Embryonale Stammzellen gewonnenen Endothelzellen zur Behandlung von Ischämie Hinterlauf

Periphere arterielle Verschlusskrankheit. PAD entsteht durch eine Verengung der peripheren Arterien, die Beine und Füße mit Blut und Sauerstoff versorgen, was zu einer vaskulären Dysfunktion führt. Um zu bestimmen, ob Stammzellen zur Behandlung der PAD eingesetzt werden können, injizieren wir aus embryonalen Stammzellen abgeleitete endotheliale Zellen in die Hinterextremität nach Induktion einer Ischämie.

Da diese Zellen so verändert wurden, dass sie Feuerflieluciferase exprimieren, können sie mittels Biolumineszenzbildgebung verfolgt werden, um festzustellen, ob sie zum Verletzungsort wandern und eine therapeutische Wirkung entfalten. Hallo, ich bin John Cook. Ich bin Professor für Medizin in der Abteilung für Kardiovaskuläre Medizin an der Stanford University.

Unser Labor beschäftigt sich mit Angiogenese und vaskulärer Regeneration. In diesem Video stellen Ihnen zwei meiner Postdoktoranden, Dr. Nan Wong und Hir Niyama, Verfahren zur therapeutischen Zelltransplantation bei hindlimb-Ischämie und zur nichtinvasiven Bildgebung des Zellüberlebens vor. Diese Verfahren umfassen die folgenden Schritte: die Applikation von aus embryonalen Stammzellen abgeleiteten Stereozellen zur Behandlung einer einseitigen hinteren Extremitätenischämie sowie das nichtinvasive Verfolgen von Zellverteilung und -überleben mittels Biolumineszenz-Bildgebung.

Beginnen wir. Starten Sie das Verfahren, indem Sie eine acht Monate alte SV 1 29 Stamm-Maus vorbereiten, die einer Hintergliedmaßen-Ischämie für die Zelltransplantation unterzogen wurde. Platzieren Sie hierzu die Maus in die Anästhesie-Induktionskammer mit ein bis 3 % ISO-Fluoran in 100 % Sauerstoff bei einer Flussrate von einem Liter pro Minute.

Lassen Sie die Maus im Induktionskammer, bis sie nicht mehr auf äußere Reize reagiert. Entfernen Sie dann das Tier aus der Induktionskammer. Anschließend platzieren Sie das Tier in Rückenlage auf dem Operationstisch und schließen es an einen kontinuierlichen Durchfluss von ein bis 3 % ISO in 100 % Sauerstoff bei einer Flussrate von einem Liter pro Minute an.

Reinigen Sie die Haut des Hinterbeins mit drei abwechselnden Abreibungen mit Betadine und Alkohol. Nach der Reinigung der Haut werden 1 Million aus murinen embryonalen Stammzellen abgeleitete endotheliale Zellen in 30 Mikroliter gepufferter Kochsalzlösung (PBS) gewonnen. Diese Zellen werden mit PBS in eine 28-Gauge-Nadel aufgezogen.

Wenn die Zellen bereit sind, heben und strecken Sie das Hinterbein vorsichtig, um die Lage des Musculus gastrocnemius besser visualisieren zu können. Während das Bein gestreckt ist, führen Sie die Nadel durch die Haut in den darunterliegenden Muskel ein. Achten Sie darauf, den Knochen nicht zu verletzen, und injizieren Sie langsam die 30 Mikroliter große Zellmischung in den Musculus gastrocnemius.

Für eine intramuskuläre Injektion liegt 30 µL nahe am Grenzwert des injizierbaren Volumens. Daher werden Insulinspritzen mit Kanüle der Größe 28 Gauge bevorzugt, da sie nach unserer Erfahrung das Verlustvolumen in den Spritzenkanülen vermeiden. Nach Abschluss der Injektion das Mäuschen in den Erholungskäfig zurückbringen.

Lassen Sie das Tier mehrere Stunden lang auskuriern und führen Sie anschließend die in-vivo-Biolumineszenz-Bildgebung der transplantierten Zellen durch. Die transplantierten aus ESCs abgeleiteten endothelialen Zellen wurden so modifiziert, dass sie sowohl das Gen für das Glühwürmchen-Luciferase-Gen als auch das Fusionsgen für das verbesserte grüne Fluoreszenzprotein unter Kontrolle eines internen Ubiquitin-Promotors exprimieren. Daher kann die Biolumineszenz verwendet werden, um die Zellen im ischämischen Hinterbein zu verfolgen.

Um diesen Schritt zu beginnen, schalten Sie das Biolumineszenz-Bildgebungssystem und die Living-Image-Aufnahmesoftware ein. Anschließend initialisieren Sie das Aufnahmesystem und geben dann die Abmessungen des Sichtfelds vor.

Als Nächstes schwarzes Tonerpapier in die Ablichtungskammer legen, um die Hintergrundemission zu absorbieren. Sobald die Ablichtungskammer bereit ist, die Maus in die Narkoseinduktionskammer geben, die ein bis 3 % Isofluran in Sauerstoff mit einem Durchfluss von einem Liter pro Minute enthält. Die Maus so lange in der Induktionskammer belassen, bis sie nicht mehr auf äußere Reize reagiert.

Entfernen Sie dann das Tier aus der Induktionskammer. Injizieren Sie 10 Mikroliter Luciferin pro Gramm Körpergewicht in das Peritoneum. Das Luciferin wird im Voraus in gefilterten Stammlösungen mit 15 Milligramm pro Milliliter in PBS vorbereitet.

Nach der Injektion des Luciferins wird das Tier in Rückenlage auf das schwarze Papier in die Bildgebungskammer gelegt und mit einem kontinuierlichen Fluss von ISO-Fluor verbunden. Es werden Bilder für 10 bis 60 Sekunden aufgenommen, um die optimale Belichtungszeit zu bestimmen, bei der das Bild nicht gesättigt ist. Falls das Bild gesättigt wird, ist die Belichtungszeit zu verkürzen.

Wenn das Biolumineszenzsignal sehr schwach ist, erhöhen Sie die Belichtungszeit. Verwenden Sie die optimale Belichtungszeit und nehmen Sie weiterhin alle ein bis drei Minuten Bilder auf, bis das Signal sein Maximum erreicht und anschließend abklingt. Speichern Sie nach Abschluss jeder Aufnahme die Datei, um die Daten zu analysieren, und wählen Sie interessierende Bereiche oder ROIs aus, die die Injektionsstelle abdecken, als negative Kontrolle.

Eine ähnliche ROI kann für das nicht operierte Bein ausgewählt werden. Mit der Software die Gesamtstrahlstärke für dieselben ROIs in jeder Datei messen.

Der Maximalwert sollte in den endgültigen Daten verwendet werden. Die Daten können außerdem zur späteren Verwendung in eine Excel-Tabelle exportiert werden. Sobald alle Daten erfasst sind, das Tier in den Erholungskäfig zurückbringen und überwachen, bis es wieder aufwacht; wiederholen Sie diesen Vorgang, um die Zellen zu verfolgen.

Über einen gewünschten Zeitraum hinweg kann das Tier zu einem bestimmten Zeitpunkt euthanasiert werden, um die Gewebefunktion zu beurteilen. Hier ist ein repräsentativer zeitlicher Verlauf der Biolumineszenzbildgebung transplantierten Zellen im linken ischämischen Hinterglied am Tag nach der Zellinjektion; der in Rot umkreiste Bereich ist die Region von Interesse (ROI), in die die Zellen appliziert wurden. Die Farbe korreliert mit der Anzahl der transplantierten Zellen, wobei rote und gelbe Farben eine stärkere Biolumineszenzintensität im Vergleich zu blauen und grünen Farben anzeigen.

Wie Sie sehen können, weist das Kontrollgliedmaß keine Biolumineszenz auf, während das mit Zellen injizierte Gliedmaß während der Erfassung der Biolumineszenz eine starke Biolumineszenz zeigt. In dieser Abbildung nimmt das Biolumineszenzsignal in der interessierenden Region (ROI) im Laufe der Zeit zu, erreicht einen Maximalwert und nimmt anschließend wieder ab. Der maximale Biolumineszenzwert, gemessen als maximale Strahldichte, wird 27 Minuten nach Beginn der Aufnahme erreicht.

Dieser Maximalwert sollte für die Datenanalyse angegeben werden. Wir haben Ihnen gerade gezeigt, wie man aus ESCs stammende serielle Zellen zur Behandlung einer hinteren Extremitätenischämie verabreicht und verfolgt. Dieses Verfahren kann durch die Induktion einer hinteren Extremitätenischämie vorangestellt werden, die in einem anderen JoVE-Video von ER et al. demonstriert wird.

Bei diesem Verfahren ist es wichtig, das Volumen der injizierten Zellen in PBS auf maximal 30 Mikroliter zu begrenzen, um ein subkutanes Austreten der Zellen zu verhindern. Außerdem sollte bei der Aufnahme von Biolumineszenzbildern vermieden werden, dass die Bildintensität durch zu lange Belichtungsintervalle gesättigt wird. Das war's.

Vielen Dank fürs Zuschauen und viel Erfolg bei Ihren Experimenten.