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Methodenartikel

Bronchoskopische Zytologie und metagenomische Sequenzierung zur Differenzierung krebstherapiebedingter und infektiöser Lungenschäden

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DOI:

10.3791/70725

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26. Mai 2026

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1Department of Respiratory Medicine, Center for Pathogen Biology and Infectious Diseases, The First Hospital of Jilin University, 2Pulmonary and Critical Care Medicine Department, First Hospital of Jilin University, 3Department of Thoracic Surgery, The First Hospital of Jilin University

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Hier präsentieren wir ein Protokoll zur Bewertung der bronchoalveolären Spülflüssigkeit (BALF) durch integrierte, bronchoskopiegesteuerte Sammlung, zytologische Analyse und metagenomische Next-Generation-Sequencing (mNGS). Dieser umfassende Arbeitsablauf unterscheidet krebstherapiebedingte Lungenverletzungen präzise von Lungeninfektionen und erleichtert präzise und zeitnahe klinische Entscheidungen.

Zusammenfassung

Patienten mit krebstherapiebedingter Lungenverletzung (CTLI) zeigen häufig unspezifische Atemwegssymptome und radiologische Veränderungen, die einer infektiösen Pneumonie oder Tumorprogression ähneln, was eine erhebliche Herausforderung für eine endgültige Diagnose darstellt. Traditionelle diagnostische Verfahren, die hauptsächlich anhand von Blutbiomarkern und standardisierten mikrobiellen Kulturen bewertet werden, können in der Regel keine eindeutige Diagnose stellen und dauern zu lange. Hier präsentieren wir ein umfassendes Protokoll zur Diagnose von CTLI, indem die zytologische Analyse von bronchoalveolärer Lavagageflüssigkeit (BALF) mit metagenomischer Next-Generation-Sequenzierung (mNGS) kombiniert wird. Der prozedurale Workflow besteht aus drei Hauptphasen. Zunächst wird eine standardisierte Bronchoskopie durchgeführt, um hochwertige BALF-Proben zu erhalten. Zweitens liefert die zytologische Analyse der entnommenen BALF-Proben einen Überblick über die Lungenmikroumgebung. Dies ermöglicht die Identifizierung entzündlicher Merkmale und das Screening auf bösartige Zellen, um das Fortschreiten des Tumors auszuschließen. Schließlich wird mNGS verwendet, um aktive infektiöse Ätiologien zu identifizieren oder auszuschließen. Diese fortschrittliche genomische Technik erreicht eine schnelle, hochsensible und unvoreingenommene Erkennung von Krankheitserregern und überwindet erfolgreich die Einschränkungen traditioneller Kulturen. Repräsentative Ergebnisse mit dieser Methode zeigen, dass dieser Ansatz immunbedingte Pneumonitis effektiv von aktiven Lungeninfektionen oder Tumorprogressionen unterscheiden kann. Im Vergleich zu herkömmlichen diagnostischen Methoden hat dieses Protokoll den Vorteil, CTLI schnell und genau von infektiösen Ätiologien und okkulten Malignitäten zu unterscheiden. Letztlich klärt dieser standardisierte Arbeitsablauf klinische Diagnosen, leitet kritische Behandlungsentscheidungen und verbessert die Patientenergebnisse.

Einleitung

Fortschritte in antitumoralen Behandlungen, wie Immuncheckpoint-Inhibitoren und gezielten Therapien, haben das Überleben der Patienten signifikant verbessert, aber auch die Häufigkeit nicht-infektiöser pulmonaler Toxizitäten, die zusammen als krebstherapiebedingte Lungenverletzung (CTLI) bekannt sind, erhöht1,2,3,4,5,6,7 . Bemerkenswert ist, dass Checkpoint-Inhibitor-Pneumonitis (CIP) als tödliches, immunbezogenes unerwünschtes Ereignis aufgetaucht ist, mit Gesamtinzidenzraten von 2–19 % und Sterblichkeitsraten von bis zu 35 %. Die Diagnose von CTLI stellt eine große klinische Herausforderung dar, da die unspezifischen Atemwegssymptome und radiologischen Manifestationen – wie Bodenglasopazitäten, Konsolidierung oder retikuläre Opazitäten – denen einer infektiösen Pneumonie oder Tumorprogression stark ähneln 11,12,13,14.

Derzeit muss eine CTLI-Diagnose durch sorgfältiges Ausschließen anderer Ätiologien15 festgestellt werden. Traditionelle diagnostische Arbeitsabläufe basieren stark auf Blutbiomarkern und standardisierten mikrobiellen Kulturen, die zeitaufwendig sind und häufig keine endgültige Diagnose liefern 16,17,18,19,20,21,22,23. Obwohl die chirurgische Lungenbiopsie klare histopathologische Belege liefert, macht ihre Invasivität sie für kritisch kranke Krebspatienten ungeeignet. Daher besteht ein dringender Bedarf an einem effektiven, minimalinvasiven diagnostischen Ansatz. In der klinischen Praxis sollte das hier beschriebene Protokoll auf Krebspatienten angewendet werden, die zuvor antitumorale Behandlungen erhalten haben oder derzeit erhalten (z. B. Immuntherapie oder gezielte Therapie) und neue Atemwegssymptome sowie Veränderungen in der Lungenbildgebung vorweisen. Es wird besonders empfohlen, wenn CTLI klinisch vermutet wird, standardmäßige nicht-invasive Tests keine eindeutige Diagnose liefern und der Patient invasive chirurgische Untersuchungen nicht tolerieren kann.

Die Bronchoskopie in Kombination mit bronchoalveolarer Lavage (BAL) dient als minimalinvasive "Flüssigkeitsbiopsie" des unteren Atemwegs24. Durch die Integration der zytologischen Analyse von BAL-Flüssigkeit (BALF) mit metagenomischer Next-Generation-Sequenzierung (mNGS) verbessert dieser Ansatz bestehende diagnostische Arbeitsabläufe erheblich. Erstens liefert die BALF-Zytologie eine direkte Momentaufnahme der pulmonalen Mikroumgebung; es kann charakteristische entzündliche Merkmale25 identifizieren, wie Lymphozytose und ein invertiertes CD4/CD8-Verhältnis bei CIP, während gleichzeitig auf bösartige Zellen gescreent wird, um das Fortschreitendes Tumors auszuschließen. Zweitens erreicht mNGS eine schnelle, hochsensible und unvoreingenommene Erkennung von Krankheitserregern und überwindet damit die niedrigen Nachweisraten und Verzögerungen traditioneller Kulturen, insbesondere bei anspruchsvollen Bakterien oder atypischen Krankheitserregern. Die kombinierte Anwendung dieser Methoden hat gezeigt, dass sie die Erkennung gemischter Infektionen signifikant verbessert und präzise Behandlungen leitet, wodurch die Patientensterblichkeit drastisch reduziertwird 4,5.

Trotz dieses klinischen Potenzials gibt es derzeit kein standardisiertes Protokoll für umfassende BALF-Entnahme und -Analyse im Kontext von CTLI. Hier stellen wir ein standardisiertes Protokoll zur Gewinnung und Verarbeitung von BALF mittels Bronchoskopie vor, das explizit zytologische Evaluation mit mNGS kombiniert. Die methodische Neuheit dieses Workflows liegt in seiner zweigleisigen diagnostischen Fähigkeit: Er nutzt die Zytologie, um die Immunmikroumgebung zu kartieren und Malignität auszuschließen, zusammen mit mNGS, um aktive Infektionen endgültig auszuschließen oder auszuschließen. Im Vergleich zu traditionellen diagnostischen Methoden bietet dieses integrierte Protokoll den deutlichen Vorteil, CTLI schnell und präzise von infektiösen Ätiologien und okkultem Tumorprogression zu unterscheiden. Letztlich beschleunigt dieser standardisierte Arbeitsablauf den diagnostischen Zeitplan und leitet zeitna, gezielte klinische Interventionen (Abbildung 1).

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Protokoll

Dieses Protokoll folgt den Grundsätzen der Helsinkier Erklärung und wurde vom institutionellen Überprüfungsgremium unseres Krankenhauses genehmigt. Vor dem Eingriff wurde von allen Teilnehmern eine informierte Zustimmung eingeholt.

1. Vorbereitung vor dem Eingriff

  1. Patientenbegutachtung (innerhalb einer Woche nach der Bronchoskopie)
    1. Erholen Sie aktuelle Labortests, einschließlich vollständiger Blutbild und Gerinnungsprofil, um die Sicherheit eines invasiven Eingriffs zu gewährleisten (Ergänzungsakte 1).
    2. Führe ein 12-Leitungs-Elektrokardiogramm durch.
    3. Vitalwerte bewerten und die hämodynamische Stabilität sicherstellen.
    4. Missen Sie die Ruhe-Sauerstoffsättigung des Patienten an der Raumluft, um die Lungenfunktion zu bewerten.
      HINWEIS: Wenn der SpO₂ niedrig ist oder der Patient eine Atemwegsschwäche hat, sollten Sie eine arterielle Blutgasanalyse für den Ausgangswert PaO₂/PaCO₂ in Betracht ziehen.
    5. Screenen Sie auf alle Kontraindikationen.
    6. Weisen Sie den Patienten an, mindestens 6 Stunden zu fasten und 2 Stunden vor dem Eingriff kein Wasser zu trinken, um das Aspirationsrisiko zu verringern.
    7. Führen Sie unmittelbar vor dem Eingriff eine orale und nasale Absaugung und Reinigung durch, um eine Kontamination der oberen Atemwege zu minimieren.
  2. Ausrüstung und Personalvorbereitung
    1. Bereiten Sie alle erforderlichen Bronchoskopiegeräte und Überwachungsgeräte vor. Wählen Sie eine geeignete Bronchoskopgröße basierend auf der Atemwegsanatomie des Patienten. Überprüfen Sie die Absaugfunktion des Bronchoskops.
      HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass Notfall-Wiederbelebungsgeräte, einschließlich zusätzlicher Sauerstoffzufuhrgeräte und Absauggeräte, sofort im Behandlungsraum verfügbar sind, um mögliche Atemwegskomplikationen zu bewältigen. Jeder Facharzt für Bronchoskope mit Standardausbildung kann dieses Verfahren ohne spezielle Zertifizierungen eigenständig durchführen.
    2. Erwärmen Sie die sterile physiologische Kochsalzlösung (0,9 % NaCl), die für die Spülung vorgesehen ist, auf 37 °C.
    3. Ziehen Sie 100–150 ml der erwärmten sterilen Kochsalzlösung in mehrere 20-mL-Spritzen auf, um eine schnelle Instillation zu ermöglichen.
  3. Patientenpositionierung und Überwachungseinrichtung
    1. Legen Sie den Patienten im Rücken auf den Bronchoskopietisch.
    2. Installieren Sie vor Beginn des Eingriffs kontinuierliche Überwachungsgeräte für den Patienten.
      1. Führen Sie Elektrokardiogramm-(EKG)-Leitungen direkt auf die Brust des Patienten an, um die kontinuierliche Herzaktivität zu überwachen.
      2. Verbinden Sie eine Pulsoximeter-Sonde am Finger des Patienten, um die Sauerstoffsättigung und den Puls im Blut kontinuierlich zu überwachen.
      3. Befestigen Sie eine nicht-invasive Blutdruckmanschette am Oberarm des Patienten, um kontinuierlich den venösen Blutdruck zu messen.
  4. Aufbau und Entwöhnung des Sauerstoffunterstützungsgeräts nach dem Eingriff
    1. Bereiten Sie das geeignete Sauerstoffunterstützungsgerät basierend auf dem Atemstatus des Patienten vorher vor und konfigurieren Sie es. Führen Sie diese Konfiguration vor Beginn der Bronchoskopie durch.
    2. Hochfluss-Nasenkanüle (HFNC) Aufbau
      1. Wählen Sie ein HFNC-System für Patienten mit einemSpO-2 ≥ 90 % auf Raumluft und ohne Hyperkapnie. Verbinden Sie die Kanüle mit dem Patienten und stellen Sie die Anfangsgasdurchflussrate auf ≥60 L/min mit einem FiO2 von 1,0 ein. Titrieren Sie dasFiO2 während des Eingriffs kontinuierlich, umSpO2 ≥ 90 % zu halten.
    3. Übergangsstrategie für Patienten mit nicht-invasiver Beatmung (NIV)
      1. Entfernen Sie die NIV-Maske und stellen Sie den Patienten unmittelbar vor dem Einsetzen des Bronchoskops in ein HFNC-System um. Stellen Sie die HFNC-Gasdurchflussrate auf ≥60 L/min mit einem FiO2 von 1,0 ein. Führen Sie während der unmaskierten Phase aktive Atemwegssaugung durch, um Sekrete zu entfernen und die Öffnung der Atemwege zu optimieren.
      2. Überwachen Sie den Patienten während des vorübergehenden Übergangs von NIV zu HFNC genau auf Entsättigung. Wenn der SpO₂ unter 90 % fällt und weiterhin absaugbar und maximal HFNC-Einstellungen bleibt, brechen Sie die Bronchoskopie sofort ab. Setzen Sie die NIV-Maske umgehend wieder auf, um den positiven Druck wiederherzustellen, oder eskalieren Sie zu einer invasiven endotrachealen Intubation, falls sich der Atemweg des Patienten verschlechtert.
    4. Invasive mechanische Beatmung (IMV)-Einrichtung
      1. Setzen Sie das Gezeitenvolumen auf 6–8 mL/kg des vorhergesagten Körpergewichts, FiO₂ auf 1,0, den positiven Endexspiratoriedruck (PEEP) auf 5–8 cmH₂O und die Atemfrequenz auf 12–16 Atemzüge/min. Führen Sie das Bronchoskop direkt durch den etablierten Endotrachealrohr ein.
    5. Kontinuierliche Überwachung der Vitalzeichen nach Abschluss der bronchoalveolaren Lavage (BAL) aufrechterhalten. Titrieren Sie zusätzlichen Sauerstoff, umSpO2 zwischen 92 % und 96 % zu erhalten (bzw. 88 % bis 92 % bei Patienten mit chronischer Hyperkapnie).
    6. Überprüfen Sie, ob der Patient alle folgenden Kriterien erfüllt, bevor Sie die Sauerstoffunterstützung reduzieren: vollständiges Aufkommen aus der Sedierung, Wiederherstellung der schützenden Atemwegsreflexe, hämodynamische Stabilität und das Fehlen aktiver Blutungen oder schwerer Bronchospasmus.
    7. Beim HFNC-Absetzen deeskalieren Sie zuerst die Konzentration, gefolgt von der Durchflussrate. Verringere den FiO₂ in 5 % bis 10 % Schritten, bis ≤40 % erreicht wird. Anschließend wird die Durchflussrate in Schritten von 5 % bis 10 % reduziert. Beenden Sie das HFNC vollständig, wenn der Patient das Ziel-SpO₂ mit einem FiO₂ ≤ 35 % und einer Durchflussrate ≤ 20 L/min beibehält.
    8. Beim NIV-Absetzen sollte die Hypoxämie verbessert und die Vitalwerte stabil bleiben, und dann eine von zwei Methoden anwenden:
      1. Verringere den IPAP pro Anpassung um 2–3 cmH₂O, senke PEEP auf 4–5 cmH₂O und senke FiO₂ auf ≤40%.
      2. Beim intermittierenden Absetzen wird der Patient auf HFNC umgestellt, um die Dauer des spontanen Atmens zu erleichtern und allmählich zu verlängern. Setzt sofort die vollständige NIV-Unterstützung wieder ein, wenn der Patient Tachypnoe (>30 Atemzüge/min), Tachykardie (>140 Schläge/min), Atemmuskelmüdigkeit, veränderten Geisteszustand oder SpO₂ < 90 % zeigt.
    9. Für das Absetzen des IMV führen Sie einen spontanen Atemtest oder einen Manschettenlecktest durch. Erst nach erfolgreichem Bestehen der Studie, ausreichender spontaner Hustenstärke und minimaler Atemwegssekrete wird die Extubation durchgeführt.
  5. Sedierung und Anästhesie
    1. Injizieren Sie 15 ml 2 % Lidocain in die Nasenschleimhaut und den Oropharynx, aufgeteilt in 2–5 Dosen.
    2. Geben Sie 10 ml 2% Lidocain in geteilten Dosen über den Arbeitskanal des Bronchoskops ein. Wenden Sie diese Dosen Schritt für Schritt an, während Sie das Bronchoskop in die Atemwege schieben, um die Trachealschleimhaut, die Carina und den Bronchialbaum zu bedecken.
      HINWEIS: Die absolut maximal sichere Dosis von topischem Lidocain ist ungewiss. Toxizität tritt üblicherweise auf, wenn die Serumkonzentration 5 μg/mL übersteigt, aber subjektive Nebenwirkungen können bei niedrigeren Konzentrationen auftreten. Verfolgen Sie sorgfältig das gesamte Volumen des verabreichten Betäubungsmittels.
    3. Verabreichen Sie systemische Sedierung je nach Patientenpräferenz, Angstgrad und erwarteter Behandlungstoleranz, um eine angemessene Anästhesie sicherzustellen, den Komfort des Patienten zu maximieren und Husten zu reduzieren. Midazolam 2–2,5 mg per langsamer intravenöser Injektion verabreichen oder die Dosis auf 0,5–1 mg für gebrechliche oder ältere Patientenreduzieren, 36 mg.
    4. Monitoring SpO₂, EKG und nicht-invasiver Blutdruck (NIBP) werden kontinuierlichangewendet 37.
      HINWEIS: Systemische Sedierung erhöht das Risiko für refraktäre Hypoxämie, Atemwegskollaps und Notintubation der Luftröhre deutlich. Überwachen Sie den Patienten während des gesamten Eingriffs genau.

2. BAL-Verfahren

HINWEIS: Führen Sie das BALF-Entnahmeverfahren strikt gemäß Standardprotokollen und klinischen Richtlinien durch.

  1. Auswahl des Ziellungensegments (Abbildung 2)
    1. Überprüfen Sie vor dem Eingriff die aktuellste hochauflösende Thorax-Computertomographie (HRCT) des Patienten, um die genaue anatomische Verteilung der Lungenerkrankung zu bestimmen.
    2. Wählen Sie das Zielsegment für den BAL basierend auf der spezifischen Krankheitsverteilung, die im HRCT-Scan identifiziert wurde.
    3. Lenken Sie das Bronchoskop an, die Lavage im am stärksten radiographisch betroffenen Segment oder in dem Segment durchzuführen, das den schnellsten Fortschreiten bei lokalisierten oder deutlich asymmetrischen Erkrankungen zeigt.
    4. Richten Sie das Bronchoskop darauf, entweder den rechten mittleren Lappen oder die lingula des linken oberen Lappen bei diffusen oder symmetrischen Erkrankungen zu spülen, da diese anatomischen Stellen typischerweise eine ausreichende Flüssigkeitsrückgabe liefern.
  2. Prelavage und Probenabwurf
    1. Geben Sie 20–30 ml erwärmtes Kochsalzlösungsmittel durch das Bronchoskop in das Keilsegment. Warte 20–30 Sekunden.
    2. Wenden Sie einen sanften Saugeffekt (Unterdruck 50–100 mmHg) an, um die Flüssigkeit zurückzusaugen. Sammeln Sie dieses erste Aliquot in eine Falle und entsorgen Sie es, ohne es zur Analyse zu schicken, da es Schleim und Bronchialreste enthalten kann.
  3. Hauptlavageverfahren
    1. Schließen Sie eine sterile Spritze mit 0,9 % Normalsalzlösung fest an den Arbeitskanal des Bronchoskops an.
    2. Injizieren Sie 20 ml Kochsalzlösung über den Arbeitskanal über 3–5 Sekunden. Nach der Injektion wird sofort 5–10 Sekunden pausiert, damit sich die Flüssigkeit vollständig verteilt und durch die Schwerkraft in die distalen alveolaren Räume absinken kann.
    3. Wenden Sie einen sanften Saug an, um die eingestillte Flüssigkeit in eine sterile Sammelfalle zurückzugewinnen. Halten Sie einen Saugdruck unter 100 mmHg, um einen erheblichen Kollaps der Atemwege oder Schäden an der Atemwegsschleimhaut zu vermeiden.
    4. Wiederholen Sie die Instillations-, Pause- und Absaugsequenz strikt, bis das gesamte infusierte Volumen zwischen 100 und 150 mL liegt, um sicherzustellen, dass die Probe der unteren Atemwege ausreichend und repräsentativ ist.
      HINWEIS: Überwachen Sie während des gesamten Eingriffs kontinuierlich die Vitalzeichen, die Sauerstoffsättigung und das Wohlbefinden des Patienten. Unterbrechen Sie den Eingriff sofort, wenn starker Husten oder Entsättigung auftritt, und setzen Sie sie erst fort, wenn sich der Patient stabilisiert hat.
  4. Flüssigkeitsrückgewinnungstechnik
    1. Verwenden Sie einen niedrigen Saugdruck (≤100 mmHg), um einen Kollaps der Atemwege zu vermeiden.
    2. Verwenden Sie eine "gepulste Absaugtechnik" anstelle der kontinuierlichen Absaugung: Verschließen und lösen Sie den Saugschlauch zwischendurch ab, damit Luft sich einmischen kann, die Flüssigkeit mobilisiert und verhindert, dass der Bronchus gegen das Skop kollabiert.
    3. Zielen Sie auf eine Rückgewinnung von mindestens 40–60 mL BALF ab.
      HINWEIS: Beenden Sie die Spülung, wenn der Patient Komplikationen entwickelt (z. B. Bronchospasmus, unerträgliche Hypoxämie), auch wenn das volle Volumen nicht wiederhergestellt ist. Halten Sie die gesamte Behandlungszeit für BAL-Instillation und -Aspiration unter 2–3 Minuten, um das Hypoxie-Risiko zu minimieren.
  5. Postlavage-Pflege
    1. Ziehen Sie das Bronchoskop nach Abschluss der BAL vorsichtig ab.
    2. Saugen Sie alle verbleibenden Sekrete aus den zentralen Atemwegen.
      HINWEIS: Setzen Sie die HFNC- oder NIV-Unterstützung fort, falls sie genutzt werden, bis der Patient in der Genesung stabil ist. Überwachen Sie den Patienten auf postoperative Komplikationen wie Blutungen oder Pneumothorax.

3. Probenhandhabung und Qualitätskontrolle

  1. Messung, Transport und Erstbewertung des BALF
    1. Zeichnen Sie das Volumen der zurückgeführten Flüssigkeit im Vergleich zu dem unmittelbar während des Eingriffs eingebrachten Volumen.
    2. Berechnen Sie den Rückgewinnungsprozentsatz mit folgender Formel:
      Erholungsprozentsatz = (wiedergewonnenes Volumen / Volumen eingebaut) × 100 %
      HINWEIS: Eine Rückgewinnung von ≥30 % gilt allgemein als gute BALF-Probe.
    3. Legen Sie das gesammelte BALF sofort auf Eis. Transportieren Sie das BALF umgehend ins Labor.
      VORSICHT: Humane BALF-Proben sind potenziell ansteckend. Behandle alle Proben mit angemessenen Standardvorsichtsmaßnahmen.
    4. Beobachten und dokumentieren Sie die makroskopische Farbe und Trübheit der BALF-Probe vor der Verarbeitung.
      HINWEIS: Klare oder blass gelbe Flüssigkeit ohne sichtbare Trübung ist typisch für nicht-infektiöse Zustände. Ein trübes oder milchiges Erscheinungsbild ist mit der pulmonalalveolären Proteinose (PAP)38 verbunden. Eizige Flüssigkeit deutet auf eine mögliche bakterielle Infektion hin. Blutgetönte Flüssigkeit deutet auf mögliche Blutungen oder diffuse alveolare Blutunghin 39.
  2. Bewertung der Zelllebensfähigkeit
    1. Verdünnen Sie das BALF auf eine Konzentration von etwa 1 × 106 Zellen/mL mit steriler physiologischer Kochsalzlösung.
    2. Mische das verdünnte BALF mit Trypanblau im Volumenverhältnis von 1:1, um eine 20-μL-Reaktionsmischung zu erhalten.
      VORSICHT: Trypanblau ist eine giftige Chemikalie und ein vermuteter krebserregender Stoff.
    3. Inkubieren Sie das Reaktionsgemisch 3 Minuten bei Raumtemperatur (ca. 25 °C).
    4. Setze die Mischung auf ein Hämozytometer. Untersuchen Sie die Zellen unter einem Mikroskop mit geringer Energieversorgung.
    5. Zählen Sie mindestens 200 Zellen, um systematisch die Lebensfähigkeit der Zellen zu bestimmen.
      HINWEIS: Lebensfähige Zellen bleiben unverfärbt, transparent und morphologisch intakt, während nicht lebensfähige Zellen den blauen Farbstoff aufnehmen. Eine anfängliche Zelllebensfähigkeit von >90–95 % ist erforderlich, um zuverlässige nachgelagerte zytologische Zählungen sicherzustellen.
  3. Aliquot-Verteilung
    1. Teilen Sie das BALF in spezielle Röhren auf, um während der Spülung verschiedene Analysen zu erhalten.
    2. Bekenne Röhre 1 als "verworfen" für den ersten zurückgekommenen Aliquot.
    3. Wähle Tube 2 für die Mikrobiologie und setze 10–20 ml BALF für die Pathogen-Vorbereitung (z. B. mNGS) zu.
      HINWEIS: Führen Sie routinemäßig bakterielle Gramfärbung/-kultur, Pilzfärbung/-kultur, Säurefast-Bazillen-(AFB)-Abstrich und PCR gleichzeitig in der klinischen Praxis durch.
    4. Röhre 3 für die Zytologie festlegen und mindestens 10 ml für Gesamt- und Differenzzellzählungen reservieren.
    5. Setze Röhrchen 4 als optionale Reserve und lagere die verbleibende Flüssigkeit (bei 4 °C für kurzfristige oder -80 °C für längere Phasen) für weitere Tests.
      HINWEIS: Frieren Sie die mNGS-Probe sofort bei -80 °C ein, falls die Tests nicht sofort beginnen können. Prozesszytologie-Proben frisch; bei erwarteter Verzögerung wird die Probe bei bis zu 24 Stunden bei 4 °C gekühlt, um die Zellmorphologie zu erhalten.

4. Laborverarbeitung von BALF

  1. Gesamtzellanzahl
    1. Wenden Sie das Rohr um, um das BALF vorsichtig zu mischen und die Zellen wieder zu suspendieren.
    2. Verdünnen Sie das BALF mit einem angemessenen Volumen steriler physiologischer Kochsalzlösung, wenn die Probe makroskopische Schleimstopfen und Ablagerungen enthält.
    3. Befeuchten Sie ein Stück steriler medizinischer Mullbinde vor der Filtration gründlich mit steriler Kochsalzlösung. Filtern Sie die verdünnte Probe durch zwei Schichten des vorbenetzten sterilen medizinischen Gaze.
    4. Sammeln Sie das Filtrat in ein steriles Sammelrohr. Zählen Sie die Gesamtzahl der nuklearen Zellen mit einem Hämatologie-Analysator.
      HINWEIS: Eine geringe Kontamination der Epithelzellen (<5 % der Zellen) und ein minimaler Anteil roter Blutkörperchen (<10 %) deuten auf eine hochwertige alveolare Probe hin.
  2. Differenzielle Zellanzahl
    1. Übertragen Sie 1 ml der gut gemischten BALF-Probe in eine 1,5 mL Mikroröhre. Zentrifugiere die Mikroröhre bei 211 × g für 5 Minuten, um die Zellen zu konzentrieren.
    2. Entfernen Sie das Supernatantum, sodass genau 50–100 μL Flüssigkeit im Mikrorohr bleibt. Suspendieren Sie das Zellpellet gründlich in dem verbleibenden Supernatanten.
    3. Pipette 10–20 μL der resuspendierten Zellsuspension auf die Oberfläche eines sauberen Glasträgers, nahe dem mattierten Rand.
    4. Halten Sie einen zweiten, sauberen Glas-Objektträger in einem Winkel von 30–45° zum ersten Objektträger. Schieben Sie den zweiten Verschluss mit einer sanften Keilschmiertechnik nach vorne, um einen dünnen, gleichmäßigen Zellabstrich zu erzeugen.
    5. Wiederholen Sie die Schritte 4.2.3 bis 4.2.4, um 2–3 identische Folien vorzubereiten.
    6. Lassen Sie die verschleierten Objektträger bei Zimmertemperatur vollständig an der Luft trocknen.
    7. Färben Sie die Objektträger mit der Wright-Giemsa-Methode.
    8. Betrachten Sie die gefärbten Objektträger unter einem Lichtmikroskop mit einem Hochleistungs-Ölimmersionsobjektiv (1.000× Vergrößerung).
    9. Identifizieren und kategorisieren Sie mindestens 400 Zellen, um die differenzielle Zellanzahl zu bestimmen.
      HINWEIS: Bewahren Sie alle BALF-Proben mit hohem klinischen Krebsverdacht bei 4 °C auf und senden Sie sie innerhalb von 2 Stunden nach der Probenentnahme an das zentrale Pathologielabor zur standardisierten Zytozentrifugation.
  3. mNGS-Pipeline
    1. Inaktiviere die bronchoalveoläre Lavage-Probe (BALF), indem du sie 30 Minuten bei 65 °C inkubierst.
    2. Übertragen Sie 0,5 ml der inaktivierten BALF-Probe in ein 1,5 ml Mikrozentrifugenrohr mit 1 g 0,5 mm Glasperlen.
    3. Befestigen Sie das Mikrozentrifugenrohr an einer horizontalen Plattform auf einem Wirbelmischer. Rühren Sie die Mischung 30 Minuten lang mit 2.800–3.200 U/min um, um mechanische Zerstörung der mikrobiellen Zellwand und die anschließende DNA-Freisetzung zu erleichtern.
    4. Zentrifugiere das Rohr kurz, um die Perlen zu senken, und übertrage vorsichtig 0,3 ml des Überstandsmittels in ein neues 1,5 mL Mikrozentrifugenrohr.
    5. Entfernen Sie die gesamte Nukleinsäure aus dem Supernatant mit einem Mikrovolumen-DNA-Extraktionsset und folgen Sie strikt den Anweisungen des Herstellers.
    6. Misse die Konzentration der extrahierten DNA mit einem Fluorometer.
    7. [PAUSENPUNKT] Lagern Sie die extrahierte DNA bei -20 °C für den kurzfristigen Gebrauch oder bei -80 °C zur Langzeitlagerung, falls die Bibliothek nicht sofort vorbereitet wird.
    8. Konstruiere die Metagenomik-Bibliotheken aus der extrahierten DNA mithilfe eines ultra-niedrigen Input-Bibliotheks-Vorbereitungskits.
    9. Inspizieren Sie die konstruierten Bibliotheken, um angemessene Fragmentgrößen und ausreichende Konzentration sicherzustellen.
    10. Sequenzieren Sie die qualifizierten Bibliotheken auf einer Hochdurchsatz-Sequenzierungsplattform.
  4. Analyse der Sequenzierungsdaten
    1. Beseitigen Sie minderwertige Lese- und Adaptersequenzen aus den Rohsequenzdaten mit Sequenzverarbeitungssoftware.
    2. Discard liest mit einer Länge kürzer als 35 Basenpaare (bp), Reads mit geringer Komplexität und Reads mit einem Phred-Qualitätswert (Q-Score) unter 20.
    3. Richten Sie die hochwertigen Lesungen mit einem Burrows-Wheeler-Ausrichtungsalgorithmus auf das menschliche Referenzgenom (Version hg38) aus, um menschliche DNA-Sequenzen zu identifizieren.
    4. Verwerfen Sie die ausgerichteten menschlichen Host-Sequenzen, um die Nicht-Host-Sequenzierungsdaten zu isolieren.
    5. Blast die verbleibende Nicht-Wirt-Sequenzierung liest gegen eine Klassifikationsdatenbank, um mikrobielle Informationen auf Artebene zu erhalten. Stellen Sie die Datenbank auf Basis veröffentlichter mikrobieller Genomdatenbanken zusammen, wie der Referenzsequenzdatenbank des National Center for Biotechnology Information (NCBI). Stellen Sie sicher, dass umfassende Krankheitserregerdaten enthalten sind (z. B. 25.863 Krankheitserreger, darunter 12.142 Bakterien, 2.680 Pilze, 10.061 Viren, 654 Parasiten, 206 Mykobakterien und 120 Mykoplasma/Chlamydien).
    6. Stellen Sie negative ('Keine Vorlage'-Kontrolle, NTC) und positive Kontrollen her, indem Sie sie durch identische Extraktions-, Bibliotheksvorbereitungs- und bioinformatische Analyseverfahren verarbeiten.
    7. Untersuchen Sie die streng abgebildete Lesezahl (SMRN) und die genomische Abdeckung für die diagnostische Beurteilung.
      HINWEIS: SMRN bezeichnet die Anzahl der Sequenzen, die auf Artebene genau mit dem Mikroorganismus ausgerichtet sind.
    8. Klassifizieren Sie ein bakterielles, pilz-, Mycoplasma- oder Chlamydien-MNGS-Ergebnis als positiv, wenn der Mikroorganismus im NTC nicht nachgewiesen wird UND seine genomische Abdeckung zu den Top 10 der Mikroben derselben Gattung gehört, ODER wenn das Verhältnis von SMRN_sample zu SMRN_NTC > 10 beträgt (wenn SMRN_NTC ≠ 0 ist).
    9. Bestätigen Sie, dass die SMRN_sample die folgenden Mindestschwellenwerte für ein positives Ergebnis erfüllt: ≥3 für Bakterien, Pilze, Mykoplasmen und Chlamydien; ≥100 für Parasiten; und ≥1 für Mycobacterium tuberculosis.
    10. Klassifizieren Sie ein virales MNGS-Ergebnis als positiv, wenn das Virus im NTC nicht nachgewiesen wird, ODER wenn das Verhältnis von SMRN_sample zu SMRN_NTC >5 beträgt (bei SMRN_NTC ≠ 0).
    11. Bestätigen Sie, dass der SMRN_sample für Viren ≥1 ist.
    12. Erstellen Sie eine Liste von Kandidatenpathogenen zusammen mit deren Lesezahlen oder relativen Häufigkeiten.
    13. Erfassen Sie alle Antibiotikaresistenzgene oder Virulenzfaktoren, die durch die bioinformatische Pipeline identifiziert wurden.
    14. Definieren Sie einen signifikanten Treffer, indem Sie die Anzahl der Reads, den statistischen Vergleich mit Kontrollgruppen und die klinische Relevanz kombinieren.
    15. Bewerten Sie, ob jeder identifizierte Erreger die klinische Situation erklären kann.

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Ergebnisse

Durch die Befolgung des oben genannten standardisierten Protokolls können Kliniker hochwertige BALF-Proben reproduzierbar erhalten und sowohl zelluläre als auch genomische Analysen nutzen, um CTLI von seinen Nachahmern zu unterscheiden. Im Folgenden präsentieren wir ein repräsentatives Ergebnis aus unserem Fall, um typische Ergebnisse zu veranschaulichen. Eine 68-jährige Frau mit schlecht differenziertem Lungenkrebs im Stadium IV (primärer Tumor der rechten Pleuraregion) mit Pembrolizuma...

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Diskussion

In der heutigen Ära der Krebstherapie bleiben behandlungsbedingte Organverletzungen, wie sie durch Immuncheckpoint-Inhibitoren (ICIs) verursacht werden, ein großes klinisches Problem, das den Behandlungsfortschritt einschränken oder sogar lebensbedrohlich sein kann 3,4. Unter den durch ICI induzierten immunbezogenen Nebenwirkungen (irAEs) hat die Pneumonitis als Hauptursache für tödliche Ereignisse große Aufmerksamkeit erlangt

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Offenlegungen

Die Autoren erklären, dass sie keine konkurrierenden Interessen haben.

Erklärung der KI-Unterstützung:
Die Autoren erklären den Einsatz von KI-unterstützten Technologien während der Vorbereitung dieses Manuskripts. Konkret wurde Gemini by Google ausschließlich verwendet, um die englische Sprache zu verfeinern, grammatikalische Fehler zu korrigieren und sicherzustellen, dass die strukturelle Formatierung den Richtlinien der Zeitschrift entsprach. Das KI-Werkzeug wurde nicht zur Datengenerierung, Analyse oder zur Interpretation wissenschaftlicher Ergebnisse verwendet. Alle Autoren haben den erstellten Text gründlich geprüft, notwendige Änderungen vorgenommen und die volle Verantwortung für die wissenschaftliche Genauigkeit und Integrität des endgültigen Manuskripts übernommen.

Danksagungen

Diese Arbeit wurde durch das Health Technology Capacity Improvement Project der Jilin Provincial Health Commission (Zuschussnummer 2023JC007) unterstützt.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
2 % LidocainHunan KelunN/ALokalbetäubung für die Atemwegsschleimhaut.
0,5 mm GlasperlenSigmaN/AWird zur mechanischen Zerstörung der Zellwand von Mikroben verwendet.
BF-260 elektronisches BronchoskopOlympusN/ADas Bronchoskop wird verwendet, um alveolare Lavageflüssigkeit zu gewinnen.
Bau-Rad-AusrichtungOpen Source0.7.17(RRID:SCR_010910)Algorithmus zur Abbildung von Sequenzen auf das menschliche Genom.
Hochdurchfluss-Instrument zur befeuchteten SauerstofftherapieBMC MedicalN/ABieten Sie Patienten mit spontaner Atmung einen bestimmten Durchfluss, erhitztes und befeuchtetes Atemgas.
Vortex-MixerWissenschaftlich  IndustrienN/AWissenschaftliche Industrien
MidazolamJiangsu EnhuaN/ASystemisches Beruhigungsmittel für das Wohlbefinden der Patienten.
Nextseq 550 PlattformIlluminaN/ADie Gensequenz zur Sequenzierung des Genoms in BALF
QIAseq Ultralow Input Library KitTiangenN/AKit zum Aufbau einer metagenomischen Bibliothek
Qubit 4.0Thermo Fisher ScientificN/AInstrument zur Erkennung des BALF-Nukleinsäuregehalts
TIANamp Micro DNA Kit DP316TiangenN/ADas DNA-Extraktionskit zur Gewinnung der gesamten Nukleinsäuren aus BALF
Trypan blauBiosharpN/AFarbstoff, der zur Bewertung der Zelllebensfähigkeit verwendet wird.
  WasserbadJoanN/AVerwendet bei der BALF-Probeninaktivierung bei 65 μ°C.
Wright-Giemsa-FleckYuanmuN/AVerwendet für die Differenzzellfärbung.
XN-9000 Hämatologie-AnalysatorSysmexSN-13699Hämatologie-Analysator zur Erfassung der Gesamtzahl der nukleierten Zellen aus der BALF-Probe

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