Dies ist ein Protokoll beschreibt, wie zu isolieren und Kultur primären sympathischen Neuronen aus überlegen Halsganglien (SCG) der neugeborenen Ratte Welpen.
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Methodenartikel
Protokoll zur Kultivierung sympathischen Neuronen aus Ratten-Superior Halsganglien (SCG)
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Die überlegene Halsganglien (SCG) in Ratten sind klein, glänzend, mandelförmige Strukturen, die sympathischen Neuronen enthalten. Diese Neuronen liefern sympathischen Innervationen für die Kopf-Hals-Region, und sie stellen eine gut charakterisierte und relativ homogenen Bevölkerung (4). Sympathischen Neuronen sind abhängig von nerve growth factor (NGF) für das Überleben, Differenzierung und axonalen Wachstum und der weit verbreiteten Verfügbarkeit von NGF erleichtert, ihre Kultur und experimentelle Manipulation (2, 3, 6). Aus diesen Gründen haben kultivierten sympathischen Neuronen in einer Vielzahl von Studien, einschließlich der neuronalen Entwicklung und Differenzierung, die Mechanismen des programmierten und pathologischen Zelltod und Signaltransduktion (1, 2, 5 und 6) verwendet worden. Dissecting die SCG von neugeborenen Ratten und Kultivierung sympathischen Neuronen ist nicht sehr kompliziert und kann ziemlich schnell gemeistert werden. In diesem Artikel werden wir im Detail beschreiben, wie Sie sezieren die SCG von neugeborenen Ratten Welpen und sie zu nutzen, um Kulturen von sympathischen Neuronen zu etablieren. Der Artikel beschreibt auch die vorbereitenden Schritte und die verschiedenen Reagenzien und Geräte, die benötigt wird, um dies zu erreichen sind.
Protokoll
1. Vorbereitung für die Zerlegung:
- Wählen Sie den entsprechenden Kulturschale (10 cm oder 6-well oder 24-Well-Platten, etc.) abhängig von der Art Ihrer Experimente und überziehen sie mit Rattenschwanz Collagen 24 Stunden vor dem Sezieren. Das Verfahren zur Herstellung von Rattenschwanz Collagen und dessen Verwendung zur Beschichtung von Kulturschalen wurden an anderer Stelle (1) beschrieben.
- Bereiten Sie eine 0,25% Trypsin-Lösung in Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung (PBS) (kein EDTA) und Filter zu sterilisieren. Bereiten Sie 1 ml aliquotiert und bei -20 º C.
- Bereiten Sie eine Lösung, die 2,5 mM jeweils von Uridin und 5-FDU in destillie....
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Diskussion
Wir verwenden Sprague Dawley Ratten für unsere Kulturen.
Nehmen Sie sich Zeit und Sorgfalt bei der Reinigung der Ganglien. Entfernen Sie alle Fremdkörper, Blutgefäße und Fett. Dieser Schritt ist bei der Gewährleistung einer Kultur, die mehr oder weniger homogen und frei von fremden Zelltypen ist wichtig. Die Zugabe von uridine/5-FDU wird weitgehend beseitigt alle restlichen nicht-neuronalen (Mitose) Zellen Kontamination der Kultur oder zumindest zu unterdrücken ihre Verbreitung.
Darüber hinaus, während die Dissoziation Schri.......
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Offenlegungen
Die Autoren haben nichts offenzulegen.
Danksagungen
NZ möchte lab Mitglieder Subhas Biswas, Andrew Sproul und Ryan Willet für die Ausbildung ihrer in sezieren und Ernte sympathischen Neuronen zu danken. Unterstützt durch Zuschüsse aus dem NIH-NINDS.
....Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.
Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare | |
|---|---|---|---|---|
| Pinzette, Edelstahl #5 | Werkzeug | Roboz Surgical Instruments Co. | RS4976 | |
| Schere, DEAVER gerade, scharf-stumpf – 43 mm Klingen – 5,5 | Werkzeug | Roboz Surgical Instruments Co. | RS6760 | |
| RPMI 1640 mit L-Glutamin | Reagenz | Cellgro | 10-040-CV | |
| Fötales Rinderserum | Reagenz | SAFC Global | 12103c | |
| Spenderpferdeserum | Reagenz | JRH Biosciences | 12449 | Hitzeinaktivierung durch 30-minütiges Inkubieren im 56°C-Wasserbad. |
| Penicillin/Streptomycin | Reagenz | GIBCO, von Life Technologies | 15140-122 | |
| Trypsin ohne EDTA | Reagenz | Difco Laboratories | MT 25-050-CI | |
| Uridin | Reagenz | Sigma-Aldrich | U3003 | |
| 5-Fluoro-5’-deoxyuridin | Reagenz | Sigma-Aldrich | F-8791 | |
| NGF | Reagenz | Harlan Laboratories | BT-5025 | |
| Präparationsmikroskop und Lichtquelle | Mikroskop | |||
| 15-ml-Polypropylenröhrchen | Werkzeug | BD Biosciences | 352096 | |
| Zellkulturschalen | Werkzeug | Corning |
Referenzen
- Banker, G., Goslin, K. Culturing Nerve Cells. , MIT Press. (1998).
- Biswas, S. C., Shi, Y., Sproul, A., Greene, L. A. Pro-apoptotic Bim Induction in Response to Nerve Growth Factor Deprivation Requires Simultaneous Activation of Three Different Death Si....
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Nachdrucke und Genehmigungen
