Dieses Video zeigt, wie zwei neuronalen Stimulanzien, Aldicarb und Pentylentetrazol (PTZ), in komplementärer Weise zu synaptische Funktion in dem Fadenwurm C. elegans Studie beschäftigen. Mit diesem ergänzenden Ansatz kann auch verwendet werden, um Licht auf evolutionär konservierte Mechanismen zur Modulation neuronaler Synchronität vergossen werden und hat Auswirkungen auf Epilepsie und Krampfanfällen.
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Methodenartikel
Paradigmen für pharmakologische Charakterisierung von C. elegans Synaptic Transmission Mutanten
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Der Fadenwurm Caenorhabditis elegans, hat sich eine sinnvolle Modell für die Untersuchung Neurotransmission. C. elegans ist einzigartig unter den Tiermodellen, wie die Anatomie und Anschlussfähigkeit seiner Nervensystem aus elektronenmikroskopischen Aufnahmen ermittelt und verfeinert durch pharmakologische Tests. In diesem Video, beschreiben wir, wie zwei sich ergänzende neuronalen Stimulanzien, ein Acetylcholinesterase-Hemmer genannt Aldicarb, und ein Gamma-Aminobuttersäure (GABA)-Rezeptor-Antagonist, genannt Pentylentetrazol (PTZ), eingesetzt werden können, um speziell kennzeichnen Signalisierung bei C. elegans neuromuskulären Endplatten (NMJs) und erleichtern das Verständnis der antagonistischen neuronalen Schaltkreisen.
Von 302 C. elegans Neuronen, neunzehn GABAergen D-Typ-Motoneuronen innervieren Körperwand Muskeln (BWMs), während vier GABAergen Neuronen, genannt RMEs, innervieren Kopf Muskeln. Umgekehrt äußern 39 Motoneuronen des erregenden Neurotransmitters Acetylcholin (ACh) und antagonisieren GABA-Übertragung bei BWMs die Fortbewegung zu koordinieren. Die antagonistische Natur der GABAergen und cholinergen Motoneuronen bei Körpertemperatur Wand NMJs wurde zunächst durch Laserablation ermittelt und später von Aldicarb Exposition untermauert. Akute Aldicarb Exposition führt zu einer zeitlichen Verlauf oder Dosis-responsive Lähmung in Wildtyp-Würmer. Dennoch verleiht Verlust von erregenden ACh Übergangswiderstände zu Aldicarb, als weniger ACh sammelt sich am Wurm NMJs, was zu weniger Stimulation BWMs. Der Widerstand gegen Aldicarb kann mit ACh-spezifische oder allgemeine synaptische Funktion Mutanten beobachtet werden. In Übereinstimmung mit antagonistischen GABA und ACh Übertragung, Verlust von GABA Übertragung oder einen Verstoß gegen negativ regulieren ACh Freisetzung verleiht Überempfindlichkeit gegen Aldicarb. Obwohl Aldicarb Exposition auf die Isolierung von zahlreichen Wurm Homologen der Neurotransmission Gene geführt hat, Aldicarb Exposition allein nicht effizient bestimmen vorherrschenden Rollen für Gene und Signalwege in bestimmten C. elegans Motoneuronen. Zu diesem Zweck haben wir eine komplementäre experimentelle Ansatz, der PTZ verwendet eingeführt.
Neurotransmission Mutanten Anzeige zu löschen Phänotypen, die sich von Aldicarb-induzierte Paralyse, in Reaktion auf PTZ. Wild-Typ Würmer, sowie Mutanten mit spezifischen Unfähigkeit zur Veröffentlichung oder zu empfangen ACh, zeigen nicht erkennbar Sensibilität für PTZ. Jedoch zeigen die GABA-Mutanten, sowie allgemeine synaptische Funktion Mutanten, anterior Krämpfe in einer Zeit-Gänge-oder Dosis-responsive Art und Weise. Mutanten, die nicht negativ regulieren allgemeine Freisetzung von Neurotransmittern können und somit ausscheiden übermäßige Mengen von ACh auf BWMs, gelähmt auf PTZ. Die PTZ-induzierten Phänotypen von diskreten mutierten Klassen zeigen, dass ein komplementärer Ansatz mit Aldicarb und PTZ Exposition Paradigmen in C. elegans kann unser Verständnis der Neurotransmission zu beschleunigen. Darüber hinaus sollten die Videos zeigen, wie wir pharmakologische Tests durchführen zu etablieren konsistente Methoden für C. elegans Forschung.
Protokoll
Aldicarb Exposure Paradigm
- Am ersten Tag, dass mindestens dreißig jungen erwachsenen Stadium Würmer von jedem Genotyp und der jede Wiederholung verfügbar sein wird für Aldicarb Assays am zweiten Tag. Am besten ist es, wenn ein Experimentator wählt fünfzig oder mehr L4 Stadium Würmer auf frische NGM-Platten (am besten ohne Nystatin), die E. enthalten coli (vorzugsweise OP50) als Nahrungsquelle, und wachsen sie für 12-24 Stunden bei einer konsistenten und permissiven Temperatur (20 ° C bis 22 ° C ist am besten, obwohl 25 ° C ist okay).
- Am zweiten Tag, eine 100 mM Stammlösung von Aldicarb mit 70% Ethanol (EtOH) und 30% ....
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Diskussion
Aktuelle Protokolle für Aldicarb Exposition mit C. elegans nicht zulassen Experimentatoren zwischen Mutanten mit besonderen Defiziten der ACh Übertragung und Mutanten mit generalisierten Defizite in der synaptischen Übertragung zu unterscheiden, da beide Klassen von Mutanten Resistenz gegenüber Aldicarb. Ebenso können Aldicarb nicht verwendet werden, um festzustellen, ob Mutanten spezifische Defizite in GABA Übertragung oder generalisierte Ausfälle haben, negativ zu regulieren ACh Übertragung, da beide Klassen von Mutanten Überempf.......
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Danksagungen
Wir wollen den Geist der Zusammenarbeit aller Caldwell Lab Mitglieder anzuerkennen. Ein Basil O'Connor Scholar Award der March of Dimes und ein Career Award von der National Science Foundation an GAC, sowie ein Undergraduate Research Science Program Stipendium des Howard Hughes Medical Institute an der University of Alabama haben neuronale Erregbarkeit und finanziert Epilepsie-Forschung in den Caldwell Lab.
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Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare | |
|---|---|---|---|---|
| Aldicarb | Reagenz | Supelco, Sigma-Aldrich | PS734 | Bei Sigma erhältlich |
| Pentylenetetrazol | Reagenz | Sigma-Aldrich | P6500 |
Referenzen
- Mahoney, T. R., Luo, S., Nonet, M. L. Analysis of synaptic transmission in Caenorhabditis elegans using an aldicarb-sensitivity assay. Nat. Protoc. 1, 1772-1777 (2006).
- Williams, S. N., Locke, C. J., Braden, A. L., Caldwell, K. A., Caldwell, G. A.
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Nachdrucke und Genehmigungen
