Name: Herstellung von amperometrische Elektroden (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-05-04T00:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 29 s
Description: Lernen Sie die Herstellung von Kohlenstofffaserelektroden zur Detektion von Katecholaminfreisetzung aus Vesikeln in Einzelzellen. Diese Methode ermöglicht präzise neurochemische Messungen mit geringem Rauschen.

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Wir danken Dr. Aaron P. Fox an der Universität von Chicago, in dessen Labor das Protokoll wurde ursprünglich entworfen, und William Roden (Saint Louis University) für die Weiterentwicklung des Protokolls. Wir danken der Whitehall-Stiftung und National Science Foundation für die Unterstützung.

Teil 1: Carbon Fiber Preparation <ol><li> Cut ein Bündel von Kohlenstoff-Fasern (wir verwenden 7μm Durchmesser) auf eine Länge ~ 1,25 X die Länge der Kapillare Pipette wird. </li><li> Entfernen Sie die Dimensionierung durch Kochen ~ 100 ml Aceton in einen Behälter und Zugabe der Fasern zu den heißen, siedendem Aceton für 30 Minuten oder länger. </li><li> Entfernen Fasern aus dem warmen Aceton, und in ein sauberes Becherglas mit 50-100 ml frischem Aceton. </li><li> Trockene Fasern, indem das Bündel auf einer offenen 150 mm Petrischale und lufttrocken Nacht. </li></ol> Teil 2: Feuerpolieren Glaskapillaren <ol><li> Fire-polnisch jeder Kapillare (wir benutzen Mikro-Hämatokrit-Kapillarröhrchen, 1,5 mm Außendurchmesser, 1,3 mm Innendurchmesser, 7,5 cm lang), indem das Rohr in der Mitte mit einer Pinzette und Freilegen der Ende der flame.Rotate das Rohr über 3-mal, während in der Flamme. </li><li> Kehren Sie die Röhrchen und setzen Sie das andere Ende in die Flamme wieder rotierenden 3-mal. </li><li> Legen Sie die feuerpolierte Rohre in eine Glasschale und Transfer zum Ofen, bis sie bereit sind, mit Carbon-Fasern gefüllt werden sollen. </li></ol> Teil 3: Threading einem Kohlefaser in einer Kapillare <ol><li> Ähnlich wie bei den Beschreibungen von Machado et al. (2008) und Mundroff und Wightman (2002), saugen die Faser in das Glasrohr mit Kunststoffschlauch verbunden, um ein Vakuum mit einem Filter. </li><li> Schneiden Sie die Faser mit Hilfe eines scalpel.Leave ¼ inch der Faser aus dem Rohr. </li></ol> Teil 4: Pulling Pipette-Fiber in einer Elektrode Puller <ol><li> Legen Sie Kapillare in die Elektrode Abzieher (wir verwenden Narishige Japan Modell PP-830) und ziehen Sie die Regler in die Kapillare in Position zu halten. </li><li> Bearbeiten Sie die Schalter auszuführen zwei Züge, setzen Sie auf die optimale puller Einstellungen. </li><li> Nachdem die Pipette in der Hälfte gezogen wird, trennen Sie die zwei Hälften, indem die nackten Faser in der Mitte mit einer Schere. </li><li> Entfernen Sie jede Elektrode Hälfte und Zug auf die hervorstehenden Fasern zu brechen das Glas seal.Trim die Faser mit einer Schere, so dass nur 1 / 8 Zoll von Faser außerhalb der Röhre bleibt. </li><li> Wiederholen Sie die Schritte 1-4, bis etwa 16-Faser-Elektroden gezogen werden. </li></ol> Teil 5: Making Epoxy-Glass Seal <ol><li> Erhitzen Sie eine vorgefertigte Aliquot Epoxy auf einer heißen Platte gesetzt bis 55 ° C für 6 Minuten in einem Abzug. </li><li> Während Epoxidharz Heizung, wrap ~ 16 des gezogenen Elektroden in ein Bündel mit Klebeband. </li><li> Nach dem Epon Resin für 6 Minuten erwärmt ist, fügen Sie 0,7 Gramm XOF MPDA zu den heißen Epon Resin (14%, w / v). Mix durch Schwenken der Flasche. </li><li> Tauchen Sie die Bündel von Elektroden in die heiße Epoxy plus Härter solution.After ca. 20 Sekunden, eine ausreichende Menge an Epoxid wird das Glas Tipps über Kapillarwirkung geben. </li><li> Lösen Sie die Bündel, Ort Elektroden auf Karton mit Schlitzen und Ort dieses Fach in einem Ofen auf 100 ° F. </li><li> Nach mindestens 48 Stunden, überprüfen Sie jede Elektrode unter einem Präpariermikroskop microscope.Discard Elektroden, die nicht mit Epoxy hat zu füllen, haben eine zertrümmerte Spitze, haben mehr als eine Faser, etc.After Inspektion jede Elektrode, legen Sie sie wieder auf dem Karton Inhaber und zurück in den oven.Electrodes sind in der Regel gut für etwa 1 Monat nach der Herstellung. </li></ol> Teil 6: Schneiden Sie die Carbon Fiber <ol><li> Legen Sie Kohlefaser Elektrode vorsichtig auf einen Objektträger mit Teflonband. </li><li> Visualisieren Sie die Spitze unter einem Binokular. </li><li> Verwenden Sie ein sauberes Skalpell senkrecht quer durch die Kohlefaser eine ebene, saubere Oberfläche für die Platzierung der Kohlefaser gegen eine Zelle zu verlassen. </li></ol>

<ol><li>Mundorf, M. L., Wightman, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amperometry+and+cyclic+voltammetry+with+carbon+fiber+microelectrodes+at+single+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protocols+in+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Amperometry and cyclic voltammetry with carbon fiber microelectrodes at single cells.</a> Curr Protocols in Neurosci. 6 (14), 1-6 (2002).</li>
<li>Machado, D. J., Montesinos, M. S., Borges, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Good+practices+in+single-cell+amperometry%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molec.+Biol%22%5BJournal%5D)">Good practices in single-cell amperometry.</a> Methods in Molec. Biol. 440, 297-313 (2008).</li>
</ol>

Dieses Protokoll beschreibt, wie zu generieren und zu schneiden amperometrischen Elektroden. Während amperometrische Aufnahmen, ist eine Kohlefaser-Elektrode gegen die Oberfläche eines sekretorischen Zelle platziert. Exozytotische Aktivität wird als amperometrische Spikes, die die elektrochemische Strom, der durch den Transfer von Elektronen nach der Oxidation der Katecholamine verursacht zeigt beobachtet. Mit etwas Übung machen und Schneiden amperometrischen Elektroden kann Geräuschpegel erheblich über viele der im Han...

<table><tbody><tr><td>Epoxy-Härter 1,3-Phenylendiamin-Flakes</td><td>Reagenz</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P23954-100G04 716AJ</td><td>Aliquote werden in einem Exsikkator aufbewahrt und sollten nicht dem Licht ausgesetzt werden.</td></tr><tr><td>Kohlenstofffasern</td><td>Material</td><td>Goodfellow</td><td>C005725</td><td></td></tr><tr><td>Mikro-Hämatokrit-Kapillarrohre</td><td>Material</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC9836768</td><td></td></tr><tr><td>Epoxyharz</td><td>Reagenz</td><td>Miller-Stephenson</td><td>Epon Resin 828</td><td></td></tr><tr><td>Präparationsmikroskop</td><td>Instrument</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Elektrodenzieher</td><td>Instrument</td><td>Narishige International</td><td>PP-830</td><td>1. Zug = 24,8 Grad C; 2. Zug = 62,7 Grad C</td></tr><tr><td>Ofen</td><td>Instrument</td><td></td><td></td><td>auf 100 Grad F eingestellt</td></tr><tr><td>Heizplatte</td><td>Instrument</td><td></td><td></td><td>auf 55 Grad C eingestellt</td></tr></tbody></table>

herstellung von amperometrische elektroden

Fabrication of Amperometric Electrodes

Carbon-Elektroden sind entscheidend für den Nachweis von Katecholamin Entlassung aus dem Vesikel in einzelnen Zellen für Amperometrie Messungen. Hier beschreiben wir die Techniken erforderlich, um geräuscharm (&lt;0,5 pA) Elektroden zu erzeugen. Die Techniken wurden aus veröffentlichten Beschreibungen wurden von früheren Forschern (1,2) modifiziert. Die Elektroden sind durch Herstellung von Kohlenstoff-Fasern und Einfädeln sie einzeln in jede Kapillare mit Hilfe eines Vakuums mit einem Filter, um die Faser absaugen gemacht. Anschließend wird die Kapillare mit Faser durch eine Elektrode Abziehers, wodurch zwei Hälften, die jeweils mit einer feinen Spitze. Die Elektroden werden in heißem, flüssigem Epoxidharz mit Härter gemischt, um ein Epoxid-Glas-Siegel erstellen getaucht. Schließlich sind die Elektroden in einen Ofen gelegt, um das Epoxidharz zu heilen. Sorgfältige Behandlung der Elektroden ist entscheidend, um sicherzustellen, dass sie gemacht werden konsequent und ohne Beschädigung. Dieses Protokoll zeigt, wie in der Herstellung und schneiden amperometrischen Elektroden für die Aufzeichnung von einzelnen Zellen.

Dieses Protokoll beschreibt, wie Kohlefaser Elektroden zu erzeugen. Die Elektroden werden anschließend verwendet, um Katecholaminausschüttung von Vesikeln mit Kohlefaser Amperometrie erkennen.

Herstellung von amperometrische Elektroden

Kohlenstofffaserelektroden sind entscheidend für den Nachweis der Freisetzung von Katecholaminen aus Vesikeln in Einzelzellen für amperometrische Messungen. Hier ...

Dieses Protokoll beschreibt, wie man Kohlenstofffaserelektroden herstellt. Zunächst füllen wir die Glas-Kapillaren mit Kohlenstofffasern, bei denen die Sizing-Beschichtung entfernt wurde. Anschließend ziehen wir die Faser-Kapillar-Anordnung zu zwei Elektroden und schneiden die Faser ab.Dann bringen wir die Elektroden so an, dass sie in Epoxidharz eintauchen. Um die Faser in der Elektrode abzudichten, lagern wir die Faserelektroden auf einem Gestell in einem heißen Ofen. Diese Elektroden werden anschließend verwendet, um die Freisetzung von Katecholaminen aus Vesikeln in einzelnen Zellen mittels Kohlenstofffaser und Barometrie nachzuweisen.Erfolgreiche Aufnahmen zeigen ein geringes Rauschen und deutlich erkennbare nach oben gerichtete Spikes in der Aufnahmespur. Hallo, ich bin Carrie Pike aus dem Labor von Dr. Amy Harkins am Department für Pharmakologische und Physiologische Wissenschaften an der St. Louis University School of Medicine. Ich werde Ihnen ein Verfahren zur Herstellung von kohlenstofffasergestützten Elektroden mit geringem Rauschen vorstellen, die in der Pyrometrie zur Messung der Katecholaminfreisetzung aus einzelnen Zellen verwendet werden.Beginnen wir mit der Vorbereitung der Kohlenstofffasern zur Herstellung von Elektroden. Schneiden Sie zunächst ein Bündel Kohlenstofffasern in einer Länge zu, die etwa das 1,25-Fache der Länge der Kapillarpipette im Abzug beträgt. Entfernen Sie die Sizing-Beschichtung, indem Sie etwa 100 Milliliter Aceton in einem Behälter zum Kochen bringen und die Fasern für 30 Minuten oder länger in das heiße, kochende Aceton geben.Nach dem Kochen die Fasern aus dem erhitzten Aceton entfernen und in einen sauberen Becher mit 50 bis hundert Milliliter frischem Aceton überführen. Die Fasern anschließend erneut auf Aluminiumfolie übertragen, die aus dem Abzug herausbewegt werden kann. Die Fasern trocknen, indem man das Bündel auf eine offene 150 Millimeter große Petrischale legt und die Kohlenstofffasern über Nacht an der Luft trocknen lässt.Nachdem die Kohlenstoffasern vorbereitet sind, fahren Sie mit der Vorbereitung der Glas-Kapillarrohre fort, um diese zu feinpolieren. Verwenden Sie mikrohämatorische Glas-Kapillarrohre, die 7,5 Zentimeter lang sind und einen Außendurchmesser von 1,5 Millimetern sowie einen Innendurchmesser von 1,3 Millimetern aufweisen. Halten Sie das Rohr in der Mitte fest und führen Sie ein Ende in die Flamme ein.Drehen Sie das Röhrchen etwa dreimal, während es sich in der Flamme befindet. Drehen Sie das Röhrchen um und führen Sie das gegenüberliegende Ende in die Flamme ein, dann drehen Sie es erneut dreimal. Beide Enden des Kapillarröhrchens sind nun feinpoliert.Stellen Sie die feuerpolierten Röhrchen in eine Glaswanne und bringen Sie sie dorthin, bis sie bereit sind, mit Kohlenstofffasern befüllt zu werden. Bevor Sie damit beginnen, eine Kohlenstofffaser in ein Kapillarröhrchen einzufädeln, vergewissern Sie sich, dass Sie eine Schutzmaske tragen. Verwenden Sie dann einen Kunststoffschlauch, der mit einem Vakuumanschluss und einem Filter verbunden ist, um die Faser in das Glasröhrchen zu saugen.Schneiden Sie als Nächstes die Faser mit einem Skalpell durch. Achten Sie darauf, an beiden Enden der Röhre jeweils ein Viertel Zoll Faser herausstehen zu lassen. Die mit Kohlenstofffaser bestückte Röhre ist nun bereit, um die Pipetten-Faserelektrode zu ziehen.Platzieren Sie das Kapillarrohr in der Elektrodenspitze und ziehen Sie die Knäufe fest, um das Kapillarrohr zu fixieren. Stellen Sie danach die Spitze auf die optimalen Einstellungen ein und betätigen Sie die Schalter, um zwei Pole zu erzeugen. Sobald die Pipette in zwei Hälften gezogen ist, trennen Sie die beiden Hälften, indem Sie die bloße Faser in der Mitte durchschneiden.Mit einer Schere. Entfernen Sie jede Elektrodenhälfte und ziehen Sie an der hervorstehenden Faser, um die Glasdichtung zu durchtrennen. Schneiden Sie die Faser mit einer Schere so zurecht, dass nur noch ein Achtel Zoll der Faser außerhalb des Rohrs verbleibt.Wiederholen Sie diese Schritte, bis etwa 16 Faserelektroden vorliegen. Ziehen Sie zunächst die Faserelektroden, bevor Sie fortfahren, um die Elektroden zu versiegeln und die Epoxiglaskappe herzustellen. Erwärmen Sie dazu eine vorbereitete Portion Epoxidharz sechs Minuten lang auf einer Heizplatte, die auf 55 Grad Celsius eingestellt ist, in einem Abzug. Während das Epoxidharz erwärmt wird, wickeln Sie etwa 16 der gezogenen Elektroden zu einem Bündel zusammen.Verwenden Sie nach dem Erhitzen des Epoxys für sechs Minuten 0,7 Gramm Härter auf den heißen Epoxidharz. Mischen Sie dies durch Schwenken des Gefäßes. Tauchen Sie das Bündel der Elektroden in die heiße Epoxidharz-Härter-Lösung ein.Tauchen Sie das Bündel jedes Mal zweimal für etwa fünf Sekunden ein, damit eine ausreichende Menge Epoxidharz durch Kapillarwirkung in die Glas spitzen eindringt. Lösen Sie das Bündel auf und legen Sie die Elektroden in einen Papphalter mit Schlitzen. Stellen Sie dieses Tablett in einen Ofen, der auf 100 Grad Fahrenheit eingestellt ist.Nach mindestens 48 Stunden jedes Elektroden unter einem Stereomikroskop untersuchen. Elektroden, die sich nicht mit Epoxidharz gefüllt haben, entsorgen. Sollte eine zerquetschte Spitze aufweisen.Enthalten mehr als eine Faser oder können aus anderen Gründen nicht verwendet werden. Nach der Prüfung jedes Elektrodenkopfes legen Sie diese zurück auf den Papphalter und erneut in den Ofen. Elektroden sind normalerweise etwa einen Monat lang nach der Herstellung verwendbar und müssen vor der Anwendung in der Pyrometrie an einer Zelle an der Kohlenstofffaser gekürzt werden.Um die Kohlenstofffaser zu schneiden, platzieren Sie die Kohlenstofffaserelektrode vorsichtig auf einem Objektträger mit Teflonband. Betrachten Sie die Spitze unter einem Stereomikroskop. Schneiden Sie anschließend mit einer sauberen Skalpellklinge senkrecht über die Kohlenstofffaser, um eine ebene, saubere Oberfläche zu erhalten, die später an die Zelle angelegt wird.Kurz vor den Aufnahmen. Füllen Sie die Kapillare mit dreimolarem Kaliumchlorid unter Verwendung einer Füllspritze auf und trocknen Sie das dem Faserende gegenüberliegende Ende, um überschüssiges Salz zu entfernen.Platzieren Sie die Elektrode auf dem Silber-Silberchlorid-Pellet des Elektrodenhalters. Elektrisch mit der Pyrometrie-Probennahmestufe verbunden. Ziehen Sie den Elektrodenhalter fest, um die Elektrode stabil zu halten.Platzieren Sie die Elektrode neben der Zelle und nehmen Sie anschließend RO-Metrik-Ereignisse auf. Dieses Protokoll beschreibt, wie Tric-Elektroden hergestellt und geschnitten werden. Bei Tric-Aufnahmen wird eine Kohlenstofffaser-Elektrode an die Oberfläche einer sekretorischen Zelle angelegt.Exozytotische Aktivität wird als trike Spikes beobachtet, die den elektrochemischen Strom anzeigen, der durch den Elektronentransfer nach der Oxidation der Katecholamine verursacht wird. Durch Übung beim Herstellen und Schneiden von EmPro-Metrikelektroden können die Rauschpegel im Vergleich zu vielen kommerziell verfügbaren Elektroden erheblich verbessert werden. Ich habe Ihnen gerade gezeigt, wie man bei Durchführung dieses Verfahrens parametrische Kohlenstofffaserelektroden herstellt.Es ist wichtig, auf die Details des Protokolls zu achten, um konsistente Elektroden mit geringem Rauschen zu erhalten. Das war's. Vielen Dank fürs Zuschauen und viel Erfolg bei Ihren Experimenten.

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Forschung

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