5.4: ELISPOT-Assay: Nachweis von IFN-γ-sezernierenden Splenozyten

1. Einrichtung

Puffer und Reagenzien

1. Sterile Phosphat-gepufferte Saline (PBS) ohne Calcium oder Magnesium
2. Beschichtungspuffer - entweder steriles PBS oder Karbonatpuffer
3. Assay Verdünner - 10% fetales Rinderserum (FBS) in PBS
4. Zellkultur mittel- RPMI 1640 mit 10% FBS, Penicillin/Streptomycin, & L-Glutamin
5. Waschpuffer- PBS mit 0,05% Tween20
6. Doppelt destilliertes Wasser (ddH₂O)
7. Nachweis substrat- 100 mg AEC (3-Amino-9-ethyl-carbazol) in 10 ml DMF (N,N, Dimethylformamid).

ausrüstung

8. Laminare Durchflusshaube
9. Befeuchtter Inkubator (eingestellt auf 37°C, 5% CO₂)
10. Automatisiertes ELISPOT-Lesegerät oder Sezieren von Mikroskop

Materialien

11. ELISPOT-Platten
12. Sterile und nichtsterile Reservoirs
13. Pipettierer und Spitzen
14. Sterile serologische Pipetten
15. Sterile, konische Polypropylenrohre
16. Zwei Squeeze-Flaschen zum Plattenwaschen

Assay Spezifische Reagenzien

17. Zellen - Primärzellen oder Zelllinien (hier wurden Splenozyten von C57BL/6-Mäusen verwendet)
18. Stimulanzien- Mitogen oder Antigen (hier wurden phorbol 12-Myristate 13-Acetat (PMA, 50 ng/ml) und Ionomycin (1 m) verwendet)
19. Primärer Antikörper- biotinylatierter Antizytokin-Detektionsantikörper (verdünnt auf 2 g/ml in Assay-Verdünnungsmittel)
20. Sekundäre Antikörper- Streptavidin-Meerrettichperoxidase (SAv-HRP)

2. Verfahren

überzug

1. Um die Bedingungen steril und in einer laminaren Durchflusshaube zu halten, verdünnen Sie den gereinigten Antizytokin-Capture-Antikörper auf eine Endkonzentration von 0,5-4,0 g/ml im sterilen Beschichtungspuffer. (Hinweis: für IFN- - und IL-6 verwenden Sie 5 g/ml).
2. Übertragen Sie die Capture-Antikörperlösung, 100 l/well, auf die ELISPOT-Platte.
3. Bedecken Sie die Platte mit einer Plattenabdeckung und versiegeln Sie sie, um Verdunstung zu verhindern.
4. Inkubieren Sie die Platte über Nacht bei 4°C.

Blockieren

5. Am nächsten Tag entdecken Sie die ELISPOT-Platte in der laminaren Strömungshaube. Um die Platte schnell auf sterile Tücher umzukehren, um die Capture-Antikörperlösung aus jedem Brunnen zu entfernen.
6. Fügen Sie dann jedem Brunnen 200 L Zellkulturmedium hinzu. Dieser Schritt blockiert die unspezifische Bindung während des Testes.
7. Ersetzen Sie die Plattenabdeckung und inkubieren Sie die Platte für 2 Stunden bei 37°C.

Beschichtungs- und Aktivierungszellen

8. Während der Inkubation der Platte, bereiten Sie eine 2X Mitogen-Lösung mit 50 ng/ml PMA und 1 M Ionomycin in Zellkultur Medium.
9. Bereiten Sie dann Zielzellsuspensionen auf eine Lagerkonzentration von 2 x 10⁶ Zellen/ml vor.
10. Nachdem die Inkubation abgeschlossen ist, entfernen Sie das Zellkulturmedium aus jedem Brunnen, indem Sie die Platte schnell auf sterile Tücher in der laminaren Strömungshaube umkehren.
11. Als Nächstes generieren Sie eine 2x serielle Verdünnung der Stammzellsuspensionslösung. Dazu fügen Sie zunächst 200 l der vorbereiteten zellulären Suspensionsstocklösung in die Brunnen in der oberen Reihe der ELISPOT-Platte ein.
12. Fügen Sie dann 100 L des mediums einfache Zellkultur zu den nächsten fünf Reihen der Platte unter den Reihen hinzu, die eine zelluläre Stammlösung enthalten.
13. Führen Sie danach eine 2-fache serielle Verdünnung durch, indem Sie 100 l der Zellsuspension aus der oberen Reihe in die Reihe direkt darunter pipetieren. Sorgen Sie für eine ordnungsgemäße Durchmischung, indem Sie diese Lösung vorsichtig nach oben und unten pipetieren, um eine gleichmäßige Verteilung der Zellen zu gewährleisten.
14. Wiederholen Sie diesen Vorgang für die verbleibenden vier Zeilen.
15. Lassen Sie die sechste Reihe nur mit dem Kulturmedium. Es wird als experimentelle Kontrolle dienen.
16. Als nächstes fügen Sie 100 l der vorbereiteten Mitogenlösung in die Versuchsbrunnen der ersten fünf Reihen der Platte ein. In den Kontrollbrunnen und der sechsten Reihe fügen Sie 100 L der Zellkulturmedien ohne Mitogen hinzu.
17. Ersetzen Sie die Plattenabdeckung und inkubieren Platte bei 37°C, 5%_CO2 in einem Inkubator für 20-48 Stunden. (Hinweis: 20-24 Stunden sind in der Regel ausreichend, um IL-2 und TNF- zu erkennen, während 48 Stunden optimal für IL-4 und IFN-A sind).

entdeckung

Primärer Antikörper

18. Bereiten Sie den biotinylierten Antizytokin-Detektionsantikörper auf eine Konzentration von 2 g/ml in Assay-Verdünnungsmittel vor.
19. Bereiten Sie 20-25 ml Waschpuffer zu diesem Zeitpunkt durch Mischen von 0,05% Tween-20 in PBS.
20. Nachdem die Inkubation abgeschlossen ist, entkappen Sie die Platte und kehren Sie sie schnell über eine Spüle um, um alle Flüssigkeit aus den Brunnen zu entfernen. (Hinweis: Nach diesem Punkt muss die Platte nicht mehr steril gehalten werden).
21. Dann waschen Sie die Platte, indem Sie jedem Brunnen einen Waschpuffer von 200 L hinzufügen. Vertreiben Sie diese Flüssigkeit, indem Sie die Platte schnell umkehren und über eine Spüle flicken. Wiederholen Sie diesen Vorgang für insgesamt fünf Wähbe.
22. Als nächstes fügen Sie jedem Brunnen 100 l der verdünnten biotinylierten Antizytokin-Erkennungslösung hinzu. Bei Raumtemperatur 2 Stunden bei Raumtemperatur oder über Nacht bei 4°C inkubieren.

Sekundärer Antikörper

23. Nachdem die Inkubation abgeschlossen ist, vertreiben Sie den Detektionsantikörper, indem Sie die Platte umkehren und über das Waschbecken flicken.
24. Waschen Sie die Platte wie bisher 5 Mal mit einem Waschpuffer von 200 l, wodurch die Flüssigkeit zwischen den einzelnen Waschanlagen ausgegart ist.
25. Als nächstes fügen Sie jedem Brunnen 100 l verdünnte Streu-Meerrettich-Peroxidase-Lösung hinzu (verdünnt auf ihre vorbestimmte optimale Konzentration im Assay-Verdünnungsmittel).
26. Ersetzen Sie die Plattenabdeckung und inkubieren Sie bei Raumtemperatur 1,5-2 Stunden bei 37°C.

Substrat

27. Nach der Inkubation, nicht mehr als 15 Minuten vor Gebrauch, aktivieren Sie zuerst AEC Substratlösung nach Herstelleranweisungen.
28. Als nächstes entsorgen Sie den Inhalt der Brunnen und waschen Sie die Platte fünfmal mit Waschpuffer, wie zuvor.
29. Dann fügen Sie sofort 100 l vorbereitete AEC-Substratlösung in jeden Brunnen ein.
30. Inkubieren Sie die Platte bei Raumtemperatur für 10-20 Minuten, während Sie die Punktentwicklung überwachen.
31. Stoppen Sie die Reaktion, indem Sie die Platte mit Wasser abspülen und die Platte über das Waschbecken streichen.
32. Bloten Sie die Platte auf Papiertücher und lassen Sie die Platte über Nacht trocknen oder bis sie vollständig trocken ist. Das Entfernen der Kunststoffschale unter der Platte erleichtert das Trocknen.

3. Datenerfassung und -analyse

1. Nach dem Trocknen können die Spots mit einem automatisierten Plattenleser gezählt werden. Hier wird der CTL Immunospot Reader verwendet, aber dieses Protokoll kann für jeden Leser angepasst werden.
2. Schalten Sie zuerst das Gerät ein, dann den Computer. Öffnen Sie dann das CTL-Programm und klicken Sie auf "Scananzahl".
3. Drücken Sie "Auswurf" für das Fach, um sich von der Maschine zu erstrecken. Entfernen Sie dann den Kunststoffadapter und richten Sie die Reihe "A" auf der ELISPOT-Platte und dem Adapter aus.
4. Wählen Sie einen Dateinamen und Speicherort für die zu speichernde Datei aus, und laden Sie die Platte auf das Fach.
5. Klicken Sie dann auf "Laden" auf die Software und schließen Sie die Tür auf der Seite der Maschine.
6. Drücken Sie "Start- nach dem Zählen". Stellen Sie sicher, dass die Datei gespeichert ist, und öffnen Sie dann die Software "QC" der Qualitätskontrolle, um die Daten zu analysieren und die Anzahl der Spots zu zählen.

Notizen:

1. Die Mindestanzahl der Zellen sollte in Vorversuchen bestimmt werden. Die optimale Anzahl von Spots ist 50 €/gut. Wenn zu viele Zellen geladen werden, ist es schwierig, einzelne Stellen zu erkennen. Darüber hinaus überlappen sich die Zellen und bilden möglicherweise keine Monoschicht auf der Membran, so dass der Nachweisgrad reduziert werden kann.
2. Berücksichtigen Sie bei der Optimierung des Experiments den erwarteten Expressionsgrad des Zielproteins. Je niedriger der Ausdruck, desto höher ist die Anzahl der Zellen, die pro Bohrkörper benötigt werden.
3. Im Gegensatz zu ELISA ist es besser, die Platte von Hand zu waschen, als eine Plattenwäscherin zu verwenden. ELISPOT Platten sind empfindlicher und man sollte vermeiden, die PVDF-Membran zu punktieren.
4. Man sollte die Bewegung der Platte während der Inkubationszeit begrenzen, da es dazu führen kann, dass die Flecken verschmieren.
5. Platten sollten im Dunkeln gelagert werden, da die Exposition gegenüber direktem Licht dazu führt, dass Flecken verblassen.

Der Enzyme-linked Immunospot (ELISPOT) Assay ist eine Methode zur Analyse der Immunantwort auf einen Krankheitserreger oder eine Zellschädigung. Es ermöglicht die Quantifizierung der Aktivierung verschiedener Immunzellen durch den Nachweis spezifischer Proteine, die sie sezernieren. Zum Beispiel wird ELISPOT häufig zur Messung der T-Zell-Antworten nach Exposition gegenüber einem fremden Antigen verwendet, indem sekretierte Zytokine nachgewiesen werden.

Bei einem zytokinbasierten ELISPOT-Assay beginnt der Prozess mit der Beschichtung einer ELISPOT-Mikroplatte mit einem Capture-Antikörper, der spezifisch für das Zielzytokin ist. Nach der Antikörperbeschichtung werden T-Zellen in die Vertiefungen gegeben und durch ein externes Mittel, wie z. B. einen Anti-CD3-Antikörper, stimuliert. Die Zellen sezernieren dann das Zielzytokin, das sofort durch den Einfangantikörper immobilisiert wird. Da das Protein unmittelbar nach der Sekretion aus lebenden Zellen eingefangen wird, ohne Verdünnung oder Abbau, hat dieser Assay eine hohe Genauigkeit. Nachdem das Zielzytokin immobilisiert wurde, wird ein Nachweisantikörper hinzugefügt, der ebenfalls an das eingefangene Zytokin bindet.

Die ELISPOT-Technik kann auch verwendet werden, um Gedächtnis-B-Zellen nach einer Infektion oder Impfung zu quantifizieren, indem ihre Produktion spezifischer Antikörper analysiert wird. Bei einem Antikörper-basierten ELISPOT wird ein spezifisches Antigen anstelle eines Antikörpers entweder für den Einfangschritt, bei dem das Antigen an die Platte gebunden wird, oder für den Nachweisschritt, bei dem das Antigen den Zielantikörper nach der Aufnahme nachweist, verwendet. In allen Variationen des Verfahrens ist bei T-Zellen oder B-Zellen der Nachweisantikörper oder das Antigen biotinyliert, was es ihm ermöglicht, an ein Streptavidin-konjugiertes Nachweisenzym, wie z. B. Meerrettichperoxidase, zu binden. Dann entsteht bei Zugabe des Substrats der Peroxidase, AEC, ein dunkler, unlöslicher Niederschlag. Dieser Niederschlag markiert die Position des eingefangenen Proteins, und jede sekretorische Zelle führt zu einem sichtbaren Fleck, der mit einem ELISPOT-Lesegerät oder einem Mikroskop quantifiziert werden kann. Die Größe der Flecken ist eine relative Schätzung der Menge an Protein, die von jeder Zelle abgesondert wird. Dieser Assay kann Immunantworten von einzelnen Zellen nachweisen, selbst in relativ kleinen Subpopulationen sekretorischer Zellen, was ihn für die Untersuchung von Immunantworten auf zellulärer Ebene nützlich macht.

In diesem Video erfahren Sie, wie Sie einen ELISPOT-Assay durchführen und dann die Flecken quantifizieren, die die sekretorischen Zellen repräsentieren.

Stellen Sie während des gesamten Experiments sterile Bedingungen sicher, indem Sie in einer Laminar-Flow-Haube arbeiten und Handschuhe tragen.

Alle Berechnungen in diesem Protokoll basieren auf dem Volumen, das für eine 96-Well-Platte benötigt wird.

Verdünnen Sie zunächst den Anti-Zytokin-Capture-Antikörper. Füllen Sie dazu 10 Milliliter Puffer in ein steriles konisches 15-Milliliter-Röhrchen um. Geben Sie dann mit einer Pipette 10 Mikroliter eines Milligramms pro Milliliter monoklonalen Antikörpers in den Puffer, um eine Lösung mit einer Endkonzentration von einem Mikrogramm pro Milliliter herzustellen. Gießen Sie anschließend die Capture-Antikörperlösung in ein steriles Reservoir und verteilen Sie mit einer Mehrkanalpipette 100 Mikroliter in jede Vertiefung einer 96-Well-ELISPOT-Platte.

Decken Sie die Platte mit einer Plattenabdeckung ab, versiegeln Sie sie, um eine Verdunstung zu verhindern, und inkubieren Sie sie über Nacht bei vier Grad Celsius. Legen Sie am nächsten Tag die ELISPOT-Platte in der Laminar-Flow-Haube frei. Drehen Sie die Platte schnell auf sterile Tücher um, um die Auffangantikörperlösung aus jeder Vertiefung zu entfernen. Verwenden Sie anschließend eine Mehrkanalpipette, um 200 Mikroliter Zellkulturmedium in jede Vertiefung zu geben. Dieser Schritt blockiert die unspezifische Bindung während des Assays. Setzen Sie die Plattenabdeckung wieder auf und inkubieren Sie sie zwei Stunden lang in einem 37 Grad Celsius heißen Inkubator.

Während die Platte inkubiert wird, bereiten Sie eine 2-fache Mitogenlösung vor, indem Sie einen Mikroliter PMA und 20 Mikroliter Ionomycin zu 10 Millilitern Zellkulturmedium hinzufügen, um eine Endkonzentration von 15 Nanogramm pro Milliliter PMA und einem mikromolaren Ionomycin zu erreichen.

Zelluläre Suspensionen von Maus-Splenozyten sollten zu diesem Zeitpunkt ebenfalls in einer sterilen Haube hergestellt werden. Messen Sie mit einem Mikroskop und einem Hämozytometer die Konzentration der Zellen und stellen Sie das Gesamtvolumen ein, bis eine Stammkonzentration von zwei Millionen Zellen pro Milliliter erreicht ist.

Nachdem die Inkubation abgeschlossen ist, drehen Sie die Platte schnell auf sterile Tücher um, um das Zellkulturmedium aus jeder Vertiefung zu entfernen. Geben Sie anschließend 200 Mikroliter der vorbereiteten zellulären Suspensionsstofflösung in die Vertiefungen in der oberen Reihe der ELISPOT-Platte. Richten Sie das Experiment in dreifacher Ausfertigung ein, sodass jeder getestete Zelltyp in einem Satz von drei gruppierten Spalten plattiert wird. Darunter geben Sie 100 Mikroliter reines Zellkulturmedium in die nächsten fünf Reihen der Platte, unterhalb der Reihen mit der zellulären Stammlösung.

Führen Sie als Nächstes eine serielle Verdünnung durch, indem Sie 100 Mikroliter der Zellsuspension aus der oberen Reihe in die direkt darunter liegende Reihe pipettieren und die Lösung vorsichtig auf und ab pipettieren, um die Zellen gleichmäßig zu verteilen. Wiederholen Sie diesen Vorgang für die verbleibenden Reihen, indem Sie bei jedem Schritt 100 Mikroliter von der vorherigen Reihe in die untere Reihe bewegen und fortfahren, bis die fünfte Reihe seriell verdünnt wurde. Lassen Sie die sechste Reihe nur mit Zellkulturmedium belassen, um als Kontrolle zu dienen. Um die Zellen in den experimentellen Vertiefungen der Platte zu stimulieren, fügen Sie 100 Mikroliter der vorbereiteten Mitogenlösung zu den zellulären Suspensionen in jeder Vertiefung der Reihen eins bis fünf hinzu. Achten Sie darauf, die sechste Reihe, die als Steuerung dient, unstimuliert zu lassen. Setzen Sie den Deckel wieder auf und inkubieren Sie die Platte bei 37 Grad Celsius und 5 % CO2 für 24 bis 48 Stunden.

Bereiten Sie den verdünnten biotinylierten Anti-Zytokin-Nachweisantikörper vor. Bereiten Sie zunächst 50 Milliliter Assay-Verdünnungsmittel vor, indem Sie 5 Milliliter 10 % fötales Rinderserum zu 45 Millilitern PBS hinzufügen. Als nächstes verdünnen Sie den Nachweisantikörper auf eine Konzentration von 2 Mikrogramm pro Milliliter in Assay-Verdünnungsmittel. Bereiten Sie zu diesem Zeitpunkt auch 20 bis 25 Milliliter Waschpuffer vor, indem Sie 0,05 % Tween-20 und PBS mischen.

Nachdem die Inkubation abgeschlossen ist, öffnen Sie die Kappe der Platte und drehen Sie sie schnell um, um die gesamte Flüssigkeit aus den Vertiefungen zu entfernen. Waschen Sie die Platte, indem Sie etwa 200 Mikroliter Waschpuffer in jede Vertiefung geben. Stoßen Sie diese Flüssigkeit aus, indem Sie die Platte schnell umdrehen und über ein Waschbecken schnippen. Wiederholen Sie diesen Vorgang noch viermal für insgesamt fünf Wäschen. Geben Sie anschließend 100 Mikroliter der verdünnten Nachweisantikörperlösung in jede Vertiefung, setzen Sie den Deckel wieder auf und inkubieren Sie zwei Stunden lang bei Raumtemperatur. Nach der Inkubation stoßen Sie die Nachweisantikörperlösung aus den Vertiefungen der Platte aus, indem Sie die Platte umdrehen und über das Waschbecken schnippen.

Waschen Sie die Platte wie zuvor fünfmal mit Waschpuffer und stoßen Sie die Flüssigkeit zwischen jedem Waschgang aus. Bereiten Sie nach der letzten Wäsche die Streptavidin-Meerrettich-Peroxidase-Lösung vor, indem Sie sie gemäß den Anweisungen des Herstellers verdünnen. Geben Sie dann, wenn die Vertiefungen der Platte leer sind, 100 Mikroliter verdünnte Streptavidin-Meerrettich-Peroxidase-Lösung in jede Vertiefung. Den Deckel wieder auf die Platte legen und zwei Stunden bei Raumtemperatur inkubieren.

Nach der Inkubation, nicht länger als 15 Minuten vor der Verwendung, aktivieren Sie die vorgefertigte AEC-Substratlösung. Entsorgen Sie den Inhalt der Vertiefungen und waschen Sie die Platte wie zuvor fünfmal mit Waschpuffer. Geben Sie dann sofort 100 Mikroliter der vorbereiteten AEC-Substratlösung in jede Vertiefung. Lassen Sie die Platte etwa 10 bis 20 Minuten lang bei Raumtemperatur entwickeln, während Sie die Fleckenentwicklung überwachen. Diese Flecken erscheinen als kleine, abgedunkelte Kreise auf der Oberfläche der Vertiefungen. Stoppen Sie dann die Reaktion, indem Sie die Platte mit Wasser abspülen und über das Waschbecken schnippen. Tupfen Sie den Teller auf Küchenpapier ab und lassen Sie ihn über Nacht oder bis zum vollständigen Trocknen an der Luft trocknen. Das Entfernen der Kunststoffschale unter der Platte erleichtert das Trocknen. Nach dem Trocknen sind die Flecken bereit, um mit einem automatischen Plattenleser gezählt zu werden.

Hier kommt der CTL ImmunoSpot Reader zum Einsatz, aber dieses Protokoll kann für jeden Reader angepasst werden. Öffnen Sie dann das CTL-Programm und klicken Sie auf Scan Count. Drücken Sie den Auswurf, damit das Fach aus der Maschine herausragt. Entfernen Sie dann den Kunststoffadapter und richten Sie Reihe A auf der ELISPOT-Platte und dem Adapter aus. Wählen Sie einen Dateinamen und einen Speicherort für die zu speichernde Datei und legen Sie die Platte und den Adapter in das Fach ein. Klicken Sie in der Software auf Laden und schließen Sie die Klappe an der Seite der Maschine. Drücken Sie dann Nach dem Zählen starten. Stellen Sie sicher, dass die Datei gespeichert ist, und öffnen Sie dann die Quality Control QC-Software, um die Daten zu analysieren und die Anzahl der Spots zu zählen. Exportieren Sie diese Daten als Excel-Datei. Wenn die Analyse abgeschlossen ist, klicken Sie auf Auswerfen, um die Platte abzurufen.

In diesem Experiment wurden Zellen von Wildtyp- und tumortragenden Mäusen plattiert und auf IFN-gamma analysiert. Beachten Sie, dass die Anzahl der Flecken mit abnehmender Zellkonzentration abnimmt. In der Regel werden ELISPOT-Daten als Anzahl der Spots pro Anzahl der plattierten Zellen dargestellt. In diesem Beispiel wurde die Anzahl der Spots in einem Balkendiagramm angezeigt, wobei die jeweilige zelluläre Konzentration auf der x-Achse aufgeführt war. Beachten Sie, dass die Anzahl der Spots die Anzahl der aktivierten Zellen pro Gesamtzahl von Zellen in einer bestimmten Population angibt.