Der vollständige Text Protokoll für diesen experimentellen Ansatz ist in <a href="http://www.mrw.interscience.wiley.com/emrw/9780471143031/cp/cpcb/article/cb0101/current/abstract" target="_blank">Current Protocols in Cell Biology</a> .

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zählen und bestimmung der lebensfähigkeit von kultivierten zellen

Counting and Determining the Viability of Cultured Cells

Ermittlung der Anzahl der Zellen in Kultur wird in der Standardisierung der Kulturbedingungen und bei der Ausübung genaue Quantifizierung Experimente wichtig. Ein Hämazytometer ist eine dicke Glasplatte mit einem zentralen Bereich als einer Zählkammer bestimmt. Zellsuspension wird auf einer definierten Fläche angelegt und zählte so Zelldichte berechnet werden kann.

Ermittlung der Anzahl der Zellen in Kultur wird in der Standardisierung der Kulturbedingungen und bei der Ausübung genaue Quantifizierung Experimente wichtig. In diesem Video zeigen wir, wie sich Zellen gezählt werden unter Verwendung eines Hämozytometers.

Zählen und Bestimmung der Lebensfähigkeit von kultivierten Zellen

Die Bestimmung der Zellzahl in einer Kultur ist wichtig für die Standardisierung der Kulturbedingungen sowie für die Durchführung präziser Quantifizierungsexperimente. Ein ...

Die Bestimmung der Zellanzahl und der Kultur ist wichtig für die Standardisierung von Kulturbedingungen und bei Experimenten, bei denen genaue Zellzahlen erforderlich sind. Hier zeigen wir Ihnen, wie man Zellen mit einem Hämozytometer zählt und die Konzentration der in Suspension vorhandenen Zellen berechnet. Außerdem zeigen wir Ihnen, wie Sie die Anzahl der lebensfähigen Zellen in Ihrer Kultur mit dem Trypanblau-Vitalitätsassay bestimmen können.Hallo, ich bin Ricky im Labor von Dr. LAN bei den Molecular Pathology Laboratories Network in Ost-Tennessee. Heute zeige ich Ihnen, wie man Zellen in Suspension zählt und ihre Lebensfähigkeit bestimmt. Um das Hämozytometer für die Zellzählung vorzubereiten, sollten Sie zunächst seine Oberfläche und den dazugehörigen Deckglaser mit 70 %igem Ethanol reinigen.Die Deckglas und Objektträger sollten sauber, trocken und frei von Fusseln, Fingerabdrücken und Wasserflecken sein. Danach die Ränder des Hämocytometers leicht mit Leitungswasser benetzen und das Deckglas darauf fest andrücken. Das Deckglas sollte gleichmäßig über dem silbernen Zählbereich aufliegen.Jetzt sind wir bereit, die Zellsuspension zur Anzahlbestimmung vorzubereiten. Zunächst, wenn die Zellen in Monoschichtkulturen gezüchtet wurden, lösen Sie die Zellen mithilfe von Trypsin von der Oberfläche der Platte ab, wie im Video zum Passagieren von Zellen gezeigt. Sobald sich die Zellen von der Platte gelöst haben, verdünnen Sie sie nach Bedarf, um eine gleichmäßige Suspension zu erhalten.Stellen Sie sicher, dass Sie eventuelle Klumpen in der Suspension zerstreuen, wenn Sie das Hämozytometer verwenden. Eine maximale Zellanzahl von 20 bis 50 Zellen pro Quadratmillimeter wird empfohlen. Wenn Sie bereit sind, das Hämozytometer mit Ihrer Zellprobe zu beladen, verwenden Sie eine Mikropipette, um die Zellsuspension an den Rand der Zählkammer des Hämozytometers zu übertragen.Halten Sie die Pipettenspitze unter die Deckglasabdeckung und geben Sie einen Tropfen der Suspension ab. Die Suspension wird durch Kapillarwirkung unter das Deckglas gezogen. Nachdem Sie die erste Kammer gefüllt haben, füllen Sie die zweite Zählkammer, und Sie können Ihre Zellen zählen, bevor Sie mit der Zählung beginnen.Die Zellen lassen Sie einige Minuten lang zur Ruhe kommen. Es ist ebenfalls hilfreich, nach dem Absetzen der Zellen überschüssige Flüssigkeit vorsichtig abzutupfen. Sie können die Probe am Mikroskop mit einer hundertfachen Vergrößerung betrachten.Sie sollten den großen, zentralen Bereich des Rasters sehen, der von einem Satz aus drei parallelen Linien begrenzt wird. Die Unterteilungen innerhalb des großen zentralen Bereichs sind ebenfalls von drei parallelen Linien umgeben, und jede Unterteilung ist durch einzelne Linien in 16 kleinere Quadrate unterteilt. Die Zellen in diesem Bereich sollten gleichmäßig verteilt sein, ohne Klumpenbildung.Wenn die Zellen nicht gleichmäßig verteilt sind, waschen und erneut beladen. Verwenden Sie das Hämozytometer und einen manuellen Zähler, um die Zellen in jedem der vier Eck- und des mittleren Quadrats zu zählen. Zellen, die die Mittellinie der Dreifachlinie an der Ober- und linken Seite der Quadrate berühren, werden gezählt; Zellen, die die Mittellinie der Dreifachlinien an der Unter- oder rechten Seite des Quadrats berühren, werden nicht gezählt.Wiederholen Sie die Zählung für die andere Zählkammer. Nachdem Sie die Zellen gezählt haben, können Sie die Anzahl der Zellen pro Milliliter bestimmen. Dazu nehmen Sie die durchschnittliche Anzahl der Zellen pro Quadrat und multiplizieren sie mit dem Verdünnungsfaktor und mit 10.000, um die Anzahl der Zellen in Ihrer Probe zu erhalten.Multiplizieren Sie die Zellen pro Milliliter mit dem Gesamtvolumen der Zellsuspension, aus der die Probe entnommen wurde. Nun sind wir bereit, die Vitalität unserer Suspension zu bestimmen. Um die Anzahl lebensfähiger Zellen in Ihrer Probe zu ermitteln, verwenden wir zunächst Trypanblau. Kombinieren Sie 0,5 Milliliter 4 % Trypanblau, 0,03 Milliliter HBSS und 0,1 Milliliter der Zellsuspension in einem kleinen Reaktionsgefäß, mischen Sie gründlich und lassen Sie das Gefäß fünf Minuten lang stehen, bevor Sie das Hämozytometer beladen.Lebensfähige Zellen sollten ungefärbt sein, während tote Zellen im Hämocytometer blau erscheinen. Zählen Sie die Gesamtanzahl der Zellen und die Gesamtanzahl der lebensfähigen, ungefärbten Zellen, und berechnen Sie den Prozentsatz lebensfähiger Zellen in Ihrer Probe. Sobald Sie fertig sind, deskontaminieren Sie das Deckglas im Hämocytometer, indem Sie es mit 70 %igem Ethanol und anschließend mit entionisiertem Wasser spülen.Lassen Sie es an der Luft trocknen und bewahren Sie es für die spätere Verwendung auf. Wir haben Ihnen soeben gezeigt, wie Sie die Anzahl und Vitalität Ihrer kultivierten Zellen bestimmen können. Das war's.Vielen Dank fürs Zuschauen und viel Erfolg bei all Ihren Experimenten.

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Molecular Pathology Laboratory Network, Inc.  Ermittlung der Anzahl der Zellen in Kultur wird in der Standardisierung der Kulturbedingungen und bei der Ausübung genaue Quantifizierung Experimente wichtig. In diesem Video zeigen wir, wie sich Zellen gezählt werden unter Verwendung eines Hämozytometers.

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