Selektive Markierung von Zelloberflächen-Proteinen unter Verwendung von CyDye DIGE Fluor Minimal Farbstoffe

Summary

Eine einfache und spezifische Methode wurde für Fluoreszenzmarkierung und verbesserte Erkennung von Zelloberflächen-Proteine ​​ohne Fraktionierung Schritt demonstriert. Differential Fülle in Zelloberflächenproteine ​​wurde mittels zweidimensionaler (2-D)-Elektrophorese und Ettan ™ DIGE Technologie.

Abstract

Oberflächen-Proteine ​​sind von zentraler Bedeutung für die Fähigkeit der Zelle auf ihre Umwelt reagieren und mit den benachbarten Zellen zu interagieren. Sie sind dafür bekannt, Induktoren von fast allen intrazelluläre Signalwege werden. Darüber hinaus spielen sie eine wichtige Rolle im Umweltschutz Anpassung und medikamentöse Behandlung, und sind oft in der Krankheitsentstehung und die Pathologie (1) beteiligt. Protein-Protein-Wechselwirkungen sind untrennbar mit Signalwegen, und einen tieferen Einblick in diese komplexe biologische Prozesse zu gewinnen, sind empfindlicher und zuverlässiger Methoden zur Untersuchung von Zelloberflächen-Proteine ​​benötigt werden. Zweidimensionale (2-D)-Elektrophorese wird weitgehend für den Nachweis von Biomarkern und anderen Zielen in komplexen Protein-Proben, um differentielle Änderungen Studie verwendet. Zelloberflächenproteine, teils wegen ihrer geringen Menge (1 2% der zellulären Proteine) sind schwierig, in einem 2-D Gel ohne Fraktionierung oder eine andere Art der Bereicherung zu erkennen. Sie sind auch oft schlecht in 2-D Gelen aufgrund ihrer hydrophoben Natur und mit hohem Molekulargewicht (2) vertreten. In dieser Studie präsentieren wir ein neues Protokoll für intakte Zellen mit CyDye DIGE Fluor minimal Farbstoffe zur spezifischen Markierung und Erkennung von dieser wichtigen Gruppe von Proteinen. Die Ergebnisse zeigten, spezifische Markierung von einer großen Anzahl von Zelloberflächen-Proteine ​​mit minimalen Kennzeichnung von intrazellulären Proteinen. Dieses Protokoll ist eine schnelle, einfach zu bedienen, und alle drei CyDye DIGE Fluor minimal Farbstoffen (Cy 2, Cy 3 und Cy 5) kann verwendet werden, um Zelloberflächen-Proteine ​​zu markieren. Diese Funktionen ermöglichen zum Multiplexen mit der 2-D-Fluoreszenz Difference Gel-Elektrophorese (2-D DIGE) mit Ettan DIGE Technologie und Analyse der Proteinexpression Änderungen mit DeCyder 2-D Differential Analysis Software. Die Höhe der Zelloberfläche Proteine ​​wurde während Serumentzug von CHO-Zellen für verschiedene Zeitspannen (siehe Tabelle 1). Kleine Veränderungen in Hülle und Fülle wurden mit hoher Genauigkeit erfasst und die Ergebnisse sind definiert durch statistische Methoden unterstützt.

Protocol

Zellkultur

1. Wachsen Ovarialzellen des chinesischen Hamsters (CHO-K1) mit Standard-Zellkultur Verfahren in F-12 Ham Medium mit Glutamax I mit 10% fötalem Kälberserum, 50 U / ml Penicillin und 50 ug / ml Streptomycin-Sulfat (Invitrogen).
2. Austausch des Kulturmediums auf serum-freien Medien. Beschriften Sie die Zelloberfläche Proteine ​​wurden zu verschiedenen Zeitpunkten mit CyDye DIGE Fluor Cy3 oder Cy5 minimal Farbstoffe (siehe Abschnitt Cell Surface Labeling, unten).
3. Pool gleiche Anzahl von Zellen, die aus jedem Zeitpunkt und Etikett mit CyDye DIGE Fluor Cy2. Verwenden Sie diese als interner Standard für die einzelnen 2-D-Gel. <....

Discussion

Protein-Konzentration

Eine Übersicht über die beiden Kennzeichnung Workflows ist in Abbildung 1 dargestellt. Da die Zellen noch intakt sind, wenn sie gemäß der Zelloberfläche Proteinmarkierung Protokoll bezeichnet, werden nur die Zelloberflächenproteine, um den Farbstoff ausgesetzt. In der Standard-Ettan DIGE-Protokoll werden die Zellen lysiert vor der Etikettierung und Proteinen sowohl innerhalb als auch außerhalb der Zelle gekennzeichnet sind (Abb. 1). Die relative Menge des Farbstoffs an Pr.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
CyDye DIGE Kit, 2 nmol	Reagenz	GE Healthcare	28-9345-30
2-D Quant Kit	Reagenz	GE Healthcare	80-6484-51
IPG Puffer pH 3-11NL	Reagenz	GE Healthcare	17-6004-40
Immobiline DryStrip pH 3-11NL, 24 cm	Reagenz	GE Healthcare	17-6003-77
IPGbox	Werkzeug	GE Healthcare	28-9334-65
IPGbox-Kit	Werkzeug	GE Healthcare	28-9334-92
DeStreak Rehydrationslösung	Reagenz	GE Healthcare	17-6003-19
Immobiline DryStrip Cover	Fluid Reagenz	GE Healthcare	17-1335-01
Ettan IPGphor 3 IEF Unit	Instrument	GE Healthcare	11-0033-64
Ettan IPGphor Verteiler	Instrumentenkomponente	GE Healthcare	80-6498-38
Ettan DALTtwelve Gel-Rollenwerkzeug		GE Healthcare	80-6467-22
Ettan DALTtwelve Trenneinheit und Netzteil-/Steuereinheit	Instrument	GE Healthcare	80-6466-46	230 V Einheit: 80-6466-27
Typhoon 9410 Variabler Imager	Instrument	GE Healthcare	63-0055-81
Ettan Spot Picker	Instrument	GE Healthcare	18-1145-28
Ettan Fermenter	Instrument	GE Healthcare	18-1142-68
Ettan Spotter	Instrument	GE Healthcare	18-1142-67
Ettan MALDI-TOF	Instrument	GE Healthcare	18-1142-33
DeCyder 2-D-Differentialanalysesoftware	Sonstiges GE	Healthcare	28-4012-01
ImageQuant Analysesoftware	Sonstiges	GE Healthcare	28-9236-62
Harnstoffreagenz		GE Healthcare	17-1319-01
CHAPS-Reagenz		GE Healthcare	17-1314-01
PlusOne Dithiothreitol (DTT)	Reagenz	GE Healthcare	17-1318-01
Bromphenolblau-Reagenz		GE Healthcare	17-1329-01
Tris-Reagenz		GE Healthcare	17-1321-01
Natriumdodecylsulfat (SDS)	Reagenz	GE Healthcare	17-1313-01
PlusOne Glycerol 87%	Reagenz	GE Healthcare	17-1325-01
PlusOne ReadySol IEF 40% T, 3% C	Reagenz	GE Healthcare	17-1310-01
PlusOne TEMED	Reagenz	GE Healthcare	17-1312-01
PlusOne Ammoniumpersulfat	Reagenz	GE Healthcare	17-1311-01
PlusOne Glycin	Reagenz	GE Healthcare	17-1323-01
2-D-Probenvorbereitung für Membranproteine	Reagenz	Pierce, Thermo Scientific	89864
Streptomycinsulfat	Reagenz	Invitrogen	15140-122