Mikrovaskuläre Klemme für die vorübergehende Okklusion der A. carotis communis
Nadelhalter	Jiangxin Tools	1420 20Cr13	Chirurgisches Instrument zum Handhaben von mikrochirurgischen Nähten
Paraformaldehyd (4%)	Zhongsheng Wanda Tech	20240411	Fixiermittel zur Konservierung von Hirngewebe vor der histologischen Analyse
Penicillin	Gibco	1758-9324	Antibiotikum für die Zellkultur
Povidon-Iod-Lösung	Sihuanpai	Q/PGSHW0009	Antiseptische Lösung zur chirurgischen Hautdesinfektion
RPMI-1640 Medium	Xigong Bio Tech	12-115F	Zellkulturmedium für das Tumorzellwachstum
Scilogex Mixer	Scilogex	MX-S	Vortex-Mixer zur Homogenisierung von Tumorzellsuspensionen
Dampfanzeigeband	3M-Comply	1322-24MM	Sterilisationsindikator für autoklavierte chirurgische Instrumente
Stereomikroskop	Olympus	SZ61	Mikroskop, das für die Visualisierung während mikrochirurgischer Eingriffe verwendet wird
Zeiss Stemi 508 Stereomikroskop	Zeiss	Stemi 508	Stereomikroskop, das für die hochauflösende chirurgische Visualisierung verwendet wird
Steriles Kochsalz (0,9%)	Kelun	25M14D07	Steriler Spüllösung zur Aufrechterhaltung der Feuchtigkeit des Operationsfeldes
Streptomycin	Gibco	1758-9319	Antibiotikum für die Zellkultur
Chirurgisches Tuch	Dafang	001-2016	Steriles Tuch zur Isolierung des Operationsfeldes
Chirurgische Handschuhe	Ansell Medi-grip	210-64005	Sterile Handschuhe, die bei chirurgischen Eingriffen verwendet werden
Tribromoethanol	Sigma-Aldrich	MKBH0634V	Injektables Anästhetikum für chirurgische Eingriffe
Ultraschall-Doppler	Mindray S7 SCI	—	Hochauflösendes Ultraschallsystem zur Beurteilung des Karotis-Blutflusses