A Behavioral Assay, um die Reaktionsfähigkeit der Zebrafisch zu Änderungen in Lichtintensitäten messen

Zusammenfassung

Wir entwickelten die Visual-Motor Reaktion auf die Motorleistung von Larven Zebrafisch als Reaktion auf Licht-und absteigende quantifizieren. Wir untersuchten auch Zebrafisch-Mutanten Vision, einschließlich der nicht optokinetischen Reaktion (NRC) Mutanten, die vermutlich völlig blind waren, als von einer anderen Vision-Assay, der optokinetischen Reflex getestet.

Zusammenfassung

Die optokinetische Reflex (OKR) ist eine grundlegende visuelle Reflex ausgestellt von den meisten Wirbeltieren und spielt eine wichtige Rolle bei der Stabilisierung des Auges relativ zum visuellen Szene. Allerdings erfordert die OKR, dass ein Tier bewegte Streifen zu erkennen und es ist möglich, dass Fische, die zu einer OKR weisen scheitern möglicherweise nicht vollständig blind. Ein Zebrafisch-Mutante, die keine optokinetischen Antwort c (NRC) hat keine OKR unter allen Lichtverhältnissen getestet und wurde berichtet, dass völlig blind. Bisher haben wir gezeigt, dass OFF-Ganglienzellen Aktivität in diesen Mutanten können aufgezeichnet werden. Um festzustellen, ob mutierte Fisch ohne OKR wie das NRC-Mutante kann einfach Licht-und absteigende entwickelten wir die visuelle Motor Verhaltens-Assay (VMR) zu erkennen. In diesem Test werden einzelne Zebrafischlarven in jede Vertiefung einer 96-Well-Platte ermöglicht die gleichzeitige Überwachung von Larven mit einem automatischen Video-Tracking-System gelegt. Der Bewegungsapparat Reaktionen der einzelnen Larve bis 30 Minuten Licht ON und 30 Minuten Licht OFF wurden aufgezeichnet und quantifiziert. WT Fische haben einen kurzen Spike der motorischen Aktivität auf Licht an, wie die Schreckreaktion bekannt, durch die Rückkehr zu niedrigeren als Baseline-Aktivität gefolgt, eine so genannte einfrieren. WT Fische drastisch steigen ihre Bewegungsaktivität unmittelbar nach Lichter ausgeschaltet und erst allmählich (über mehrere Minuten) wieder auf den Ausgangswert Bewegungsaktivität. Das NRC-Mutanten ähnlich reagieren auf Licht OFF als WT Fisch, sondern zeigen einen leichten Rückgang in ihre durchschnittliche Aktivität zu WT Fische verglichen. Motor Aktivität in Reaktion auf Licht ON in nrc Mutanten verzögert und träge. Es ist eine langsame Anstiegszeit des NRC-Mutante Reaktion auf ON zu WT Licht ON Reaktion gegenüber Licht. Die Ergebnisse zeigen, dass nrc Fisch nicht vollständig blind. Da Knochenfischen kann Licht durch nicht-retinalen Gewebe zu erkennen, bestätigt uns, dass die unmittelbare Verhaltensreaktionen auf Lichtintensität Veränderungen intakt Augen benötigen, indem Sie die chokh (chk)-Mutanten, die völlig fehlende Augen von den frühesten Stadien der Entwicklung. In unserem VMR-Assay zeigen die chk-Mutanten keine Schreckreaktion entweder Licht ON oder OFF, die zeigen, dass die seitlichen Augen dieses Verhalten zu vermitteln. Die VMR-Assay hier beschriebenen ergänzt die etablierten OKR-Assay, die nicht getestet ist die Fähigkeit des Zebrafisch-Larven auf Veränderungen in Lichtintensitäten reagieren. Darüber hinaus verleiht die Automatisierung der VMR-Test selbst zu High-Throughput-Screening für Mängel in der Lichtstärke gefahren visuelle Antworten.

Protokoll

Dieses Protokoll beschreibt die Schritte, um die Visual-Motor Reaktionszeit von Zebrafisch-Larven auf Licht-und absteigende im eigenen Labor durchführen. Zebrafische sind ein großes Vorbild für Verhaltensstudien. Sie sind leicht zu pflegen, haben sie große Kupplung Größen, und sie entwickeln sich rasch. Zum Beispiel sind die Augen des Zebrafisch-Larven reagieren, die von Tag 3 der Entwicklung und zu welchem ​​Zeitpunkt sie zeigen eine Schreckreaktion Licht.

Teil 1: Plating einzelnen Fische in eine 96-Well-Platte

1. Wachsen WT-Larven unter einem Hell / Dunkel-Zyklus bei 28 ° C bis mindestens 4 Tage nach der Befruchtung (DPF). Unsere typischen Licht: Dunkel-Zyklus ist 14 Stunden von Lichtern ON ab 09.00 Uhr, und 10 Stunden Licht aus, ab 23.00 Uhr. Für die besten Ergebnisse Verhaltensstörungen, Überfüllung zu vermeiden, behalten wir gewöhnlich nicht mehr als 50 Larven in einem einzigen Petrischale.
2. Nach 4 dpf, sind die Zebrafisch bereit, in einer 96-Well-Platte übertragen werden. Um die Larven mehr schwimmen Zimmer, wir verwenden in der Regel eine 96-Well-Platte mit einem großen, gut Größe von 650 ul, allerdings arbeiten Standard-96-Well-Platten just fine. Mit Hilfe eines Kunststoff-Transfer-Pipette vorsichtig Transfer eine Larve pro Vertiefung.
3. Nach dem Übertragen Fisch in den Brunnen, füllen Sie jedes Well mit genügend Fische Wasser, so dass die Wasseroberfläche fast bündig an der Spitze der Brunnen ist. Entweder Überfüllung oder Unterfüllung der gut kann dazu führen, optische Probleme für die Aufnahme-Kamera. Auch darauf achten, dass Blasen in den Vertiefungen einzuführen.

Teil 2: Übersicht über die Aufzeichnungsvorrichtung

Für diesen Teil des Protokolls, entnehmen Sie bitte der Film-Komponenten zu identifizieren und sich mit unserer Einrichtung von der Aufzeichnungsvorrichtung vertraut zu machen.

1. Im Inneren der Aufnahme Kammer ist eine gut definierte Ort, um die 96-Well-Platte positionieren.
2. Die Kamera ist auf der Rückseite positioniert und ist auf der Platte mit Hilfe von Spiegeln aus dem Feld konzentriert. Der Winkel dieser Spiegel kann durch Drehen der Schrauben, die den Spiegel in Position zu halten angepasst werden.
3. Die Aufnahme Kammer ist von unten durch Infrarot-LEDs beleuchtet. Dadurch kann die Kamera, um die Fische auch im Dunkeln sehen. Die Larven können nicht erkennen, IR-Licht, so dass dieses ständige IR-Beleuchtung wirkt sich nicht auf das Experiment. Weiße LEDs beleuchten auch die Aufnahme Kammer von unten. Sie sind getrennt von den IR-Beleuchtung gesteuert. Leuchtende die Kammer mit weißem Licht von oben oder von der Seite ist sicherlich möglich, aber in diesen Fällen darauf zu achten, vermeiden Sie starke starrt von der Wasseroberfläche mit der Kamera stören kann.
4. Für Experimente, die länger als ein paar Stunden, füllen die Kammer mit schwach fließendem Wasser, um eine konstante Temperatur für die Versuchsdauer. Ein Weg, um einen konstanten Fluss von Wasser zu erreichen ist, um Wasser aus einem Reservoir Pumpe durch ein kleines Aquarium Pumpe, die bis 28 ° mit einer typischen Unterwasser-Aquarium Heizer erwärmt wird.
5. Zur Minimierung von streunenden Vibrationen aus dem Raum, sollte die gesamte Aufnahme-Einheit auf einem schweren Balance Tisch sitzen.

Teil 3: Alignment der 96-Well-Platte mit dem Computer-Grid des Video-Tracking

Software

1. Platzieren Sie den 96-Well-Platte mit dem Fisch in die Messkammer.
2. Bei Verwendung eines Wasserbades, langsam wird die Platte in das Wasser, so dass der Wasserstand eine Chance, ohne etwas zu verschütten auf die Platte passen. Alternativ schalten Sie die Wassermenge, fügen Sie die Platte, und dann wieder den Fluss. Auch sicher sein, eine Feder oder ein Gummiband verwenden, um den 96-Well-Platte in Position zu halten.
3. In der Sicht VideoTrack Software, überprüfen, ob alle die Larven des Experiments zu sehen auf dem Bildschirm sind. Mit den Steuerelementen der Software richten sich die Gitter der Video-Tracking-Software mit den Vertiefungen der Platte, so dass jeder Fisch in einem Quadrat des Gitters ist. Die Tracking-Computer wird die Berechnung der Bewegung getrennt für jede dieser Boxen, so, wenn Sie die Computer-Grid misalign einige der Fische Bewegungen können verloren gehen. Oder noch schlimmer: zwei benachbarten Fische nehmen den gleichen Raum und wie man Fische gezählt werden. Dieser Schritt ist sehr wichtig für alle Ihre Aufnahmen.
4. Nach der Ausrichtung, Programm der Zeitpunkt, wann die Lichter sollten ein-und ausschalten zu gehen. Wir in der Regel erlauben 3 Stunden hell oder dunkel Anpassung in die Box sowohl um eine Grundlinie Aktivität zu erhalten, sondern auch zu geben, die Larven eine Gelegenheit, sich zu beruhigen nach dem Pipettieren und Handhabung. Nach der Grundlinie haben wir dann im Wechsel mit 30 Minuten leuchtet ON von 30 Minuten von Lichtern OFF gefolgt und mehrmals wiederholen.
5. Als nächstes schließen Sie die Tür der Aufnahme Kammer und starten Sie die Aufnahme.
6. In der Praxis erfassen wir die Aktivität der einzelnen Fische pro Sekunde, aber der Viewpoint-Software in der Tat zeichnet die Frame für Frame-Daten (siehe den Filmfür eine Demonstration der Datenerhebung). Einstellen der Schwellenwert für die minimale Pixel ändern pro Frame hängt etwas von Ihrer Kamera und Licht-Setup. Für unser Setup, wir verwenden in der Regel ein Schwellenwert von 4 Pixeln, das heißt, wenn weniger als 4 Pixel verändert werden, wird davon ausgegangen Hintergrund. Wenn mehr als 4 Pixel bewegen, gibt es die Fische in Bewegung ist. Wir empirisch ermittelt, dass dieser Grenzwert nahezu erkennt alle Larven schwimmen und biegen Bewegungen.
7. Auch wenn die Aufnahme-Boxen die Larven isolieren ziemlich gut, schalten Sie das Licht in den Raum und kümmern uns um Unterbrechungen mit mechanischen Geräusche wie das Schließen und Öffnen von Türen in den Raum, mit einer Dance-Party, oder tut Ihr Training zu minimieren.

Teil 4: Die Analyse der Daten

1. Nach dem Experiment ist abgeschlossen, übertragen Sie die Daten in eine Excel-Tabelle oder in Ihrem Lieblings-Analyse-Suite gesammelt.
2. Die beigefügte Excel-Tabelle ist ein Beispiel, wie die Daten aussehen kann: Sie enthält die Zeit in Sekunden nach dem Start des Experiments und der Aktivität der einzelnen Larve pro Sekunde für den Fisch während des gesamten Experiments (Siehe ergänzende Datei Beispiel Daten in der Files-Sektion auf dieser Seite).
   
   
3. Abbildung 1 zeigt ein Beispiel für die Aktivität eines einzelnen Larve. Abbildung 2 ist eine repräsentative Spur der Durchschnitt von 40 WT Zebrafisch-Larven. Die gemittelten ON und OFF Reaktionen sind prominente und konsequent.
   
   
   
   Abbildung 1: Aktivität eines einzelnen Fisches Die Aktivität eines einzelnen WT Fisch bei 5 dpf in Reaktion auf wechselnde Perioden von 30 Minuten Licht an und aus.. Die ON-Reaktionen werden durch schwarze Pfeile und die OFF Antworten mit roten Pfeilen gekennzeichnet.
   
   
   
   Abbildung 2: Durchschnittliche Aktivität von 40 Fischen Die durchschnittliche Aktivität von 40 WT Fisch bei 5 dpf in Reaktion auf wechselnde Perioden von 30 Minuten Licht an und aus.. Die gemittelten ON (schwarze Pfeile) und OFF (rote Pfeile) Reaktionen sind prominente und konsequent.

5. Repräsentative Ergebnisse

Abbildung 3 zeigt eine schematische Übersicht über die experimentellen Entwurf in allen unseren Experimenten verwendet.



Abbildung 3. Experimentelle Gestaltung des Visual Motor Response (VMR) zu testen. A) Individuelle Fische sind in einer 96-Well-Platte in einer Aufnahme Kammer platziert. Die Aktivität der einzelnen Fisch pro Sekunde gemessen. B) Die Fische werden über einen Zeitraum von dunklen oder hellen Anpassung an ihnen ansiedeln und zu einer Baseline-Aktivität zu erhalten gegeben. Perioden von 30 Minuten leuchtet ON und OFF Lichter werden nacheinander für insgesamt 3 Stunden eingeführt. Dieses Diagramm wurde von Prober et al angepasst., 2006.

Was bedeuten die Visual-Motor Reaktionszeit Graphen aussehen?

Wir maßen die ON und OFF Reaktionen der WT Fisch ans Licht vergrößert und verkleinert. Um zu bestätigen, dass diese Antworten abhängig von Augen-Funktion wurden, maßen wir die Aktivität von chk-Mutanten, die nicht entwickeln keine Augen. Abbildung 4 zeigt die durchschnittliche Aktivität von WT Tieren sowie die chk erhaltenen Mutanten.



Abbildung 4: WT Fische ON und OFF Reaktionen, die durch die seitlichen Augen vermittelt werden klar die Fortbewegung des Zebrafisch-Larven bei 5 dpf in Reaktion auf 30 Minuten Licht ON und 30 Minuten Licht AUS pro Sekunde aufgezeichnet wird.. Jede Spur entspricht einem durchschnittlich 480 Antworten aus 120 einzelnen WT (blaue Kurve) oder chk mutierten Larven (orange Kurve) aufgezeichnet über 3 Experimente. Die chk-Mutanten nicht wesentlich erhöhen ihre Aktivität bis leicht erhöht oder verringert und haben einen niedrigen Ausgangswert Umfang der Tätigkeit. Diese Zahl wurde von Emran et al., 2007 angepasst.

Visual-Motor Antworten von der NRC mutierten Fische.

Das NRC-Mutante wurde angenommen, dass völlig blind auf der Grundlage der OKR testen. In den NRC-Mutante, nicht der Photorezeptor-Terminals nicht richtig bilden und die On Sehbahn ist stark gefährdet ^ein. Retinalen Ganglienzellen Aufnahmen aus dieser mutierten Fische zeigten, dass sie überwiegend Ausstellung OFF-type Ganglienzelle Antworten, einige anormale ON-OFF, aber keine reine On-Typ Reaktionen ^2.

Mit dem VMR-Test haben wir gezeigt, dass die NRC-Mutante eine normale OFF-Reaktion und eine verzögerte und träge ON-Antwort hat (see Abbildung 5). So ist die NRC-Mutante nicht völlig blind, als bisher angenommen ^2.


Abbildung 5: NEU mutats erhöhen ihre Aktivität in Reaktion auf Veränderungen in Lichtintensitäten Verhaltensreaktionen auf Licht an und aus von WT und NRC mutierten Larven bei 5 dpf.. Jede Spur entspricht einem durchschnittlich 480 Antworten aus 120 einzelnen Fisch aus jedem Genotyp. Die durchschnittliche Fortbewegung des NRC-Mutanten (pink Spuren) ist geringfügig im Vergleich zu WT Fisch (blau Spuren) reduziert, bleibt aber kräftig nach dem Licht AUS Reiz. Beachten Sie die langsame Anstiegszeit in der NRC-Mutante Reaktion auf ON im Vergleich zu ON Reaktion des WT Fisch light light.

Diskussion

Die experimentellen Verfahren zeigen wir im Film sind alle Vertreter der WT Fisch. Allerdings können diese Experimente analog auf mutierte Fisch sowie (siehe repräsentatives Ergebnis Abschnitt) durchgeführt werden. Wir schlagen vor, Platte WT Fisch und mutierte Fische auf der gleichen Platte in ein Schachbrett Entwurf für eine optimale Kontrolle.

Bei der Verwendung von mutierten Fische auf der gleichen Platte wie WT Fisch sicher, dass Sie aufschreiben, welche Art von Fisch in jeder Vertiefung wurde vergoldet. Hier ist ein Vorschlag,...

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Mikroplatten-Geräte	Werkzeug	Whatman, GE Healthcare	7701-1651
Transferpipetten	Werkzeug	VWR international	202205
Fischwasser	Reagenz			verweise auf Referenz #4
Aufzeichnungskammern (Zebrabox)	Werkzeug	Viewpoint Lifesciences
Videotrack-Software	Werkzeug	Viewpoint Lifesciences