Dieses Video zeigt 2-Farben-whole mount in situ Hybridisierung, eine Methode, durch die die räumliche und zeitliche Expressionsmuster von 2 unterschiedlichen Genen visualisiert werden bei jungen Hühnerembryonen kann. Diese Methode wurde ursprünglich von David Wilkinson, Domingos Henrique, Phil Ingham und David Ish-Horowicz eingeführt.
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Methodenartikel
Doppel Whole Mount in situ Hybridisierung von Anfang Hühnerembryonen
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Der Hühnerembryo ist ein wertvolles Werkzeug in der Studie der frühen Embryonalentwicklung. Seine Transparenz, Zugänglichkeit und einfache Handhabung machen ihn zu einem idealen Werkzeug zur Untersuchung der Genexpression im Gehirn, Neuralrohr, Somiten und Herz Primordien Bildung. Dieses Video zeigt die verschiedenen Schritte in 2-Farben-whole mount in situ Hybridisierung; Erste, der Embryo aus dem Ei präpariert und fixiert in Paraformaldehyd. Zweitens ist der Embryo für Prähybridisierung verarbeitet. Der Embryo wird dann mit zwei verschiedenen Sonden, einer gekoppelten DIG, und man gekoppelt an FITC hybridisiert. Nach einer Hybridisierung über Nacht wird der Embryo mit DIG-gekoppelten Antikörper inkubiert. Farbreaktion für DIG Substrat durchgeführt wird, und die Region von Interesse blau erscheint. Der Embryo wird dann mit FITC gekoppelten Antikörper inkubiert. Der Embryo ist für Farbreaktion mit FITC verarbeitet, und die Region von Interesse erscheint rot. Schließlich ist der Embryo fixiert und phtograph verarbeitet und Schneiden. Ein Leitfaden für die Fehlersuche wird ebenfalls vorgestellt.
Protokoll
Teil 1: Befestigung des Embryos
- Füllen Sie Dissektion Schüssel mit eiskaltem DEPC-PBS. Keep on ice. Öffnen Sie das Ei, indem Sie die Schale mit einer Pinzette entfernen und Shell Stücke.
- Entfernen Sie dicke Albumin mit einer Pinzette. Tilt Dottersack mit groben Pinzette so, dass Embryos nach oben zeigt.
- Mit Schere, schnitt ein Quadrat der Dottersack rund um den Embryo.
- Mit Löffel entfernen Embryo aus Eigelb und auf Eis kalt DEPC-PBS.
- Unter dem Mikroskop entfernen Membranen und Eigelb und Transfer zum Fixieren Gericht.
- Pin nach unten, zu entfernen DEPC-PBS. Ersetzen mit 4% PFA in DEPC-PBS und fixieren O / N bei 4 ° C.
- Entfernen Fixativ. Ersetzen Sie mit eiskaltem DEPC-PBS. Mit einem stumpfen Ende Mikrokapillare Nadel oder ein Mikrodissektion Messer, perforieren das Nervensystem und das Herz Hohlräumen, zum Einfangen der Sonde zu verhindern.
- Wash 2x 10 Minuten DEPC-PBS mit 0,1% Tween-20 (PBT). Entwässern 10 mn jeweils in 25%, 50%, 75% Methanol in PBT. Entwässern Embryonen zweimal in 100% Methanol. Lagerung bei -20 ° C in Methanol.
Teil 2: Prähybridisierung
- Rehydrieren Embryonen 10 Minuten jeweils in 75%, 50% und 25% Methanol in PBT. Wash 2x 10 min in PBT.
- In der Zwischenzeit bereiten eiskalt Fixativ (4% Paraformaldehyd in PBT). Ersetzen PBT mit Proteinase K-Lösung (3 ml / Flasche; [? 5 g / ml] Finale in PBT). Achten Sie darauf, das gesamte Gefäß mit Proteinase K-Lösung wird durch sanften das Fläschchen ausgesetzt, finden Sie unter Problembehandlung für Belichtungszeiten.
- Mit RNase frei Pasteurpipette entfernen Proteinase K und fügen Fixativ (2 ml). Sofort auf Eis Platz für genau 20 Minuten.
- Alle RT wäscht auf Kolbenpendel durchgeführt. Wash 2x 10 min in PBT, und 1x 10mn in PBT mit 50% Hybridisierungspuffer.
- Wash 1x in Hybridisierungspuffer. Inkubation bei 65 ° C in 2 ml Hybridisierungspuffer für 4-5 Stunden.
Teil 3: hybridisieren Embryonen mit Sonden
- DIG und FITC gekoppelt Sonde Synthese ist in Anhang A beschrieben. Die Sonde soll ein starkes Signal zu geben, sollte mit FITC-haltigen Nucleotiden synhesized werden, die schwächeren Sonde sollte mit mit DIG-haltigen Nucleotiden synthetisiert werden.
- Vorwärmen Sonden in Hybridisierungspuffer (500 ng / ml) mit einer 2 ml-Fläschchen. Umgehend zu ersetzen Hybridisierungspuffer mit der Sonde Lösung. Lassen Sie sich nicht die Embryonen trocken. Inkubieren für 16 h bei 65 ° C.
- Ersetzen Sonde mit Hybridisierungspuffer, 2 Wäschen, 30 mn jeweils bei 65 ° C. Wash 15 mn in Hybridisierungspuffer / MABT (1.1 v / v /) bei 65 ° C.
Teil 4: DIG Antikörper-Inkubation und Farbreaktion
- Wash 2x20 Min. in MABT. Wash 1 h in 2% BBR / MABT. Wash 5 Stunden in 2% BBR/20% HISS / MABT (Blocking-Puffer). Inkubieren in 1:2000 DIG-Antikörper in Blocking-Puffer verdünnt, O / N bei 4 ° C auf Kolbenpendel.
- 3x 10 Minuten jeweils in MABT und 3x 1 Stunde jeweils in MABT.
- Wash 2x 20 Minuten in NTMT. Add 200 &mgr; l NBT / BCIP Substrat 10 ml NTMT. Unverzüglich entfernen NTMT von Fläschchen und ersetzen mit 1-2 ml NBT / BCIP-Puffer. Legen Sie im Dunkeln. Monitor Farbreaktion nach 20 Minuten und bei 20 mn Abständen.
- Nach Farbreaktion (sollte erscheinen blau), in PBS waschen für 10 Minuten, festzunageln auf Fixierung Schale mit PBS gefüllt, und ersetzen Lösung mit 4% PFA in PBS. Fix O / N bei 4 ° C.
- Transfer zum neuen Scintillationsfläschchen. Wash in PBST (PBS mit 1% Tween-20) 2x10 mn. Wash in MABT 2x 10 Minuten.
- Inkubieren in MABT 30 mn bei 63 ° C.
Teil 5: FITC Antikörper-Inkubation und Farbreaktion
- Wash 2x 10 Minuten in MABT, 1 Stunde in 2% BBR / MABT, 5 Stunden in Blocking-Puffer
- Inkubieren in alkalische Phosphatase-gekoppelten anti-FITC-Antikörper (1:500) O / N bei 4 ° C.
- 3x 10 Minuten jeweils in MABT und 3x 1 Stunde jeweils in MABT.
- Wash in 2x 20 Minuten in TBS pH 8,45 mit 0,1% Tween-20 (TBST).
- Bereiten Vector Red funktionierende Lösung (5 ml) in TBST mit Reagenzien 1,2 und 3 in Kit zur Verfügung gestellt. Unverzüglich entfernen TBST von Fläschchen und ersetzen mit Vector Red-Puffer. Legen Sie im Dunkeln. Monitor Farbreaktion nach 40 mn, und bei 30 mn Abständen.
- Nach Farbreaktion (sollte erscheinen rot),-Embryonen zu PBS.
Teil 6: Fixation und Verarbeitung
- Transfer zum Fixieren Schale mit PBS und fix in 4% PFA für 20 Minuten bei RT oder O / N bei 4 ° C.
- Wash in PBS, 2x 10 Minuten. Für die Verarbeitung für die Fotografie, um 20% Glycerin in PBS (das macht die Embryonen transluzent) zu übertragen. So erstellen Sie eine Kammer, 2 Streifen aus PVC-Band, überlagern sie auf Folie. Schneiden Sie ein Quadrat in der Mitte mit einem Messer. Entfernen Sie den Platz mit einer Pinzette.
- Zur Bearbeitung für Wachs Schneiden, Transfer zurück zum PBS waschen 2x 10 Minuten, dehydrieren in abgestufte Reihe von Methanol (25%, 50%, 75% und 100% in PBS, 10 min jeweils).
- Ersetzen Sie mit Propanol, 3min. Ersetzen Sie mit 1,2,3,4-Tetrahydronaphthalin, gefolgt von 20 Minuten Histoclear (2x 1 Std.). Ersetzen durch histoclear / Wachs 1.1 (v / v) 60 ° C für 1 Stunde. Ersetzen mit Wachs-und Prozessfür die Histologie.
Teil 7: Lösungen
Hybridisierungspuffer, Lagerung bei -20 ° C in Falcon, 50 ml: 25 ml Formamid; 3,25 ml (20xSSC), 0,5 ml (0,5 M EDTA), 1 ml (10% Tween-20), 2,5 ml (1% SDS) ; 125 ul (20mg/ml tRNA);. 100 ul (50 mg / ml Heparin) MABT, bereiten 100 mM Maleinsäure, pH auf 7,5 mit NaOH Pellets. Add 150 mM NaCl und 0,1% Tween-20.
NTMT (made unmittelbar vor der Verwendung), 50 ml: 1 ml (5M NaCl), 2,5 ml (2M Tris-HCl pH9.5), 1,25 ml (2M MgCl 2), 5 ml (10% Tween-20).
TBST: 0,1 M Tris-HCl, 0,15 M NaCl, pH 8,45, 0,1% Tween-20.
Teil 8: Fehlersuche
| Problem | Ursache | Abhilfe |
|---|---|---|
| Embryo ist zusammengerollt | Unzureichende Dehydration / Rehydration | Halten Sie 10 Minuten Intervallen während aufeinanderfolgender Dehydration / Rehydration Schritte |
| Es gibt keine Sondensignal | Probe abgebaut wird RNase Kontamination in einem Fläschchen | Run-Sonde auf 1% Agarosegel Stellen Sie sicher, dass das gesamte Gefäß zu Proteinase K-Lösung wird in Schritt 2 ausgesetzt |
| Probe ist Etiketten Hohlräume Herzen ein Neuralrohr | Probe gefangen ist | In Schritt 2, um sicherzustellen, dass alle Hohlräume perforiert mit Mikrodissektion Messer oder Mikrokapillare |
| Embryo zerfiel nach der Hybridisierung (Schritt 3) | Proteinase K Schritt nach links zu lange Hybridisierung Temperatur zu hoch ist | Proteinase K sollte nicht länger als 1 Mio. gelassen werden (Stufen 3 + und 4), 2 mn (Stufe 5 bis 7), 3 Minuten (Stufe 8-10), 4 mn (Stufe 11-13) Nicht bei T o höhere hybridisieren als 65 o C |
Teil 9: Repräsentative Ergebnisse
Vertreter Embryonen sind unten dargestellt: (A) Embryo (Stadium HH7) ist mit einer DIG-Sox-Sonde (blau) und ein FITC-Delta-1-Sonde (rot) gekennzeichnet. (B) Embryo (Stadium HH8) ist mit einer DIG-Pax6-Sonde (blau) und ein FITC-Shh-Sonde (rot) gekennzeichnet. Nf, neuronale fach, ANP, vorderen Neuralplatte, psm, präsomitischen Mesoderm, n, Chorda, nt, Neuralrohr). Probe Geschenke aus den Labors von Drs. C. Tabin, M. Goulding, D. Henrique, und J. Briscoe. 
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Diskussion
Die 2-Farben-whole mount in situ Hybridisierung Methode wird verwendet, um sowohl die räumliche und zeitliche Muster der Genexpression zu bestimmen, mit ein oder zwei Gene von Interesse. Zu den Anwendungen gehören Beurteilung der Genexpressionsmuster von neuen Genen (zB 1,2, sowie Veränderungen in der Genexpression nach Beleidigung (embryonale Manipulationen 3, Perlen 4 und Elektroporation von RNA oder DNA-Konstrukte, 5).
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Offenlegungen
Die Autoren haben nichts offenzulegen.
Danksagungen
Diese Arbeit wurde von der Margaret M. Alkek Stiftung RHF unterstützt.
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Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare | |
|---|---|---|---|---|
| Eier | Tier | Charles River Laboratories | Premium Fertile | |
| Stereomikroskop | Mikroskop | Leica Microsystems | MZ9.5 | |
| Marsh-Automateninkubator | Werkzeug | Lyon | RX | |
| Hybridisierungsinkubator | Werkzeug | Hybaid | Micro-4 | |
| Adams Nutator Orbitalmischer | Werkzeug | Fisher Scientific | 14-062 | |
| Gebogene Pinzette (1) | Werkzeug | Electron Microscopy Sciences | 72991-4C | |
| Feinschere | Werkzeug | Fine Science Tools | 14161-10 | |
| Löffel | Werkzeug | Fine Science Tools | 10370-18 | |
| Pasteur-Kapillarpipette | Electron Microscopy Sciences | 70950-12 | ||
| Mikrokapillare | Sigma-Aldrich | P1049-1PAK | Mit vertikalem Mikropipettenzieher ziehen; stumpfes Ende mit feiner Pinzette bearbeiten | |
| Mikrodissektionsmesser | Fine Science Tools | 10056-12 | Zum Anstechen von Hohlräumen vor der In-situ-Hybridisierung verwenden | |
| Minuten-Nadeln, 0,2 mm Durchmesser | Fine Science Tools | 26002-20 | Nadeln mit einem Magnetrührer zusammenhalten; | |
| Sylgard 184 Silikon-Elastomer-Härter und -Basis | Reagenz | Dow Corning | 0001986475 | 1 Teil Härter mit 9 Teilen Basis mischen; über Nacht bei 37 °C aushärten lassen |
| Diethylpyrocarbonat (DEPC) | Reagenz | Acros Organics | 10025025 | 1 ml DEPC zu 1 l PBS hinzufügen; schütteln; autoklavieren |
| 16 % PFA | Reagenz | Electron Microscopy Sciences | 15710 | |
| Tween-20 | Reagenz | Sigma-Aldrich | P1379-100ML | |
| Proteinase K | Sigma-Aldrich | P2308-5MG | Stammlösung bei 10 mg/ml in DEPC-H₂O in 10 µl-Aliquoten. Bei -20 °C lagern. | |
| Formamid, deionisiert | Reagenz | Ambion | 9342 | |
| Hefe-tRNA-25 mg | Reagenz | Invitrogen | 15401-011 | Stammlösung bei 20 mg/ml in DEPC-H₂O in 125 µl-Aliquoten. Bei -20 °C lagern |
| Heparin-Natriumsalz | Reagenz | Sigma-Aldrich | H4784-250MG | Stammlösung bei 50 mg/ml in DEPC-H₂O in 100 µl-Aliquoten. Bei -20 °C lagern. |
| SSC 20×, pH 5,5 | Reagenz | Fisher Scientific | PR-V4261 | |
| EDTA (0,5 M) | PR-V4231 | Fisher Scientific | ||
| SDS | Reagenz | Fisher Scientific | BP166-100 | |
| Maleinsäure | Reagenz | Fluka | 63189 | |
| B–hringer-Blockierreagenz | Reagenz | Roche Group | 11096176001 | 2 % in MABT verwenden. Zum Herstellen mit MABT 20 Minuten bei 60 °C erhitzen. Stammlösung herstellen und in 1–5 ml-Aliquoten bei 20 °C lagern. |
| Hitzedinaktiviertes Schafserum | Reagenz | Jackson ImmunoResearch | 013-000-121 | In 10 ml H₂O lösen; 30 Minuten bei 55 °C erhitzen. In 1 ml-Aliquoten bei -20 °C lagern. |
| Anti-Digoxigenin-AP, Fab-Fragmente | Reagenz | Roche Group | 11093274910 | |
| NBT/BCIP-Stammlösung | Reagenz | Roche Group | 11681451001 | |
| Anti-Fluorescein-AP, Fab-Fragmente | Reagenz | Roche Group | 11426338910 | |
| 2 M Tris | BP1759-500 | Fisher Scientific | ||
| Vector Red Alkaline Phosphatase Substrate Kit | Reagenz | Vector Laboratories | SK-5100 | |
| 1,2,3,4-Tetrahydronaphthalin | Reagenz | Sigma-Aldrich | 429325-100ML | Unter Abzugshaube arbeiten |
Referenzen
- Streit, A., Berliner, A. J., Papanayotou, C., Sirulnik, A., Stern, C. D. Initiation of neural induction by FGF signaling before gastrulation. Nature. 406, 74-78 (2000).
- Rodríguez Esteban, C., Capdevila, J., Economides, A. N., Pascual, J., Ortiz, A., Izpisúa Belmonte, J. C. The novel Cer-like protein Caronte mediates the establishment of embryonic left-right asymmetry. Nature. 401, 243-251 (1999).
- Psychoyos, D., Stern, C. D. Restoration of the organizer after radical ablation of Hensen's node and the anterior primitive streak in the chick embryo. Development. 122, 3263-3273 (1996).
- Kawakami, M., Nakanishi, N. The role of an endogenous PKA inhibitor, PKIalpha, in organizing left-right axis formation. Development. 128, 2509-2515 (2001).
- Basch, M. L., Bronner-Fraser, M., Garcia-Castro, M. I. Specification of the neural crest occurs during gastrulation and requires Pax7. Nature. 441, 218-222 (2006).
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Nachdrucke und Genehmigungen
