Dieses Video zeigt 2-Farben-whole mount in situ Hybridisierung, eine Methode, durch die die räumliche und zeitliche Expressionsmuster von 2 unterschiedlichen Genen visualisiert werden bei jungen Hühnerembryonen kann. Diese Methode wurde ursprünglich von David Wilkinson, Domingos Henrique, Phil Ingham und David Ish-Horowicz eingeführt.
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Methodenartikel
Doppel Whole Mount in situ Hybridisierung von Anfang Hühnerembryonen
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Der Hühnerembryo ist ein wertvolles Werkzeug in der Studie der frühen Embryonalentwicklung. Seine Transparenz, Zugänglichkeit und einfache Handhabung machen ihn zu einem idealen Werkzeug zur Untersuchung der Genexpression im Gehirn, Neuralrohr, Somiten und Herz Primordien Bildung. Dieses Video zeigt die verschiedenen Schritte in 2-Farben-whole mount in situ Hybridisierung; Erste, der Embryo aus dem Ei präpariert und fixiert in Paraformaldehyd. Zweitens ist der Embryo für Prähybridisierung verarbeitet. Der Embryo wird dann mit zwei verschiedenen Sonden, einer gekoppelten DIG, und man gekoppelt an FITC hybridisiert. Nach einer Hybridisierung über Nacht wird der Embryo mit DIG-gekoppelten Antikörper inkubiert. Farbreaktion für DIG Substrat durchgeführt wird, und die Region von Interesse blau erscheint. Der Embryo wird dann mit FITC gekoppelten Antikörper inkubiert. Der Embryo ist für Farbreaktion mit FITC verarbeitet, und die Region von Interesse erscheint rot. Schließlich ist der Embryo fixiert und phtograph verarbeitet und Schneiden. Ein Leitfaden für die Fehlersuche wird ebenfalls vorgestellt.
Protokoll
Teil 1: Befestigung des Embryos
- Füllen Sie Dissektion Schüssel mit eiskaltem DEPC-PBS. Keep on ice. Öffnen Sie das Ei, indem Sie die Schale mit einer Pinzette entfernen und Shell Stücke.
- Entfernen Sie dicke Albumin mit einer Pinzette. Tilt Dottersack mit groben Pinzette so, dass Embryos nach oben zeigt.
- Mit Schere, schnitt ein Quadrat der Dottersack rund um den Embryo.
- Mit Löffel entfernen Embryo aus Eigelb und auf Eis kalt DEPC-PBS.
- Unter dem Mikroskop entfernen Membranen und Eigelb und Transfer zum Fixieren Gericht.
- Pin nach unten, zu entfernen DEPC-PBS. Ersetzen mit 4% PFA in DEPC-PBS und ....
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Diskussion
Die 2-Farben-whole mount in situ Hybridisierung Methode wird verwendet, um sowohl die räumliche und zeitliche Muster der Genexpression zu bestimmen, mit ein oder zwei Gene von Interesse. Zu den Anwendungen gehören Beurteilung der Genexpressionsmuster von neuen Genen (zB 1,2, sowie Veränderungen in der Genexpression nach Beleidigung (embryonale Manipulationen 3, Perlen 4 und Elektroporation von RNA oder DNA-Konstrukte, 5).
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Offenlegungen
Die Autoren haben nichts offenzulegen.
Danksagungen
Diese Arbeit wurde von der Margaret M. Alkek Stiftung RHF unterstützt.
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Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare | |
|---|---|---|---|---|
| Eier | Tier | Charles River Laboratories | Premium Fertile | |
| Stereomikroskop | Mikroskop | Leica Microsystems | MZ9.5 | |
| Marsh-Automateninkubator | Werkzeug | Lyon | RX | |
| Hybridisierungsinkubator | Werkzeug | Hybaid | Micro-4 | |
| Adams Nutator Orbitalmischer | Werkzeug | Fisher Scientific | 14-062 | |
| Gebogene Pinzette (1) | Werkzeug | Electron Microscopy Sciences | 72991-4C | |
| Feinschere | Werkzeug | Fine Science Tools | 14161-10 | |
| Löffel | Werkzeug | Fine Science Tools | 10370-18 | |
| Pasteur-Kapillarpipette | Electron Microscopy Sciences | 70950-12 | ||
| Mikrokapillare | Sigma-Aldrich | P1049-1PAK | Mit vertikalem Mikropipettenzieher ziehen; stumpfes Ende mit feiner Pinzette bearbeiten | |
| Mikrodissektionsmesser | Fine Science Tools | 10056-12 | Zum Anstechen von Hohlräumen vor der In-situ-Hybridisierung verwenden | |
| Minuten-Nadeln, 0,2 mm Durchmesser | Fine Science Tools | 26002-20 | Nadeln mit einem Magnetrührer zusammenhalten; | |
| Sylgard 184 Silikon-Elastomer-Härter und -Basis | Reagenz | Dow Corning | 0001986475 | 1 Teil Härter mit 9 Teilen Basis mischen; über Nacht bei 37 °C aushärten lassen |
| Diethylpyrocarbonat (DEPC) | Reagenz | Acros Organics | 10025025 | 1 ml DEPC zu 1 l PBS hinzufügen; schütteln; autoklavieren |
| 16 % PFA | Reagenz | Electron Microscopy Sciences | 15710 | |
| Tween-20 | Reagenz | Sigma-Aldrich | P1379-100ML | |
| Proteinase K | Sigma-Aldrich | P2308-5MG | Stammlösung bei 10 mg/ml in DEPC-H₂O in 10 µl-Aliquoten. Bei -20 °C lagern. | |
| Formamid, deionisiert | Reagenz | Ambion | 9342 | |
| Hefe-tRNA-25 mg | Reagenz | Invitrogen | 15401-011 | Stammlösung bei 20 mg/ml in DEPC-H₂O in 125 µl-Aliquoten. Bei -20 °C lagern |
| Heparin-Natriumsalz | Reagenz | Sigma-Aldrich | H4784-250MG | Stammlösung bei 50 mg/ml in DEPC-H₂O in 100 µl-Aliquoten. Bei -20 °C lagern. |
| SSC 20×, pH 5,5 | Reagenz | Fisher Scientific | PR-V4261 | |
| EDTA (0,5 M) | PR-V4231 | Fisher Scientific | ||
| SDS | Reagenz | Fisher Scientific | BP166-100 | |
| Maleinsäure | Reagenz | Fluka | 63189 | |
| B–hringer-Blockierreagenz | Reagenz | Roche Group | 11096176001 | 2 % in MABT verwenden. Zum Herstellen mit MABT 20 Minuten bei 60 °C erhitzen. Stammlösung herstellen und in 1–5 ml-Aliquoten bei 20 °C lagern. |
| Hitzedinaktiviertes Schafserum | Reagenz | Jackson ImmunoResearch | 013-000-121 | In 10 ml H₂O lösen; 30 Minuten bei 55 °C erhitzen. In 1 ml-Aliquoten bei -20 °C lagern. |
| Anti-Digoxigenin-AP, Fab-Fragmente | Reagenz | Roche Group | 11093274910 | |
| NBT/BCIP-Stammlösung | Reagenz | Roche Group | 11681451001 | |
| Anti-Fluorescein-AP, Fab-Fragmente | Reagenz | Roche Group | 11426338910 | |
| 2 M Tris | BP1759-500 | Fisher Scientific | ||
| Vector Red Alkaline Phosphatase Substrate Kit | Reagenz | Vector Laboratories | SK-5100 | |
| 1,2,3,4-Tetrahydronaphthalin | Reagenz | Sigma-Aldrich | 429325-100ML | Unter Abzugshaube arbeiten |
Referenzen
- Streit, A., Berliner, A. J., Papanayotou, C., Sirulnik, A., Stern, C. D. Initiation of neural induction by FGF signaling before gastrulation. Nature. 406, 74-78 (2000).
- Rodríguez Esteban, C., Capdevila, J., Economides, A. N., Pascual, J., Ortiz, A., Izpisúa Belmonte, J. C.
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Nachdrucke und Genehmigungen
