In vitro Funktionelle Analyse regulatorischer T-Zellen: Fokus auf Proliferation und Differenzierung

Zusammenfassung

Dieses Protokoll bietet eine In-vitro-Kokulturstrategie zur Untersuchung der Auswirkungen regulatorischer T-Zellen auf die Proliferation und Differenzierung von Effektor-T-Zellen.

Zusammenfassung

Regulatorische T-(Treg-)Zellen spielen eine Schlüsselrolle bei der Aufrechterhaltung der Immunhomöostase. Anomalien der Treg-Zellfunktion stehen im Zusammenhang mit verschiedenen Krankheiten, darunter Autoimmunerkrankungen, Abstoßung von Organtransplantationen, Infektionen und Krebs. Die Manipulation von Treg-Zellen wird als potenzielle therapeutische Strategie zur Behandlung entzündlicher Erkrankungen betrachtet, darunter Autoimmunerkrankungen, Abstoßung durch feste Organtransplantationen, Transplantat-gegen-Wirt-Erkrankungen und allergische Erkrankungen. Klassische in vitro Treg-Zellsuppressions-Assays untersuchen hauptsächlich die hemmende Wirkung von Treg-Zellen auf die Proliferation von Effektor-T (Teff-Zellen). Neben der Proliferation ist die T-Zell-Differenzierung jedoch wichtig, damit T-Zellen ihre Immunfunktionen erfüllen können. Daher bietet dieses Protokoll einen modifizierten in vitro Treg-Cellsuppressionstest zur Untersuchung der Auswirkungen von Treg-Zellen auf die Proliferation und Differenzierung von Teff-Zellen. In diesem Protokoll wird zunächst die Präparation von Maus-Treg Zellen und naiven T-Zellen eingeführt, gefolgt von der Kokultur-Strategie zur Untersuchung der regulatorischen Effekte von Treg-Zellen auf die Proliferation und Differenzierung von Teff-Zellen, einschließlich Th1- und Th17-Zellen, und schließlich der Färbungsstrategie für die Durchflusszytometrie nach der Kokultur. Diese in-vitro-funktionale Analyse von Treg-Zellen kann verwendet werden, um die Auswirkungen von Treg-Zellen auf die Proliferation und Polarisation von T-Zellen zu untersuchen.

Einleitung

CD4⁺CD25⁺Foxp3⁺ regulatorische T-Zellen (Treg) sind wichtige Vermittler der Immunhomöostase¹. Trek-Zellen unterdrücken aktiv übermäßige Immunreaktionen und behalten eine Selbstimmuntoleranz, wodurch verhindert wird, dass Immunreaktionen normale Gewebe und Organe schädigen². Die Manipulation von Treg-Zellen gilt als potenzielle therapeutische Strategie zur Behandlung entzündlicher Erkrankungen wie Autoimmunerkrankungen, Abstoßung durch feste Organtransplantationen, Transplantat-gegen-Wirt-Erkrankung und allergische Erkrankungen ^3,4,5. Gleichzeitig gilt die Hemmung der Funktion von Treg-Zellen als effektive Strategie zur Aktivierung der Anti-Tumor-Immunität ^6,7. Klinische Studien haben adoptive regulatorische T-Zelltherapie oder niedrigdosierte IL-2-Behandlung für Autoimmunerkrankungen, Transplantation von festen Organen und Graft-versus-Host-Erkrankungen^{untersucht 8,9,10}. Darüber hinaus gewinnen Studien an konstruierten Treg-Zellen, einschließlich chimerischer Antigenrezeptor (CAR)-Treg-Zellen und T-Zell-Rezeptor (TCR)-Treg-Zellen, zunehmend^an Aufmerksamkeit.

Bis heute ist die Treg-Zelltherapie in der routinemäßigen klinischen Behandlung noch nicht weit verbreitet. Zur Unterstützung der klinischen Anwendung der Treg-Zelltherapie sind systematische Forschung und Bewertung ihrer Funktionen wichtig. Eine gängige Strategie zur Bewertung der Funktionen regulatorischer T-Zellen in vitro ist der in vitro Treg-Suppressionstest¹³, der die suppressive Funktion von Treg-Zellen auf die Proliferation von Effektor-T-(Teff)-Zellen nachweisen kann. Der Standard-in-vitro-Treg-Suppressionstest bewertet jedoch nicht die Differenzierung der Teff-Zellen. Wenn gleichzeitig die Proliferation und Differenzierung von Effektor-T-Zellen evaluiert werden können, können mehr Informationen über die Funktion regulatorischer T-Zellen gewonnen werden.

Hier präsentieren wir einen modifizierten in-vitro-Treg-Zellsuppressionsassay, der als "in vitro funktionelle Analyse von Treg-Zellen" bezeichnet wird (Abbildung 1). Dieses Protokoll bietet eine In-vitro-Kokulturstrategie zur Untersuchung der Auswirkungen von Treg-Zellen auf die Proliferation und Differenzierung von Teff-Zellen.

Protokoll

Alle Mausversuche wurden vom Tierethikkomitee des West China Hospital, Sichuan Universität, genehmigt (Genehmigungsnummern 20250814006, 20211212A). Alle in diesem Experiment verwendeten Mäuse basierten auf einem genetischen Hintergrund C57BL/6.

1. Vorbereitung von Lösungen

1. Bereiten Sie fluoreszenzaktivierte Zellsortierpuffer (FACS) vor: 1× PBS enthält 0,5 % Rinderserumalbumin (BSA).
2. Bereiten Sie einen magnetisch aktivierten Zellsortierpuffer (MACS) vor: 1× PBS mit 0,5 % BSA und 2 mM Ethylenediamin-Tetraessigsäure (EDTA).
3. Bereite Zellkulturmedium vor: RPMI 1640 Medium mit 10 % fetalem Rinderserum (FBS), 1 mM Natriumpyruvat, 2 mM L-Glutamin, 10 mM HEPES, 55 μM β-Mercapttoethanol, 100 U/mL Penicillin und 100 μg/mL Streptomycin.

2. Herstellung von C57BL/6-Mauslymphozyten

1. Nehmen Sie die Milz und peripheren Lymphknoten (LNs) einer 6–8 Wochen alten C57BL/6-Maus (entweder männlich oder weiblich) unter sterilen Bedingungen und setzen Sie sie in ein 50-ml-Zentrifugenrohr mit 5 ml FACS-Puffer.
   HINWEIS: Die Sektion der Milz und der LNs sollte gemäß Standardverfahren durchgeführt werden.
2. Setzen Sie ein 70 μm Zellsieb auf ein 50 ml Zentrifugenrohr, dann Milz und LNs auf das Sieb und mahlen mit einem 5-mL Spritzenkolben das Gewebe vorsichtig 1 Minute lang. Während des Mahlens spüle ich das Sieb dreimal mit FACS-Puffer. Achten Sie darauf, das gesamte Gewebe vollständig zu mahlen und die Zellen in das Zentrifugenrohr zu spülen. Nach dem Schleifen entferne das Sieb.
3. Zentrifugiere bei 4 °C, 350 × g für 7 Minuten.
4. Entfernen Sie das Supernatant, suspendieren Sie das Zellpellet in 3 ml roten Blutkörperchen-Lysepuffer und lassen Sie die Suspension 3–5 Minuten bei Zimmertemperatur stehen.
5. Fügen Sie sofort den FACS-Puffer in das Zentrifugenrohr mit einem Volumen von 15–20 ml ein, um die Lyse zu beenden, und zentrifugieren Sie bei 4 °C, 350 × g für 7 Minuten.
6. Entferne das Supernatant, gib 10 ml FACS-Puffer hinzu und suspendiere das Zellpellet vorsichtig wieder.
7. Nehmen Sie 10 μL Zellsuspension und verwenden Sie eine Trypan-Blue-Färbung, um die Gesamtzahl der lebenden Lymphozyten zu zählen.
   HINWEIS: Diese Zellen sind CD45.2⁺ Lymphozyten.

3. Präparation von CD45.1-Mauslymphozyten

1. Nehmen Sie die Milz und LNs einer 6–8 Wochen alten CD45.1-Maus (entweder männlich oder weiblich) unter sterilen Bedingungen und setzen Sie sie in ein 50-ml-Zentrifugenrohr mit 5 mL FACS-Puffer.
2. Bereiten Sie Lymphozyten aus der CD45.1-Maus vor, indem Sie die oben beschriebenen Schritte befolgen.
   HINWEIS: Diese Zellen sind CD45.1⁺ Lymphozyten.

4. Herstellung von CD45.2⁺CD4⁺CD62L⁺ naiven T-Zellen

HINWEIS: Der gesamte Prozess verwendet das CD4⁺CD62L⁺ T Cell Isolation Kit für MACS. Der MACS-Puffer wird bei 4 °C vorgekühlt, und alle Zentrifugationsbedingungen betragen 4 °C, 350 × g für 7 Minuten.

1. Sammeln Sie die Zellsuspension von C57BL/6-Mäusen, zentrifugieren und entsorgen Sie das Supernatant, geben Sie 400 μL MACS-Puffer und 100 μL CD4⁺ T-Zell-Biotin-Antikörper-Cocktail pro 1 × 10⁸ Anfangszellen in das Zentrifugenrohr. Sanft rühren und bei 4 °C im Dunkeln 5 Minuten inkubieren.
2. Fügen Sie 300 μL MACS-Puffer und 200 μL Anti-Biotin-Mikroperlen ab Schritt 4.1 pro 1 × 10⁸ Anfangszellen zur Zentrifugenrohr hinzu. Vorsichtig mischen und bei 4 °C 10 Minuten im Dunkeln inkubieren.
3. Fügen Sie 10 ml MACS-Puffer hinzu, zentrifugieren und entsorgen Sie das Supernatant. Das Zellpellet in 2 mL MACS-Puffer wieder suspendieren.
4. Platzieren Sie die LS-Spalte auf den entsprechenden MACS-Sortiermagnetseparator. Verwenden Sie 3 ml MACS-Puffer, um die Säule abzuspülen. Warte, bis der Puffer in der Säule vollständig entleert ist, bevor du zum nächsten Schritt übergehst.
   HINWEIS: Die maximale Zellladekapazität der LS-Säule beträgt 2 × 10⁹ Zellen, einschließlich positiver und negativer Zellen, und die maximale Anzahl positiver Zellen, die sie erfassen kann, beträgt 1 × 10⁸. Normalerweise benötigt eine einzelne Maus hier nur eine LS-Spalte.
5. Lade die Zellaufhängung von Schritt 4.3 auf die LS-Säule. Wenn die Zellsuspension vollständig in die Säule fließt, verwenden Sie 3 ml MACS-Puffer, um die Säule zu reinigen. Sammeln Sie die gesamte Durchflussflüssigkeit in einem neuen 15-mL-Zentrifugenrohr.
   HINWEIS: Dies sind die Gesamtzahl CD4⁺CD25^{– T-Zellen} .
6. Zentrifugiere die gesamten CD4⁺CD25^{– T-Zellen} aus Schritt 4.5, entsorge das Supernatant und entsorge das Zellpellet.
7. Fügen Sie 800 μL MACS-Puffer und 200 μL CD62L-Mikroperlen pro 1 × insgesamt 10 μL CD62L-Mikroperlen zum Zellpellet hinzu. Vorsichtig mischen und bei 4 °C 10 Minuten im Dunkeln inkubieren.
8. Fügen Sie 10 ml MACS-Puffer in die Zentrifugenröhre ein, zentrifugieren und entsorgen Sie das Supernatant und suspendieren Sie das Zellpellet in 500 μL MACS-Puffer.
9. Platzieren Sie die MS-Säule auf den entsprechenden MACS-Sortiermagnetseparator und spülen Sie die Säule mit 1 ml MACS-Puffer.
10. Lade die Zellsuspension auf die MS-Säule. Wenn die Suspension vollständig in die Säule fließt, verwenden Sie 1 ml MACS-Puffer, um die Säule zweimal zu waschen.
11. Entferne die MS-Säule vom magnetischen Separator und setze sie auf ein neues 15-mL-Zentrifugenrohr. Füge 1 ml MACS-Puffer zur Säule hinzu und drücke sofort den Kolben fest, um die mit magnetischen Perlen beschrifteten Zellen zu elutieren.
12. Zähle die Zellen, zentrifugiere und entsorge den Supernatanten, suspendiere die Zellen in einem geeigneten Kulturmedium und lasse das Rohr auf Eis.
    HINWEIS: Diese Zellen sind CD45.2⁺CD4⁺CD62L⁺ naive T-Zellen. In der Regel können etwa 8 × 10⁶ bis 1 × 10⁷ CD4⁺CD25^–CD62L⁺ naive T-Zellen aus einer Maus gereinigt werden; Die Einbeziehung peripherer Lymphknoten kann die Ausbeute erhöhen.
13. Bestimme die Reinheit der isolierten Zellen: Nimm 5 × 10^{4 isolierte} CD4⁺CD62L⁺ T-Zellen und suspendiere sie in 50 μL Antikörperlösung in einem 1,5-mL Zentrifugenröhrchen.
    HINWEIS: Bereiten Sie die Antikörperlösung vor, indem Sie den Anti-Maus-Antikörper CD4 PerCP-Cy5.5-Antikörper, den Anti-Maus-Antikörper CD62L FITC-Antikörper und den Anti-Maus-CD25-PE-Antikörper im FACS-Puffer im Verhältnis 1:100 hinzufügen.
14. Nach der 20-minütigen Inkubation bei 4 °C im Dunkeln geben Sie 1 ml FACS-Puffer dazu, um die Zellen zu reinigen. Zentrifugieren Sie die Zellen, entfernen Sie das Supernatant und suspendieren Sie das Pellet in 200 μL FACS-Puffer.
15. Die Reinheit der Proben wird durch Durchflusszytometrie erkannt.
    HINWEIS: Für Details zur Durchflusszytometeranalyse siehe das Benutzerhandbuch des Instruments oder das zuvor gemeldete Protokoll¹⁴. Die Reinheit der CD4⁺CD25^–CD62L⁺ naiven T-Zellen sollte in der isolierten T-Zellprobe über 95 % liegen (Abbildung 2).

5. Herstellung von CD45.1⁺CD4⁺CD25⁺ -Treg-angereicherten Zellen und antigenpräsentativen, nicht CD4^+- angereicherten Nicht-CD4+-Zellen

HINWEIS: Der gesamte Prozess verwendet das CD4⁺CD25⁺ Regulatory T Cell Isolation Kit für MACS, und die Befehle im Kit wurden optimiert, um gleichzeitig antigenpräsentierende Zellen (APC)-angereicherte Zellen ohne CD4⁺ und CD4⁺CD25⁺ Treg-angereicherte Zellen zu erhalten. Der MACS-Puffer ist bei 4 °C vorgekühlt, und alle Zentrifugationsbedingungen betragen 4 °C, 350 × g für 7 Minuten.

1. Sammeln Sie die Zellsuspension von CD45.1-Mäusen, zentrifugieren Sie und entsorgen Sie das Supernatant, fügen Sie 400 μL vorgekühlten MACS-Puffer und 100 μL CD4⁺CD25⁺ Regulatorisches T-Zell-Biotin-Antikörper-Cocktail in das Zentrifugenrohr pro 1 × 10^{8 anfänglichen} Gesamtzellen ein. Vorsichtig mischen und bei 4 °C 10 Minuten im Dunkeln inkubieren.
2. Ohne Waschen geben Sie direkt 380 μL vorgekühlten MACS-Puffer, 200 μL Antibiotin-Mikroperlen und 20 μL CD25-PE-Antikörper pro 10 ×⁸ anfänglichen Gesamtzellen ab Schritt 5.1 in das Zentrifugenrohr. Vorsichtig mischen und bei 4 °C 15 Minuten im Dunkeln inkubieren.
3. Gib 10 ml MACS-Puffer in die Zentrifugenröhre, zentrifugiere und entsorge das Überstandsmittel, dann suspendiere das Zellpellet in 500 μL MACS-Puffer pro 1 × 10⁸ Anfangszellen.
4. Platzieren Sie die LD-Säule auf den entsprechenden MACS-Sortiermagnetabscheider und spülen Sie die Säule mit 2 ml MACS-Puffer. Warte, bis der Puffer in der Säule vollständig entleert ist, bevor du zum nächsten Schritt übergehst.
5. Laden Sie langsam die Zellenaufhängung von Schritt 5.3 auf die LD-Säule. Wenn die Zellsuspension vollständig in die Säule fließt, waschen Sie die Säule zweimal mit 2 mL MACS-Puffer. Sammeln Sie die gesamte Durchflussflüssigkeit in einem neuen 15-mL-Zentrifugenrohr.
6. Entfernen Sie die LD-Säule vom magnetischen Separator und setzen Sie sie auf ein neues 15-mL-Zentrifugenrohr. Fügen Sie 3 ml MACS-Puffer in die LD-Säule hinzu und drücken Sie sofort den Kolben fest, um die mit Mikroperlen gekennzeichneten nicht-CD4^+- Zellen auszustoßen. Zählen Sie die Zellen, zentrifugieren, sie in einem geeigneten Volumen des Zellkulturmediums wieder suspendieren, um eine Zellkonzentration von 1 × 107^Zellen /ml zu erreichen, und lassen Sie das Rohr auf Eis.
   HINWEIS: Diese Nicht-CD4⁺ -Zellen bestehen hauptsächlich aus APCs wie Makrophagen, dendritischen Zellen und B-Zellen. In diesem Protokoll werden diese Zellen als APC-angereicherter Nicht-CD4⁺ -Anteil verwendet.
7. Zentrifugiere die gesamten CD4^+- T-Zellen, die aus Schritt 5.5 gesammelt wurden, entsorge das Supernatant und entsorge das Zellpellet.
8. Fügen Sie 900 μL MACS-Puffer und 100 μL Anti-PE-Mikroperlen pro 1 × 10 μL initialen Gesamtzellen zum Zellpellet hinzu. Vorsichtig mischen und bei 4 °C 15 Minuten im Dunkeln inkubieren.
9. Platzieren Sie die MS-Säule auf den entsprechenden MACS-Sortiermagnetseparator und spülen Sie die Säule mit 500 μL vorgekühltem MACS-Puffer. Warte, bis der Puffer in der Säule vollständig entleert ist, bevor du zum nächsten Schritt übergehst.
10. Laden Sie langsam die Zellsuspension von Schritt 5.8 auf die MS-Säule. Wenn die Zellsuspension vollständig in die Säule fließt, waschen Sie die Säule zweimal mit 1 mL MACS-Puffer. Sammeln Sie die Durchflussflüssigkeit in einem neuen 15-mL-Zentrifugenrohr.
    HINWEIS: Die Zellen in der Durchflussflüssigkeit zu diesem Zeitpunkt sind CD4⁺CD25^{– T-Zellen} .
11. Lösen Sie die MS-Säule vom magnetischen Separator und positionieren Sie sie über einem frischen 15-mL-Zentrifugenrohr. Fügen Sie 1 ml MACS-Puffer zur Säule hinzu und drücken Sie dann sofort den Kolben ab, um die magnetisch perlenbeschrifteten CD4⁺CD25⁺ Treg-angereicherten Zellen wiederherzustellen.
12. Nach dem Zählen der Zellen zentrifugieren Sie die Suspension und entfernen Sie das Supernatant. Setzen Sie das Pellet in ausreichend einem Kulturmedium auf, um eine Endkonzentration von 2 × 10^{6 Zellen} /ml zu erhalten, und lassen Sie das Rohr auf Eis.
    HINWEIS: Diese Zellen sind CD45.1⁺CD4⁺CD25⁺ Treg-angereicherte Zellen. In der Regel können etwa 8 × 10⁵ bis 1 × 10⁶ CD4⁺CD25⁺ Zellen aus einer Maus gereinigt werden; Die Einbeziehung peripherer Lymphknoten kann die Ausbeute erhöhen.
13. Bestimmen Sie die Reinheit der isolierten CD4⁺CD25⁺ Treg-angereicherten Zellen: Nehmen Sie 5 × 10^{4 isolierte} CD4⁺CD25⁺ Treg-angereicherte Zellen bzw. 5 × 10^{4 isolierte} APC-angereicherte Nicht-CD4⁺ -Zellen und setzen Sie sie in 50 μL Antikörperlösung wieder auf.
    HINWEIS: Bereiten Sie die Antikörperlösung vor, indem Sie den Antimaus-Antikörper CD4 PerCP-Cy5.5 und den Anti-Maus-Antikörper CD25 PE im FACS-Puffer im Verhältnis 1:100 hinzufügen. Verwenden Sie hier denselben Anti-Maus-CD25-PE-Antikörper, um zu bestätigen, dass die CD4⁺CD25^+- Zellen ausreichend markiert sind und dass sich keine CD4⁺CD25⁺ T-Zellen im Nicht-CD4⁺ -Anteil befinden. Für eine genauere Identifizierung von Treg-Zellen kann auch eine intrazelluläre Färbung mit einem antimausartigen Foxp3-PB-Antikörper durchgeführt werden.
14. Nach der 20-minütigen Inkubation bei 4 °C im Dunkeln fügen Sie 2 ml FACS-Puffer hinzu, um die Zellen zu reinigen. Zentrifugieren Sie die Zellen, entfernen Sie das Supernatant und suspendieren Sie das Pellet in 200 μL FACS-Puffer.
15. Die Reinheit der Proben wird durch Durchflusszytometrie erkannt.
    HINWEIS: Die Häufigkeit der CD4⁺CD25^+- Zellen sollte ≥ 95 % betragen, um sicherzustellen, dass die Reinheit der Treg-angereicherten Zellpopulation die experimentellen Anforderungen erfüllt (Abbildung 2). Nicht-CD4⁺ -Zellen, die als APC-angereicherte Fraktion verwendet werden, sollten nicht mehr als 5 % CD4⁺ T-Zellen enthalten (Abbildung 2).

6. Markierung naiver CD4⁺ T-Zellen mit Zellproliferationsfarbstoff

HINWEIS: Alle Zentrifugationsbedingungen betragen 4 °C, 350 × g für 7 Minuten. Der PBS-Puffer wird vor der Verwendung auf Raumtemperatur eingestellt. Der Beschriftungsprozess erfolgt unter Lichtschutz, um das Abschrecken der Farbe zu vermeiden.

1. Nimm die naive CD4⁺ T-Zellsuspension, zentrifugiere, entsorge das Supernatant und entsorge das Zellpellet.
2. Verdünnen Sie den Zellproliferationsfarbstoff eFluor 450 in PBS, um bei Raumtemperatur eine Konzentration von 20 μM zu erhalten.
3. Fügen Sie 0,5 ml PBS pro 1 × 10^{7 Zellen hinzu} . Halte das Rohr etwa um 45° geneigt und suspendiere die Zellen vorsichtig wieder, indem du 50x auf und ab pipettierst.
4. Fügen Sie schnell ein gleiches Volumen Zellproliferationsfarblösung in die Zellsuspension ein, sodass die Endkonzentration des Zellproliferationsfarbes 10 μM beträgt. Halten Sie das Rohr etwa um 45° geneigt und mischen Sie die Zellen, indem Sie 50 Mal auf und ab pipetten, um einen vollständigen Kontakt zwischen den Zellen und dem Zellproliferationsfarbe sicherzustellen.
5. Wickle das Zentrifugenrohr sofort mit Alufolie um, um Lichteinwirkung zu vermeiden. 20 Minuten bei Zimmertemperatur bebrüten. Lassen Sie die Zellen alle 5 Minuten vortexen, um eine Zellaggregation zu verhindern.
6. Fügen Sie 10 ml vorgekühltes Zellkulturmedium in das Zentrifugenrohr ein, wirbeln vorsichtig vor, um die Färbung zu beenden, zentrifugieren Sie dann und entsorgen Sie das Supernatant.
7. Gib 5 ml vorgekühltes Zellkulturmedium zur Zellpellet hinzu, zentrifugiere und entsorge das Supernatantant, um die Zellen zu waschen.
8. Fügen Sie dem Zellpellet erneut 5 ml vorgekühltes Zellkulturmedium hinzu und suspendieren Sie die Zellen erneut.
9. Zählen Sie die Zellen, zentrifugieren Sie und entsorgen Sie das Supernatant, lassen Sie die Zellen in einem geeigneten Kulturmedium wieder aufhängen, um eine Zellkonzentration von 2 × 10^{6 Zellen} /ml zu erreichen, und lassen Sie das Rohr auf Eis.

7. Aufbau der in-vitro-funktionalen Analyse von Treg-Zellen.

1. Berechnen Sie die Anzahl der für die Zellkultur benötigten Proben, bereiten Sie eine angemessene Menge Zellkulturmedium vor, das 2,5 μg/mL Anti-Maus-CD3-Antikörper oder die angezeigten Induktionszytokine enthält, und vortexen Sie vorsichtig die vorbereiteten CD45.2⁺CD4⁺CD62L⁺ naiven T-Zellen, CD4.1⁺CD4⁺CD25⁺ Treg-angereicherte Zellen und APC-angereicherte Nicht-CD4⁺ -Zellen.
   HINWEIS: Verwenden Sie CD45.2⁺CD4⁺CD62L⁺ naive T-Zellen als Responder-T-(Tresp-)Zellen. Dieses Beispielexperiment untersucht die Wirkung von Treg-Zellen auf die Differenzierung und Proliferation von Th1- und Th17-Zellen. Daher gibt es insgesamt vier Proben für die Zellkultur: Tresp-Zellen, die unter Th1- oder Th17-Induktionsbedingungen kultiviert wurden, in Abwesenheit oder Anwesenheit von Treg-angereicherten Zellen.
2. Fügen Sie 100 μL CD45,2⁺CD4⁺ naive T-Zellen (2 × 10⁵ Zellen pro Well) zur 48-Well-Platte hinzu.
3. Fügen Sie 100 μL CD45.1⁺ -APC-angereicherte Nicht-CD4⁺ -Zellen (1 × 10^{6 Zellen pro} Bohrloch) zur 48-Well-Platte hinzu.
4. Fügen Sie 100 μL CD45,1⁺CD4⁺CD25⁺ Treg-angereicherte Zellen (2 × 10⁵ Zellen pro Bohrloch) zu den Versuchsbohrungen hinzu und fügen Sie den Kontrollbohrungen 100 μL Zellkulturmedium hinzu. Das Treg-angereicherte Zelle:Tresp-Verhältnis in den experimentellen Proben beträgt 1:1.
   HINWEIS: Das Verhältnis von Trej-Zellen zu Tresp-Zellen kann bei Bedarf eingestellt oder ein Panel mit mehreren Verhältnissen entworfen werden. Die Anzahl der Tresp-Zellen ist in der Kokultur festgelegt, während die Anzahl der Trej-Zellen bei Bedarf angepasst werden kann. Typischerweise umfassen die Verhältnisse von Treg zu Tresp in den experimentellen Stichproben 1:1, 1:2, 1:4, 1:8, 1:16 und 0:1. Darüber hinaus kann jede experimentelle Bedingung in dreifacher Form vorbereitet werden, um zufällige experimentelle Fehler zu minimieren. Der Klarheit halber wird auf Grundlage früherer Forschungserfahrung^15,16 ein 1:1-Verhältnis als Beispiel verwendet.
5. Fügen Sie jedem Bohrloch 100 μL Zellkulturmedium mit 2,5 μg/mL Anti-Maus-CD3-Antikörpern hinzu.
   HINWEIS: Die Endkonzentration des Anti-Maus-CD3-Antikörpers beträgt 0,5 μg/mL. Zusätzlich zu den experimentellen Proben wird eine leere Kontrollprobe ohne Anti-Maus-CD3-Antikörper gesetzt. In dieser Probe werden 100 μL T-Zellkulturmedium ohne Anti-Maus-CD3-Antikörper hinzugefügt, um die Fluoreszenzintensität der nicht-proliferatierten T-Zellen oder die Intensität von Peak 0 zu bestimmen. Dies ermöglicht eine genaue Kalibrierung der Proliferationsverteilung.
6. Fügen Sie jedem Bohrloch 100 μL Zellkulturmedium mit den angegebenen Zytokinen hinzu, um das Endvolumen jedes Bohrlochs auf 500 μL zu erreichen.
   HINWEIS: In diesem Experiment wird rekombinante Maus-IL-12 p70 mit einer Endkonzentration von 10 ng/mL verwendet, um Th1-Zellen zu induzieren, rekombinante humane TGF-β1 mit einer Endkonzentration von 2 ng/mL sowie rekombinante Maus-IL-6 mit 50 ng/mL zur Induzierung von Th17-Zellen.
7. Fügen Sie PBS in die verbleibenden leeren Brunnen (500 μL/Brunnen) hinzu, um die Luftfeuchtigkeit der Platte zu erhalten und die Kanteneffekte zu verringern.
8. Inkubieren Sie die 48-Brunnen-Platte in einem 5%igen CO2-Inkubator bei 37 °C für 3 Tage.
   HINWEIS: In diesem Kokultursystem liefert der lösliche Anti-Maus-CD3-Antikörper das primäre Signal des T-Zell-Rezeptors (TCR) für die T-Zell-Aktivierung, und APC-angereicherte Nicht-CD4⁺ -Zellen liefern kostimulatorische Signale, um T-Zellen vollständig zu aktivieren. TCR und kostimulatorische Signale können ebenfalls durch plattenbeschichtete Anti-Maus-CD3-Antikörper und lösliche Anti-Maus-CD28-Antikörper ausgelöst werden. Forscher können die Stimulationsmethode nach Bedarf wählen.

8. In-vitro-Funktionalanalyse von Treg-Cellen

HINWEIS: Alle Zentrifugationsbedingungen betragen 4 °C, 350 × g für 7 Minuten.

1. Die kultivierten Zellen werden vorsichtig gepipettert, um sie wieder zu suspendieren, und die Suspension in ein 1,5-mL-Zentrifugenrohr übertragen. Zentrifugiere die Zellen und entferne das Supernatant.
2. Fügen Sie 500 μL Zellkulturmedium mit 5 ng/mL PMA, 1 μg/mL Ionomycin und 1:1.000 verdünntem GolgiPlug Protein Transport Inhibitor zu jedem Röhrchen hinzu, wirbeln die Zellen sanft vortex, um die Zellen wieder zu suspendieren, und inkubieren Sie sie in einem 5%igen CO2-Inkubator bei 37 °C für 3 Stunden.
3. Zentrifugieren, den Supernatanten entsorgen, 50 μL PBS mit einem Test des Zombie-Gelb-Farbstoffs und 1:100 verdünnten Anti-Maus-CD16/32-Antikörper zu jeder Probe hinzufügen, einen Wirbel, und 15 Minuten bei Raumtemperatur im Dunkeln inkubieren, um tote Zellen zu markieren und Fc-Rezeptoren zu blockieren.
4. Zentrifugieren, den Überkörper entsorgen, 50 μL Oberflächenantikörper-Cocktail hinzufügen, Vortex und 20 Minuten im Dunkeln bei 4 °C inkubieren.
   HINWEIS: Fügen Sie dem Anti-CD4 PerCP-Cy5.5-Antikörper, Anti-CD45.1 FITC-Antikörper und Anti-CD45.2 APC-eFluor 780-Antikörper im FACS-Puffer im Verhältnis 1:200 zur Herstellung des Oberflächenantikörper-Cocktails hinzu.
5. Fügen Sie 1 ml FACS-Puffer zu jeder Zentrifugenröhre hinzu, zentrifugieren und entsorgen Sie das Übersetzungsmittel.
6. Fügen Sie 300 μL Fixations- und Permeabilisierungslösung zu jedem Zentrifugenrohr hinzu, Wirbel, und inkubieren Sie bei 4 °C im Dunkeln für 20 Minuten.
7. Fügen Sie 1 ml 1× Permeabilisierungs-/Wash-(Perm/Wash)-Puffer zu jedem Zentrifugenrohr hinzu, Zentrifuge und entsorgen Sie den Supernatanten; Wiederholen Sie diesen Waschgang einmal, um das Restfixativ vollständig zu entfernen.
8. Fügen Sie 50 μL Zytokin-Antikörper-Cocktail hinzu, Wirbel, und inkubieren Sie 40 Minuten lang bei 4 °C im Dunkeln.
   HINWEIS: Fügen Sie dem Anti-IFN-γ PE-Antikörper und den Anti-IL-17A PE-Cy7-Antikörper im Verhältnis 1:100 zum Perm/Wash-Puffer hinzu, um den Zytokin-Antikörper-Cocktail herzustellen.
9. Waschen Sie jede Probe mit 1 ml Perm/Wash-Puffer, zentrifugieren Sie die Zellen und entfernen Sie das Supernatant. Das Pellet in 300 μL FACS-Puffer wieder suspendieren.
10. Missen Sie die Proliferation und Differenzierung von Tresp-Zellen mittels Durchflusszytometrie. Verwenden Sie folgende Gating-Strategie (Abbildung 3): Zunächst wird die Lymphozytenpopulation unter den gesamten Zellen gegatet und Zellreste sowie Verunreinigungen ausgeschlossen; zweitens, die einzellige Population unter den Lymphozyten anhand von Streusignalen zu gaten; Drittens, die lebende Zellpopulation unter den einzelnen Zellen zu gaten; viertens, die CD4^+- T-Zellpopulation unter den lebenden Zellen zu gaten; Fünftens: Gate-Population der CD45.1⁺ Treg-angereicherten Zellpopulation und CD45.2⁺ Teff-Zellpopulation unter den CD4⁺ T-Zellen; sechstens: Gate CD45.2⁺CD4⁺IFN-γ⁺ Th1-Zellen, CD45.2⁺CD4⁺IL-17A⁺ Th17-Zellen sowie nicht-proliferatierte CD45.2⁺CD4⁺ T-Zellen unter den CD45.2⁺ T-Zellen.
11. Erfassen Sie Flowzytometriedaten und analysieren Sie die Flowzytometriedaten.
    1. Verwenden Sie kultivierte T-Zellen, die mit dem Zellproliferationsfarbstoff eFluor 450 gekennzeichnet sind, als Zellproliferationsfarbstoff-Einzelfärbungskontrolle. Bereiten Sie das Zombie-Gelb-Farbstoff-Einzel-gefärbte Kontrollmittel mit kultivierten T-Zellen vor, die nicht mit Zellproliferationsfarbe gekennzeichnet waren. Bereiten Sie die anderen einzeln gefärbten Kontrollen mit Kompensationsperlen für jedes verwendete Fluorophor vor.
    2. Verwenden Sie T-Zellen, die mit dem Zellproliferationsfarbstoff eFluor 450 markiert und ohne Anti-Maus-CD3-Antikörper kultiviert werden, um das Tor nicht-proliferatierter Zellen zu definieren.
    3. Verwenden Sie kultivierte T-Zellen, die mit Zellproliferationsfarbe markiert und mit Zombie Yellow Farbstoff, allen Zelloberflächenantikörpern sowie Isotypkontrollen von Anti-Maus IFN-γ PE-Antikörpern und Anti-Maus IL-17A PE-Cy7-Antikörpern verwendet werden, um Gatter von IFN-γ⁺CD4⁺ und IL-17A⁺CD4⁺ T-Zellen zu definieren.

Ergebnisse

In dem repräsentativen Experiment wurden naive T-Zellen als Tresp-Zellen verwendet, um die Auswirkungen von Treg-angereicherten Zellen auf die Proliferation und Differenzierung von Th1- und Th17-Zellen zu untersuchen. In diesem Experiment wurden Tresp-Zellen von Anti-Maus-CD3- und APC-angereicherten Nicht-CD4⁺ -Zellen aktiviert und anschließend unter IL-12 p70-Induktion zu Th1-Zellen oder unter TGF-β1- und IL-6-Induktion zu Th17-Zellen differenziert. Unter diesen beiden Induktionsbedingungen wurden Veränderung...

Diskussion

In dieser Studie stimmen die Ergebnisse der Kokultur unter Th1-Induktionsbedingungen mit früheren Berichten überein, die zeigen, dass Treg-Zellen die Th1-Zellproliferation und -differenzierung unterdrücken können^17,18. Treg-angereicherte Zellen hemmten auch die Proliferation von Tresp-Zellen unter Th17-Induktionsbedingungen. Unter den hier verwendeten Th17-polarisierenden Bedingungen stieg jedoch die Häufigkeit der IL-17A⁺

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
1.5 mL Zentrifugenrohr	Thermo Fisher Scientific	3457IW	oder gleichwertig
12.5 μL Gefilterte Pipettenspitzen	Thermo Fisher Scientific	94420043	oder gleichwertig
1250 μL Gefilterte Pipettenspitzen	Thermo Fisher Scientific	94420813	oder gleichwertig
15 mL Konische Zentrifugenrohre	Thermo Fisher Scientific	339650	oder gleichwertig
200 μL Gefilterte Pipettenspitzen	Thermo Fisher Scientific	94420318	oder gleichwertig
48-Well-Platten	Corning Incorporated	3548	oder gleichwertig
5 mL Spritzenkolben	Shifeng Medical	SB2-061(A)	oder gleichwertig
50 mL Konische Zentrifugenrohre	Thermo Fisher Scientific	339652	oder gleichwertig
50 μL Gefilterte Pipettenspitzen	Thermo Fisher Scientific	94420258	oder gleichwertig
70 μm Zellsieb	Biosharp Life Sciences	BS-70-CS	oder gleichwertig
Anti-Maus CD28 Antikörper	BioXcell	BE0015-1	oder gleichwertig
Anti-Maus CD3 Antikörper	BioXcell	BE0001-1	oder gleichwertig
Anti-Maus CD4 PerCP-Cy5.5 (RM4-5)	Thermo Fisher Scientific	45-0042-82	oder gleichwertig
Anti-Maus Foxp3 PB (FJK-16s)	Thermo Fisher Scientific	48-5773-82	oder gleichwertig
Anti-Maus IFN-gamma PE (XMG1.2)	BioLegend	505808	oder gleichwertig
Anti-Maus IL-17A PE-Cy7 (eBio17B7)	Thermo Fisher Scientific	25-7177-82	oder gleichwertig
Beckman CytoFLEX S Durchflusszytometer	Beckman Coulter	N/A	für die Datenerfassung immunologische Proben durch Durchflusszytometrie
Bovines Serumalbumin (BSA)	Sigma-Aldrich	B2064	oder gleichwertig
C57BL/6 Mäuse	Shanghai Model Organisms Center, Inc	SM-001	zur Isolierung primärer Lymphozyten und T-Zell-Subpopulationen
CD25 Monoklonaler Antikörper (PC61.5), PE	Thermo Fisher Scientific	12-0251-83	oder gleichwertig
CD4+CD25+ Regulatorische T-Zell-Isolierungskit, Maus	Miltenyi Biotec	130-091-041	zur Zellsortierung
CD4+CD62L+ T-Zell-Isolierungskit, Maus	Miltenyi Biotec	130-106-643	zur Zellsortierung
CD45.1 Mäuse	Shanghai Model Organisms Center, Inc	NM-KI-210226	zur Isolierung primärer Lymphozyten und T-Zell-Subpopulationen
CD45.1 Monoklonaler Antikörper (A20), FITC	Thermo Fisher Scientific	11-0453-85	oder gleichwertig
CD45.2 Monoklonaler Antikörper (104), APC-eFluor 780	Thermo Fisher Scientific	47-0454-82	oder gleichwertig
CD62L (L-Selektin) Monoklonaler Antikörper (MEL-14), FITC	Thermo Fisher Scientific	11-0621-85	oder gleichwertig
Cytofix/Cytoperm Fixierung/Permeabilisierungs-Lösungs-Kit	BD Biosciences	554714	oder gleichwertig
eBioscience Zellproliferationsfarbstoff eFluor 450	Thermo Fisher Scientific	65-0842-90	oder gleichwertig
Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA)	Solarbio Life Sciences	E1170	oder gleichwertig
Fötales bovines Serum	Thermo Fisher Scientific	A5669701	oder gleichwertig
FlowJo 10.6.2	BD Biosciences	N/A	Software für die Durchflusszytometrie-Datenanalyse
Golgi-Plug Proteintransport-Inhibitor	BD Biosciences	555029	oder gleichwertig
HEPES (1 M)	Thermo Fisher Scientific	15630080	oder gleichwertig
Humanes TGF-beta1	PEPROTECH	100-21C	oder gleichwertig
Ionomycin-Calciumsalz	Millipore Sigma	I3909	oder gleichwertig
LD-Säulen	Miltenyi Biotec	130-042-901	zur Zellsortierung
L-Glutamin (200 mM)	Thermo Fisher Scientific	25030081	oder gleichwertig
LS-Säulen	Miltenyi Biotec	130-042-401	zur Zellsortierung
MACS MultiStand	Miltenyi Biotec	130-042-303	zur Zellsortierung
MS-Säulen	Miltenyi Biotec	130-042-201	zur Zellsortierung
OctoMACS Separatoren	Miltenyi Biotec	130-042-109	zur Zellsortierung
PBS, pH 7.4	Thermo Fisher Scientific	10010049	oder gleichwertig
PE Ratten IgG1, κ Isotyp-Ctrl-Antikörper	BioLegend	400408	oder gleichwertig
PE/Cyanine7 Ratten IgG2a kappa Isotyp-Kontroll-Antikörper	Thermo Fisher Scientific	25-4321-82	oder gleichwertig
Penicillin-Streptomycin	Thermo Fisher Scientific	15140122	oder gleichwertig
PMA	Millipore Sigma	P8139	oder gleichwertig
Gereinigtes Anti-Maus CD16/32 Antikörper	BioLegend	101302	oder gleichwertig
QuadroMACS Separator	Miltenyi Biotec	130-090-976	zur Zellsortierung
Rekombinantes Maus-IL-12 p70	PEPROTECH	210-12	oder gleichwertig
Rekombinantes Maus-IL-6	R&D Systems	406-ML	oder gleichwertig
Rote Blutkörperchen Lyse-Puffer (ACK Lyse-Puffer)	Thermo Fisher Scientific	A1049201	oder gleichwertig
RPMI 1640 Medium	Thermo Fisher Scientific	11875093	oder gleichwertig
Natriumpy