Probing für Mitochondriale komplexe Aktivität in humanen embryonalen Stammzellen

Summary

In diesem Video zeigen wir Ihnen, wie der mitochondrialen Atmungskette Komplexe von humanen embryonalen Stammzellen analysiert werden mit in Gel-Aktivitäts-Assays werden.

Abstract

Mitochondrien sind Organellen, die zytoplasmatische eine primäre Rolle im Zellstoffwechsel und Homöostase haben, die Regulierung der zellulären Signalübertragung Netzwerk und den programmierten Zelltod. Mitochondrien erzeugen ATP, regulieren die cytoplasmatische Redoxzustand und Ca2 + Balance, katabolisieren Fettsäuren, zu synthetisieren Häm, Nukleotide, Steroidhormone, Aminosäuren, und helfen montieren Eisen-Schwefel-Clustern in Proteinen. Mitochondrien haben auch eine wesentliche Rolle in der Wärmeproduktion. Mutationen des mitochondrialen Genoms verursachen verschiedene Arten von menschlichen Erkrankung. Die Anhäufung von Mutationen der mtDNA korreliert mit dem Alter und steht im Verdacht, eine wichtige Rolle bei der Entstehung von Krebs haben. Aufgrund ihrer äußerst wichtige Rolle in allen Zelltypen, muss die Funktion der Mitochondrien auch entscheidend für die Stammzellen. Key Fortschritte in unserem Verständnis von Stammzellen Lebensfähigkeit, der Vermehrung und Differenzierung Kapazität gemacht. Aber die funktionelle Aktivität von Stammzellen, insbesondere ihre Energie-Status, war noch nicht im Detail untersucht worden. Fast nichts ist über den mitochondrialen Eigenschaften von humanen embryonalen Stammzellen (hES) und ihrer differenzierten Vorläufer Nachkommen bekannt. Ein Weg, um zu verstehen und bewerten die Rolle der Mitochondrien in hESC Funktion und Entwicklungspotential ist die direkte Messung der Aktivität der mitochondrialen Atmungskette Komplexe. Hier beschreiben wir hochauflösende klare native Gelelektrophorese und anschließender in Gel-Aktivität Visualisierung als Methode zur Analyse der fünf Atmungskette Komplexe von HES.

Protocol

Hohe Auflösung Klare nativen Gel Elektrophorese (hrCNE) für Mitochondriale Komplexe In-Gel Aktivitätstests

Humane embryonale Stammzellen (hES) wurden auf einem Monolayer von ˠ-bestrahlten oder Mitomycin C-behandelten embryonalen Maus-Fibroblasten (MEFs), dann das Wachstum auf Matrigel für 5 Tage in MEF-konditioniertem Medium unter Standardbedingungen eingeschaltet gepflegt. So entfernen Sie kontaminieren MEFs wurden hESCs auf Matrigel erneut verzinkt und aufgewachsen in MEF-konditioniertem Medium für weitere 3 Tage. Immunfluoreszenzmikroskopie für Pluripotenz Marker Oct-4 und SSEA-4 verwendet wurde, um den Mangel an menschlichen embryonalen Stammzellen die Differenzierung zu bestätigen.

1. Wash-Zellen mit warmem 1x PBS, pH 7,4, durch Trypsinierung (1 ml 1x Trypsin pro Vertiefung einer 6-Well-Platte) für 5 min.
2. Fügen Sie dem gleichen Volumen frischen Trypsin Inhibitor (1mg/ml in 1x PBS, pH 7,4). Ernten Sie die Zellen und Zentrifuge bei 200g, 5 min, Raumtemperatur.
3. Verwerfen Sie den Überstand und resuspendieren pelletierten Zellen in 0,8 - 1,7 ml (bezogen auf die Größe des Zellpellets) eiskaltem Mitochondrien isoliert Puffer (83mm Saccharose; 6.6mm Imidazol / HCl, pH 7,0) mit frisch zubereiteten 1 'Protease Inhibitor Cocktail. Inkubieren auf Eis für 10 min.
4. Dounce Zellen mit einem Homogenisator (~ 40 bis 50 Schläge). Stain einen aliquoten Teil der dounced Zellen mit Trypanblau auf Vollständigkeit der Homogenisierung mit einem Lichtmikroskop zu überprüfen.
5. Zentrifuge bei 20.000 g für 10 min bei 4 ° C, um eine rohe mitochondriale Pellet enthält auch Kerne und größere Zellfragmente zu erhalten. Dekantieren und den Überstand verwerfen und wiegen das ausgefallene Rohprodukt mitochondriale Pellet. Das Pellet kann bei -80 ° C gelagert werden folgende Instant Einfrieren in flüssigem Stickstoff, ob dies ein Haltepunkt.
   
   HINWEIS: Differential Zentrifugation oder andere Gradienten-basierten Verfahren können zur Isolierung und Sammeln einer reinen mitochondrialen Membranfraktion verwendet werden. Siehe Lit.. 4 für Details. Dieser alternative Ansatz wird Ertrag der mitochondrialen Komplex-Aktivität pro mg des mitochondrialen Proteins statt komplexer Aktivität pro mg Zellen Gewicht oder Zellzahl. Die Konzentration der mitochondrialen Proteine ​​müssen nach der Reinigung auf diesen Vergleich zu machen bestimmt werden. Auch kann eine andere Isolation Puffer für diesen Ansatz erforderlich sein. Für die Solubilisierung der reinen mitochondriale Membran-Fraktion, siehe die Anmerkung folgende Schritt 6 unten.
   
   
6. Solubilisieren das rohe mitochondriale Pellet auf Eis durch Vortexen mit eiskaltem Solubilisierungspuffer (50 mM NaCl, 50 mM Imidazol / HCl pH 7,0, 1 mM EDTA, 2 mM 6-Aminohexansäure). 6-Aminohexansäure kann mit dem 1x Protease Inhibitor Cocktail ersetzt werden. Verwenden Sie 35μl der Solubilisierungspuffer pro 20mg Tablette Gewicht. Add 20 &mgr; l von 10% w / v Digitonin pro 20mg Tablette Gewicht und mischen flicking die Röhre. Inkubieren für 5-10 min auf Eis. Dodecyl-bD-Maltosid oder Triton X-100 kann für Digitonin ersetzt werden, um die Proteine ​​zu lösen. Die Wahl des Waschmittels und die Menge kann sich auf die Bildung von Superkomplexen oder multimere Formen der Mitochondrien-Komplexen. Weitere Informationen finden Sie unter Ref.1.
   
   HINWEIS: Die Menge an Waschmittel benötigt, um eine reine mitochondrialen Membranfraktion solubilisieren entspricht einem Detergenz / Protein Gewichtsverhältnis von 2-6g / g. Das optimale Verhältnis der mitochondrialen Membranen lösen sich 2,5 g / g für Dodecyl-bD-Maltosid, 3g / g für Triton X-100 und 6 g / g für Digitonin.
   
   
7. Centrifuge das gelöste Pellet bei 100.000 g für 15 min bei 4 ° C. Sammeln Sie die klare Überstand.
8. Add-Ladepuffer, um eine endgültige 5% w / v Glycerin und 0,01% w / v Ponceau S (mit einem 50% w / v Glycerin, 0,1% w / v Ponceau S Ladepuffer Stammlösung).
9. Laden Gel Brunnen mit einem Volumen, das 20-40mg des rohen mitochondrialen Pellet pro Spur enthält. Verwenden Sie ein Acrylamid Gradienten-Gel (4 -13%) mit einem 3,5% Sammelgel.
   
   HINWEIS: Gel-Elektrophorese Vorbereitung und Bedingungen:
   
   Für Gelzubereitung, verwenden Sie ein Acrylamid / Bisacrylamid (AA / bisAA) 3-Mix wie folgt: 48g Acrylamid und 1,5 g Bisacrylamid (49,5% T, 3% C, wobei T Gesamtkonzentration von AA und bisAA und C der Anteil der Vernetzer (bisAA) zum Gesamtumsatz Monomer).
   
   Gel-Puffer (3 '): 1,5 6-Aminohexansäure; 75mm Imidazol, pH 7,0

Gradient Gel:	4%	13%	Stacking-Gel:	3,5%
AA / bisAA 3 Mix	2 ml	6,5 ml		0,6 ml
Gel-Puffer 3 '	8,3 ml	8,3 ml		2,7 ml
Glycerol		5 g
H 2 O	14,7 ml	5 ml		4,7 ml
Gesamtvolumen	25 ml	25 ml		8 ml
10% APS	139 ul	125 ul		67 ul
TEMED	14 ul	12,5 ul		6,7 ul

Anode Puffer: 25mM Imidazol / HCl, pH 7,0

Cathode Puffer: 50 mM Tricin, 7,5 mm Imidazol / HCl, 0,02% w / v Dodecyl-bD-Maltosid, 0,05% w / v Desoxycholat, pH 7,0

Gießen und führen Gele in einem kalten Raum (4-7 ° C). Die anfängliche Spannung verwendet wird 100V. Wenn die Probe hat das Stacking-Gel eingegeben, wird die Spannung auf 500 V mit dem Strom begrenzt auf 15mA (für 0,15 '14' 14-cm-Gele) angehoben. Die Elektrophorese wird nach 3-4 h, wenn die scharfe Linie des roten Farbstoff Ponceau S das Gel vor Ansätze gestoppt. Alternativ kann ein Gel über Nacht mit konstanter Spannung betrieben werden bei 70-100V.

1. In-Gel-Aktivitäts-Assays. Die Inkubationszeit für jeden Test hängt von der Effizienz des Proteins Solubilisierung und die Menge an Material pro Vertiefung geladen. Komplexe I, IV und V liefern in der Regel stärkere Signale als Komplexe II und III.

Komplex I (CI)

Inkubieren Sie die Gelscheibe mit CI-Puffer (5 mM Tris-HCl, pH 7,4; 0.1mg/ml NADH; 2.5mg/ml NBT) bei Raumtemperatur für mehrere Stunden.

CI-Puffer: € pro 100 ml 5mM Tris-HCl, pH 7,4:

0.01g NADH

0,25 g NBT

Fix das Gel in 50% Methanol und 10% Essigsäure für 15-45 min. Die feste Gel wird in 10% Essigsäure erhalten.

Komplex II (CII)

Inkubieren Sie die Gelscheibe mit CII-Puffer (20 mM Natrium-Succinat; 0,2 mM Phenazin methasulfate; 2.5mg/ml NBT; 5mM Tris-HCl pH 7,4) bei Raumtemperatur für mehrere Stunden.

CII-Puffer: € pro 100 ml 5mM Tris-HCl, pH 7,4:

200 ul 1M Natriumsuccinat

80μl Phenazin methasulfate (250mm PMS gelöst in DMSO)

0,25 g NBT

Fix das Gel für komplexe beschrieben I

Komplexe III (CIII)

Inkubieren Sie die Gelscheibe mit CIII-Puffer (50 mM Natriumphosphat, pH 7,2; 0,05% 3,3 '-Diaminobenzidintetrahydrochlorid (DAB)) bei Raumtemperatur für mehrere Stunden.

CIII Puffer: € pro 100 ml 50 mM Natrium-Phosphat, pH 7,2:

50mg Diaminobenzidintetrahydrochlorid

Fix das Gel für komplexe beschrieben I

Komplex IV (CIV)

Inkubieren Sie die Gelscheibe mit CIV-Puffer (50 mM Natriumphosphat, pH 7,2; 0,05% 3,3 '-Diaminobenzidintetrahydrochlorid (DAB), 50 &mgr; Pferd Cytochrom c) bei Raumtemperatur für mehrere Stunden.

CIV Puffer: € pro 100 ml 50 mM Natrium-Phosphat, pH 7,2:

50mg Diaminobenzidintetrahydrochlorid

0.1g Pferd Cytochrom c

Fix das Gel für komplexe beschrieben I

Komplexe V (CV)

Inkubieren Sie die Gelscheibe mit CV-Puffer (35mm Tris-base, 270mm Glycin, pH 8,3 bei 25 ° C, 14mm MgSO _4, 0,2% w / v Pb (NO _{3) 2,} 8mm ATP) bei Raumtemperatur für mehrere Stunden.

CV Puffer: je 100ml Lösung hinzu:

Tris-base	0.424g
Glycine	2.026g
MgSO 4	0.345g
Pb (NO 3) 2	0.29g

Keine Notwendigkeit, pH-Wert (sollte 8,3 sein) einstellen - nicht mit Säure oder Base. Filter und fügen

ATP

0.441g

Fix das Gel in 50% Methanol für 30 min und Transfer zum Wasser.

Discussion

In diesem Video haben wir die Extraktion von mitochondrialen Protein-Komplexe aus humanen embryonalen Stammzellen, deren Trennung durch hochauflösende klare native Gelelektrophorese (hrCNE), und die anschließende Analyse von in-Gel-katalytische Aktivität beschriebenen Assays. hrCNE löst mitochondriale Membran-Protein-Komplexen mit einer Auflösung vergleichbar mit dem von blue native Gelelektrophorese und ist überlegen in-Gel-Aktivitäts-Assays. Diese Technik kann nicht nur zur mitochondrialen Atmungskette Komplexe IV quantifizieren, aber auc...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
0,5 M EDTA	Fisher Scientific	BP120-1	stellt den pH-Wert auf 8,0 ein mit NaOH
1 M NaCl	Sigma-Aldrich	S3014-500MG
1 M Natriumsuccinat	Fisher Scientific	S413-500
0,1 M Natriumphosphatpuffer pH 7,2	Fisher Scientific	BP332-1 und BP329-1	Mischen Sie 68,4 ml 1 M Na2HPO4 und 31,6 ml 1 M NaH2PO4, um 0,1 M Natriumphosphatpuffer mit einem pH-Wert von 7,2 bei 25 °C
1 M Tricin, pH 7,0 (angepasst mit NaOH)	EMD Millipore	9010	bei 4 C
1 M Imidazol/HCl, pH 7,0	Sigma-Aldrich	I-2399	bei 4 C
lagern 1 M Tris-HCl, pH 7,4	Fisher Scientific	BP153-1
20 % (wt/vol) Dodecyl-b-D-maltosid (DDM)	Fluka	44205-500MG	In Wasser gelöst. 1 ml Aliquots bei – lagern; 20 Jh.
10% (Gew./Vol) Digitonin (> 50% Reinheit, ohne Rekristallisation verwendet)	Fluka	37008-1G	In Wasser gelöst. Speicher 0.1– 1 ml Aliquots bei – 20 °C. Sollte vor Gebrauch auf 95 °C erwärmt werden.
2M 6-Aminohexansäure	Fluka	07260-100G	4 C
10x Ponceau S/Glycerin Stammlösung	Sigma-Aldrich	P-3504 und G6279-1L	0,1 % Ponceau S, 50 % Glycerin, (wt/vol) in Wasser lagern.
10% w/v Natriumdesoxycholat	Fluka	30970-25G	In Wasser gelöst. Muss vor Licht geschützt werden. pH-Wert mit HCl auf 7,0 einstellen, filtrieren und bei Raumtemperatur lagern.
250 mM Phenazinmethasulfat (PMS)	TCI America	P0083	DMSO gelöst und aliquotiert. Lagern bei – 20 Jh.
Nitroblau-Tetrazolium (NBT)	Amresco	0329-1G
3,3'-Diaminobenzidintetrahydrochlorid (DAB)	TCI America	D0078
Pb(NO3)2	Fisher Scientific	L62-100
MgSO4	Fisher Scientific	BP213-1
Trisbase	Fisher Scientific	BP152-10
Glycin	Fisher Scientific	G45-212
Adenosin-5'-triphosphat-Dinatriumsalz (ATP)	Sigma-Aldrich	A2383-5G	Grad I, mindestens 99
%Beta-Nicotinamid-Adenindinukleotid (NADH) reduzierte Form	Sigma-Aldrich	N-8129
Cytochrom c aus Pferdeherz	Sigma-Aldrich	C2506-250MG
Saccharose	Fisher Scientific	BP220-212
100x Proteasehemmer Cocktail	Sigma-Aldrich	P8340	Bei – 20 C lagern.
Dimethylsulfoxid (DMSO)	Fisher Scientific	D128-500
Trypanblauer Farbstoff 0,4%	GIBCO, von Life Technologies	15250-061
10x Trypsin (0,5%)	GIBCO, von Life Technologies	15400-054
Trypsin-Inhibitor	GIBCO, von Life Technologies	17075-029