SEM-Bildgebung biologischer Proben

Die Rasterelektronenmikroskopie (REM) wird häufig verwendet, um biologische Materialien auf der Nanoskala abzubilden. Optische Mikroskope, die Licht zur Abbildung einer Probe verwenden, werden häufig verwendet, um biologische Proben zerstörungsfrei abzubilden, jedoch ist ihre Auflösung und Schärfentiefe begrenzt, daher wird REM verwendet, um eine höhere Auflösung bis zu einem Nanometer zu erreichen.

Beim REM wird ein Elektronenstrahl durch eine Reihe von Kondensorlinsen fokussiert, der dann auf die Probe trifft. Wenn der Strahl auf die Probe trifft, werden die Elektronen auf der Oberfläche gestreut und vom Detektor gemessen.

In diesem Video besprechen wir, wie REM funktioniert, zeigen, wie man eine biologische Probe im Labor abbildet, und stellen schließlich einige Techniken vor, die zur Abbildung empfindlicher Proben verwendet werden.

Ein Rasterelektronenmikroskop verwendet einen hochenergetischen Elektronenstrahl, der von einer Elektronenkanone erzeugt wird, die mit einer Filamentkathode ausgestattet ist. Die erzeugten Elektronen werden zur Anode geschleudert und dann mit Hilfe von Kondensorlinsen fokussiert, bevor sie in die Objektivlinse eintreten. Die Objektivlinse ist so kalibriert, dass der Strahl auf die Probe fokussiert wird, wo sie über die Oberfläche gerastert wird. Die Wechselwirkungen der Elektronen mit den Atomen in der Probe werden verwendet, um die Topographie, die elementare Zusammensetzung und die Kristallinität der Probe zu untersuchen. Wenn der einfallende Elektronenstrahl auf die Oberfläche trifft, emittiert er sekundäre und rückgestreute Elektronen. Sekundärelektronen sind niederenergetische Elektronen, die von der Probe nahe der Oberfläche emittiert werden und topographische Informationen liefern.

Rückgestreute Elektronen hingegen werden in die entgegengesetzte Richtung des einfallenden Strahls reflektiert. Die Wechselwirkungsintensität nimmt mit zunehmendem Atomgewicht zu, so dass der Benutzer Unterschiede in der Zusammensetzung unterscheiden kann. Besondere Berücksichtigung ist bei der Abbildung biologischer Proben mit REM erforderlich, da im REM ein Hochvakuum betrieben wird, so dass biologische Proben, die typischerweise einen hohen Wassergehalt aufweisen, zuerst getrocknet werden müssen. Dies kann zum Zusammenbruch der Struktur empfindlicher Proben, insbesondere von Zellen, führen. So werden die Zellen mit einem Fixiermittel behandelt, gespült und dann durch Waschen mit zunehmenden Mengen Ethanol langsam dehydriert.

Bei starren biologischen Materialien, wie dem in dieser Demonstration verwendeten Kollagen-Hydroxylapatit-Gewebegerüst, wird die Probe über einen Zeitraum von mehreren Tagen unter Hochvakuum getrocknet.

Da die typische REM-Bildgebung eine leitfähige Oberfläche erfordert, werden biologische Proben vor der Bildgebung oft mit einer dünnen Metallschicht überzogen. Nachdem wir nun besprochen haben, wie REM funktioniert und wie man eine biologische Probe für die Bildgebung vorbereitet, werfen wir einen Blick darauf, wie man ein Kollagen-Hydroxylapatit-Gewebegerüst vorbereitet und abbildet.

Montieren Sie zunächst die Biomaterialprobe mit leitfähigem Kohleband auf einen REM-Stummel und stellen Sie sicher, dass die Probe trocken ist und keine Verunreinigungen auf der Oberfläche aufweist.

Legen Sie dann die eingespannte Probe in die Kammer eines Sputtercoaters, pumpen Sie die Kammer herunter und sputtern Sie die Probe etwa 40 Sekunden lang, um eine dünne, vier bis sechs Nanometer dicke Metallschicht, in diesem Fall Gold, mit ausreichender Abdeckung zu erhalten. Entfernen Sie nach dem Überziehen die Probe und verwenden Sie leitfähiges Klebeband, um den Stummel mit der Oberseite der Probe zu verbinden, die nun mit leitfähigem Metall beschichtet ist.

Montieren Sie abschließend den Stummel auf dem REM-Tisch und ziehen Sie die Schraube an der Seite fest. Jetzt ist die Probe bereit für die Abbildung mit dem REM. Laden Sie zuerst den Tisch in die REM-Kammer und verschließen Sie die Tür, dann drücken Sie den Transferknopf, um den Durchgang von der Ladekammer zum Vakuum zu öffnen. Sobald die Innentür geöffnet ist, schrauben Sie den Metallstab in den Tisch und schieben Sie die Probe in die Vakuumkammer, schrauben Sie dann den Metallstab ab und ziehen Sie ihn vollständig in die Lastkammer ein, dann drücken Sie auf Speichern, um die Vakuumkammer zu schließen.

Lassen Sie uns nun die Probe mit REM abbilden.

Zuerst bewegen Sie den Tisch mit dem Controller und navigieren Sie die Probe in das Sichtfeld, dann bewegen Sie die Probe vertikal, bis der Arbeitsabstand fünf bis 10 Millimeter beträgt. Schalten Sie den Elektronenstrahl ein und wählen Sie den Detektor für Sekundärelektronen aus, stellen Sie den Strahl zunächst auf fünf Kiloelektronenvolt ein und erhöhen Sie ihn dann je nach Bedarf auf 20 bis 30 Kiloelektronenvolt. Wenn das Bild nicht klar ist, drehen Sie die Fokus-, Helligkeits- und Kontrastregler, bis ein klares Bild angezeigt wird.

Verwenden Sie die Tischnavigation und die X- und Y-Richtungen, um einen neuen Punkt auf der Probe zu lokalisieren, und erhöhen Sie dann die Vergrößerung, bis die gewünschten Merkmale sichtbar sind. Passen Sie Fokus, Kontrast und Helligkeit nach Bedarf an, um die Bildqualität zu verbessern. Möglicherweise müssen Sie die Scangeschwindigkeit verringern und die Zeilenmittelung aktivieren, um ein besseres Bild zu erhalten, und dann das Bild speichern.

Die REM-Aufnahmen zeigen eine stark dreidimensionale und poröse Struktur mit faserigen Merkmalen von weniger als 25 Mikrometern. Diese Merkmale wären mit der optischen Mikroskopie nur schwer sichtbar zu machen, da die optische Mikroskopie eine viel geringere Schärfentiefe aufweist.

Die Abbildung biologischer Strukturen mit REM ist mit vielen Herausforderungen verbunden, darunter der Strukturkollaps oder die Beschädigung durch den hochenergetischen Elektronenstrahl. Werfen wir nun einen Blick darauf, wie die allgemeine REM-Technik auf diese Art von empfindlichen Proben angewendet wird. Empfindliche biologische Strukturen, wie z. B. diese jungen Pflanzengewebe oder solche mit hohem Wassergehalt, müssen vor der Bildgebung durch einen Fixierungsprozess behandelt werden.

Diese Blütenmeristeme wurden sofort mit einer frisch zubereiteten Formalin/Essigsäure-Fixierlösung behandelt. Das fixierte Gewebe wurde in Ethanol präpariert, in einen Netzbehälter gegeben und durch eine Ethanolreihe von 70 %, 80 %, 90 % und 100 % Ethanol dehydriert. Schließlich wurden die Pflanzengewebe mit einem Trockner an kritischen Punkten getrocknet, montiert und mit einer dünnen Metallbeschichtung überzogen.

Nach der REM-Bildgebung ist klar, dass die unbehandelten Strukturen durch den Trocknungsprozess stark beschädigt wurden und einen erheblichen Strukturkollaps zeigten, während diejenigen, die fixiert wurden, ihre ursprüngliche Struktur behielten. Alternativ können Zellen und andere Proben mit hohem Wassergehalt mit Hilfe von Umwelt-REM (ESEM) abgebildet werden. ESEM verwendet einen hochenergetischen Elektronenstrahl, der wie beim herkömmlichen REM über die Probe gerastert wird, ermöglicht jedoch die Abbildung von nassen oder unbeschichteten Proben, indem eine gasförmige Umgebung in der Kammer aufrechterhalten wird.

Dies geschieht, indem die Hochvakuumkammer, in der sich die Elektronenkanone befindet, mit Hilfe von zwei Öffnungen von der Probenkammer getrennt wird. Der Elektronenstrahl erleidet zwar erhebliche Verluste durch Streuung durch Gasmoleküle, hat aber in der Regel eine Energie, die für die Bildgebung hoch genug ist. Hier wurden Zellen auf einem Siliziumchip gezüchtet, mit Quantenpunkten funktionalisiert und mit einem Glutaraldehyd-Fixierungsprotokoll fixiert. Die Zellen wurden in Wasser abgebildet und zeigen die nicht kollabierte Struktur der Zelle mit einzelnen Quantenpunkten, die auf der Zelloberfläche sichtbar sind.

Sie haben gerade die Einführung von JoVE in die Visualisierung von Biomaterialien mit REM gesehen. Sie sollten nun verstehen, wie REM funktioniert, wie biologische Proben vorbereitet und abgebildet werden, sowie einige Anwendungen der Technik für empfindliche Strukturen.

Danke fürs Zuschauen!