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Advanced Biology

ELISPOT-Assay: Nachweis von IFN-γ-sezernierenden Splenozyten

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Immunology

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ELISPOT Assay: Detection of IFN-γ Secreting Splenocytes

5.3: ELISA Assays: Indirect, Sandwich, and Competitive

5.5: Immunohistochemistry and Immunocytochemistry: Tissue Imaging via Light Microscopy

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11:53 min

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April 30, 2023

Overview

Quelle: Tonya J. Webb¹
¹ Department of Microbiology and Immunology, University of Maryland School of Medicine and the Marlene and Stewart Greenebaum Comprehensive Cancer Center, Baltimore, Maryland 21201

ELISPOT ist ein standardisierter, reproduzierbarer Assay, der verwendet wird, um zelluläre Immunantworten zu erkennen. Der Test nutzt eine enzymgebundene Immunosorbent Assay (ELISA)-basierte Methode, um einzellige Immunreaktionen zu erkennen, die durch Flecken visualisiert werden können, daher der Name ELISPOT. ELISPOT wurde erstmals 1983 von Czerkinsky als Methode zur Aufzählung der Anzahl von B-Zell-Hybridomen beschrieben, die antigenspezifische Immunglobuline produzieren (1). Dieselbe Gruppe entwickelte den Assay weiter, um die Häufigkeit von Zytokin produzierenden T-Lymphozyten zu messen. Jetzt ist ELISPOT zu einem Goldstandard für die Messung der antigenspezifischen T-Zell-Immunität in klinischen Studien und Impfstoffkandidaten geworden. Zum Beispiel sezernieren Plasmazellen und Speicher-B-Zellen nach der Impfung oder während einer Infektion Antikörper, die Schutz bieten. Typischerweise werden diese B-Zell-Antworten durch Messung von Serumtitern antigenspezifischer Antikörper bewertet. Diese Art der Analyse, die in der Regel mit ELISA gemessen wird, kann jedoch keine Speicher-B-Zellen enthalten, die auch ohne nachweisbare Serumantikörpervorhanden sein können. Darüber hinaus ist es erwiesen, dass zirkulierende Gedächtnis-B-Zellen für die schnelle und schützende Antikörperreaktion wichtig sind, die nach der erneuten Exposition von Erregern beobachtet wird, daher ist es wichtig, diese Zellen erkennen zu können. Daher sollten zur eindeutigen Beurteilung antigenspezifischer Speicher-B-Zell-Antworten sowohl ELISA als auch ELISPOT verwendet werden (2).

ELISPOT Assay verwendet eine Platte mit membrangefütterten Brunnen, die mit Antikörpern beschichtet sind, um sezernierte Proteine von Interesse zu erfassen. Dann wird die Platte mit Zellen und Reizen beladen, um die Proteinproduktion zu induzieren. Die sezernierten Proteine werden von den an der Oberfläche beschichteten Antikörpern erfasst. Nach entsprechender Inkubationszeit werden Zellen entfernt und das sezernierte Molekül wird mit einem biotinylierten Antikörper nachgewiesen, der im Vergleich zum Capture-Antikörper spezifisch für ein anderes Epitop ist. Als nächstes wird Streptavidinperoxidase hinzugefügt, gefolgt von der Zugabe eines Substrats, das die Detektion der Flecken ermöglicht (Abbildung 1). Die Stärke dieses Assays ist, dass es einem erlaubt, die Anzahl der Zellen zu quantitieren, die das Protein von Interesse produzieren. Wichtig ist, dass man beurteilen kann, ob sich die Gesamtzahl der Zellen, die ein bestimmtes Protein produzieren, verändert oder ob einzelne Zellen innerhalb einer Population mehr Protein produzieren. Darüber hinaus kann es Informationen über Kinetik liefern und kann verwendet werden, um die allgemeine Immunaktivierung (Mitogen-Stimulation) relativ zu antigenspezifischen Reaktionen (Antigensimulation) zu bewerten. Der ELISPOT-Test ermöglicht den Nachweis einer aktivierten Zelle unter 300.000 Zellen nach mitogener oder antigenspezifischer Aktivierung.

Abbildung 1: ELISPOT-Protokollübersicht.

Die Hauptvorteile dieses Assays sind seine- a. Einfachheit- das Protokoll ist relativ einfach und unkompliziert. Es erfordert keine technische Expertise, b. Sensitivität- es ermöglicht den Nachweis von Immunzellen auf einzelzellebener Ebene und erfordert sehr wenige Zellen im Vergleich zu anderen Methoden wie Durchflusszytometrie, c. Funktionalität – es liefert quantitative Daten über Immunzellen funktion.

Diese Übungseinheit zeigt das ELISPOT-Protokoll zum Nachweis von IFN-Sezersplenozyten, aber wie oben erwähnt, kann dieser Test auch zur Beurteilung der Antikörpersekretion durch B-Zellen verwendet werden (3).

Procedure

1. Einrichtung

Puffer und Reagenzien

Sterile Phosphat-gepufferte Saline (PBS) ohne Calcium oder Magnesium
Beschichtungspuffer – entweder steriles PBS oder Karbonatpuffer
Assay Verdünner – 10% fetales Rinderserum (FBS) in PBS
Zellkultur mittel- RPMI 1640 mit 10% FBS, Penicillin/Streptomycin, & L-Glutamin
Waschpuffer- PBS mit 0,05% Tween20
Doppelt destilliertes Wasser (ddH₂O)
Nachweis substrat- 100 mg AEC (3-Amino-9-ethyl-carbazol) in 10 ml DMF (N,N, Dimethylformamid).

ausrüstung

Laminare Durchflusshaube
Befeuchtter Inkubator (eingestellt auf 37°C, 5% CO₂)
Automatisiertes ELISPOT-Lesegerät oder Sezieren von Mikroskop

Materialien

ELISPOT-Platten
Sterile und nichtsterile Reservoirs
Pipettierer und Spitzen
Sterile serologische Pipetten
Sterile, konische Polypropylenrohre
Zwei Squeeze-Flaschen zum Plattenwaschen

Assay Spezifische Reagenzien

Zellen – Primärzellen oder Zelllinien (hier wurden Splenozyten von C57BL/6-Mäusen verwendet)
Stimulanzien- Mitogen oder Antigen (hier wurden phorbol 12-Myristate 13-Acetat (PMA, 50 ng/ml) und Ionomycin (1 m) verwendet)
Primärer Antikörper- biotinylatierter Antizytokin-Detektionsantikörper (verdünnt auf 2 g/ml in Assay-Verdünnungsmittel)
Sekundäre Antikörper- Streptavidin-Meerrettichperoxidase (SAv-HRP)

2. Verfahren

überzug

Um die Bedingungen steril und in einer laminaren Durchflusshaube zu halten, verdünnen Sie den gereinigten Antizytokin-Capture-Antikörper auf eine Endkonzentration von 0,5-4,0 g/ml im sterilen Beschichtungspuffer. (Hinweis: für IFN- – und IL-6 verwenden Sie 5 g/ml).
Übertragen Sie die Capture-Antikörperlösung, 100 l/well, auf die ELISPOT-Platte.
Bedecken Sie die Platte mit einer Plattenabdeckung und versiegeln Sie sie, um Verdunstung zu verhindern.
Inkubieren Sie die Platte über Nacht bei 4°C.

Blockieren

Am nächsten Tag entdecken Sie die ELISPOT-Platte in der laminaren Strömungshaube. Um die Platte schnell auf sterile Tücher umzukehren, um die Capture-Antikörperlösung aus jedem Brunnen zu entfernen.
Fügen Sie dann jedem Brunnen 200 L Zellkulturmedium hinzu. Dieser Schritt blockiert die unspezifische Bindung während des Testes.
Ersetzen Sie die Plattenabdeckung und inkubieren Sie die Platte für 2 Stunden bei 37°C.

Beschichtungs- und Aktivierungszellen

Während der Inkubation der Platte, bereiten Sie eine 2X Mitogen-Lösung mit 50 ng/ml PMA und 1 M Ionomycin in Zellkultur Medium.
Bereiten Sie dann Zielzellsuspensionen auf eine Lagerkonzentration von 2 x 10⁶ Zellen/ml vor.
Nachdem die Inkubation abgeschlossen ist, entfernen Sie das Zellkulturmedium aus jedem Brunnen, indem Sie die Platte schnell auf sterile Tücher in der laminaren Strömungshaube umkehren.
Als Nächstes generieren Sie eine 2x serielle Verdünnung der Stammzellsuspensionslösung. Dazu fügen Sie zunächst 200 l der vorbereiteten zellulären Suspensionsstocklösung in die Brunnen in der oberen Reihe der ELISPOT-Platte ein.
Fügen Sie dann 100 L des mediums einfache Zellkultur zu den nächsten fünf Reihen der Platte unter den Reihen hinzu, die eine zelluläre Stammlösung enthalten.
Führen Sie danach eine 2-fache serielle Verdünnung durch, indem Sie 100 l der Zellsuspension aus der oberen Reihe in die Reihe direkt darunter pipetieren. Sorgen Sie für eine ordnungsgemäße Durchmischung, indem Sie diese Lösung vorsichtig nach oben und unten pipetieren, um eine gleichmäßige Verteilung der Zellen zu gewährleisten.
Wiederholen Sie diesen Vorgang für die verbleibenden vier Zeilen.
Lassen Sie die sechste Reihe nur mit dem Kulturmedium. Es wird als experimentelle Kontrolle dienen.
Als nächstes fügen Sie 100 l der vorbereiteten Mitogenlösung in die Versuchsbrunnen der ersten fünf Reihen der Platte ein. In den Kontrollbrunnen und der sechsten Reihe fügen Sie 100 L der Zellkulturmedien ohne Mitogen hinzu.
Ersetzen Sie die Plattenabdeckung und inkubieren Platte bei 37°C, 5%_CO2 in einem Inkubator für 20-48 Stunden. (Hinweis: 20-24 Stunden sind in der Regel ausreichend, um IL-2 und TNF- zu erkennen, während 48 Stunden optimal für IL-4 und IFN-A sind).

entdeckung

Primärer Antikörper

Bereiten Sie den biotinylierten Antizytokin-Detektionsantikörper auf eine Konzentration von 2 g/ml in Assay-Verdünnungsmittel vor.
Bereiten Sie 20-25 ml Waschpuffer zu diesem Zeitpunkt durch Mischen von 0,05% Tween-20 in PBS.
Nachdem die Inkubation abgeschlossen ist, entkappen Sie die Platte und kehren Sie sie schnell über eine Spüle um, um alle Flüssigkeit aus den Brunnen zu entfernen. (Hinweis: Nach diesem Punkt muss die Platte nicht mehr steril gehalten werden).
Dann waschen Sie die Platte, indem Sie jedem Brunnen einen Waschpuffer von 200 L hinzufügen. Vertreiben Sie diese Flüssigkeit, indem Sie die Platte schnell umkehren und über eine Spüle flicken. Wiederholen Sie diesen Vorgang für insgesamt fünf Wähbe.
Als nächstes fügen Sie jedem Brunnen 100 l der verdünnten biotinylierten Antizytokin-Erkennungslösung hinzu. Bei Raumtemperatur 2 Stunden bei Raumtemperatur oder über Nacht bei 4°C inkubieren.

Sekundärer Antikörper

Nachdem die Inkubation abgeschlossen ist, vertreiben Sie den Detektionsantikörper, indem Sie die Platte umkehren und über das Waschbecken flicken.
Waschen Sie die Platte wie bisher 5 Mal mit einem Waschpuffer von 200 l, wodurch die Flüssigkeit zwischen den einzelnen Waschanlagen ausgegart ist.
Als nächstes fügen Sie jedem Brunnen 100 l verdünnte Streu-Meerrettich-Peroxidase-Lösung hinzu (verdünnt auf ihre vorbestimmte optimale Konzentration im Assay-Verdünnungsmittel).
Ersetzen Sie die Plattenabdeckung und inkubieren Sie bei Raumtemperatur 1,5-2 Stunden bei 37°C.

Substrat

Nach der Inkubation, nicht mehr als 15 Minuten vor Gebrauch, aktivieren Sie zuerst AEC Substratlösung nach Herstelleranweisungen.
Als nächstes entsorgen Sie den Inhalt der Brunnen und waschen Sie die Platte fünfmal mit Waschpuffer, wie zuvor.
Dann fügen Sie sofort 100 l vorbereitete AEC-Substratlösung in jeden Brunnen ein.
Inkubieren Sie die Platte bei Raumtemperatur für 10-20 Minuten, während Sie die Punktentwicklung überwachen.
Stoppen Sie die Reaktion, indem Sie die Platte mit Wasser abspülen und die Platte über das Waschbecken streichen.
Bloten Sie die Platte auf Papiertücher und lassen Sie die Platte über Nacht trocknen oder bis sie vollständig trocken ist. Das Entfernen der Kunststoffschale unter der Platte erleichtert das Trocknen.

3. Datenerfassung und -analyse

Nach dem Trocknen können die Spots mit einem automatisierten Plattenleser gezählt werden. Hier wird der CTL Immunospot Reader verwendet, aber dieses Protokoll kann für jeden Leser angepasst werden.
Schalten Sie zuerst das Gerät ein, dann den Computer. Öffnen Sie dann das CTL-Programm und klicken Sie auf “Scananzahl”.
Drücken Sie “Auswurf” für das Fach, um sich von der Maschine zu erstrecken. Entfernen Sie dann den Kunststoffadapter und richten Sie die Reihe “A” auf der ELISPOT-Platte und dem Adapter aus.
Wählen Sie einen Dateinamen und Speicherort für die zu speichernde Datei aus, und laden Sie die Platte auf das Fach.
Klicken Sie dann auf “Laden” auf die Software und schließen Sie die Tür auf der Seite der Maschine.
Drücken Sie “Start- nach dem Zählen”. Stellen Sie sicher, dass die Datei gespeichert ist, und öffnen Sie dann die Software “QC” der Qualitätskontrolle, um die Daten zu analysieren und die Anzahl der Spots zu zählen.

Notizen:

Die Mindestanzahl der Zellen sollte in Vorversuchen bestimmt werden. Die optimale Anzahl von Spots ist 50 €/gut. Wenn zu viele Zellen geladen werden, ist es schwierig, einzelne Stellen zu erkennen. Darüber hinaus überlappen sich die Zellen und bilden möglicherweise keine Monoschicht auf der Membran, so dass der Nachweisgrad reduziert werden kann.
Berücksichtigen Sie bei der Optimierung des Experiments den erwarteten Expressionsgrad des Zielproteins. Je niedriger der Ausdruck, desto höher ist die Anzahl der Zellen, die pro Bohrkörper benötigt werden.
Im Gegensatz zu ELISA ist es besser, die Platte von Hand zu waschen, als eine Plattenwäscherin zu verwenden. ELISPOT Platten sind empfindlicher und man sollte vermeiden, die PVDF-Membran zu punktieren.
Man sollte die Bewegung der Platte während der Inkubationszeit begrenzen, da es dazu führen kann, dass die Flecken verschmieren.
Platten sollten im Dunkeln gelagert werden, da die Exposition gegenüber direktem Licht dazu führt, dass Flecken verblassen.

Der enzymgebundene Immunospot, oder ELISPOT, Assay ist eine Methode, um die Immunantwort auf einen Erreger oder Zellschäden zu analysieren. Es ermöglicht die Quantifizierung der Aktivierung verschiedener Immunzellen durch den Nachweis bestimmter Proteine, die sie absondern. Beispielsweise wird ELISPOT häufig zur Messung von T-Zell-Antworten bei Exposition gegenüber einem fremden Antigen verwendet, indem sezernierte Zytokine erkannt werden.

Für einen auf Zytokin basierenden ELISPOT-Test beginnt der Prozess mit der Beschichtung einer ELISPOT-Mikroplatte mit einem Capture-Antikörper, der spezifisch für das Zielzytokin ist. Nach der Antikörperbeschichtung werden den Brunnen T-Zellen zugesetzt und durch einen externen Wirkstoff, wie z.B. Anti-CD3-Antikörper, stimuliert. Die Zellen sezernieren dann das Zielzytokin, das sofort durch den Capture-Antikörper immobilisiert wird. Da das Protein sofort nach der Sekretion aus lebenden Zellen ohne Verdünnung oder Abbau gefangen wird, hat dieser Test eine hohe Genauigkeit. Nachdem das Zielzytokin immobilisiert wurde, wird ein Detektionsantikörper hinzugefügt, der auch an das gefangene Zytokin bindet.

Die ELISPOT-Technik kann auch verwendet werden, um Gedächtnis-B-Zellen nach einer Infektion oder Impfung zu quantifizieren, indem ihre Produktion von spezifischen Antikörpern analysiert wird. In einem Antikörper-basierten ELISPOT wird ein spezifisches Antigen anstelle eines Antikörpers entweder für den Erfassungsschritt verwendet, bei dem das Antigen an die Platte gebunden wird, oder beim Detektionsschritt, bei dem das Antigen den Zielantikörper nach der Erfassung erkennt. In allen Variationen des Prozesses, bei T-Zellen oder B-Zellen, ist der Nachweisantikörper oder Antigen biotinyliert, was es ermöglicht, an ein Streptavidin-konjugiertes Detektionsenzym wie Meerrettichperoxidase zu binden. Dann wird nach Zugabe des Substrats der Peroxidase, AEC, ein dunkler, unlöslicher Niederschlag erzeugt. Dieser Niederschlag markiert die Position des gefangenen Proteins, und jede sekretorische Zelle ergibt einen sichtbaren Punkt, der mit einem ELISPOT-Reader oder einem Mikroskop quantifiziert werden kann. Die Größe der Flecken ist eine relative Schätzung der Menge an Protein, die von jeder Zelle abgesondert wird. Dieser Test kann Immunantworten von einzelnen Zellen erkennen, selbst in relativ kleinen Subpopulationen von sekretonischen Zellen, was es nützlich für die Untersuchung von Immunantworten auf zellulärer Ebene macht.

In diesem Video erfahren Sie, wie Sie einen ELISPOT-Test durchführen und dann die Flecken quantifizieren, die die Sekretorien darstellen.

Während des gesamten Experiments, sorgen Sie für sterile Bedingungen, indem Sie in einer laminaren Strömungshaube arbeiten und Handschuhe tragen.

Alle Berechnungen in diesem Protokoll basieren auf dem Volumen, das für eine 96-Well-Platte benötigt wird.

Verdünnen Sie zunächst den Antizytokin-Capture-Antikörper. Um dies zu tun, übertragen Sie 10 Milliliter Puffer in eine sterile 15 Milliliter konische Röhre. Verwenden Sie dann eine Pipette, um 10 Mikroliter von einem Milligramm pro Milliliter monoklonalen Antikörper in den Puffer zu geben, um eine Lösung mit einer Endkonzentration von einem Mikrogramm pro Milliliter zu erstellen. Als nächstes gießen Sie die Capture-Antikörperlösung in ein steriles Reservoir und verteilen Sie mit einer Mehrkanalpipette 100 Mikroliter in jeden Brunnen einer 96-Well-ELISPOT-Platte.

Bedecken Sie die Platte mit einer Plattenabdeckung, versiegeln Sie sie, um Verdunstung zu verhindern, und bebrüten Sie sie über Nacht bei vier Grad Celsius. Am nächsten Tag entdecken Sie die ELISPOT-Platte in der laminaren Strömungshaube. Um die Platte schnell auf sterile Tücher umzukehren, um die Capture-Antikörperlösung aus jedem Brunnen zu entfernen. Als Nächstes verwenden Sie eine Mehrkanalpipette, um jedem Brunnen 200 Mikroliter Zellkulturmedium hinzuzufügen. Dieser Schritt blockiert die unspezifische Bindung während des Testes. Ersetzen Sie die Plattenabdeckung und inkubieren Sie in einem 37 Grad Celsius Inkubator für zwei Stunden.

Während die Platte inkubiert, bereiten Sie eine 2X Mitogenlösung vor, indem Sie einen Mikroliter PMA und 20 Mikroliter Ionomycin zu 10 Milliliter Zellkulturmedium hinzufügen, um eine Endkonzentration von 15 Nanogramm pro Milliliter PMA und ein Mikromolarionomycin zu erreichen.

Zelluläre Suspensionen von Maus-Splenozyten sollten zu diesem Zeitpunkt auch in einer sterilen Haube zubereitet werden. Mit Einem Mikroskop und Hämozytometer messen Sie die Konzentration der Zellen und passen Sie das Gesamtvolumen an, bis eine Bestandskonzentration von zwei Millionen Zellen pro Milliliter erreicht ist.

Nach der Inkubation ist die Platte schnell auf sterile Tücher umgedreht, um das Zellkulturmedium aus jedem Brunnen zu entfernen. Als nächstes fügen Sie 200 Mikroliter der vorbereiteten zellulären Suspensionsstocklösung in die Brunnen in der oberen Reihe der ELISPOT-Platte ein. Richten Sie das Experiment in dreifacher Ausfertigung ein, sodass jeder getestete Zelltyp in einen Satz von drei gruppierten Spalten eingeteilt wird. Darunter fügen Sie 100 Mikroliter einfache Zellkultur Medium zu den nächsten fünf Reihen der Platte, unter den Reihen mit zellulären Stock Lösung.

Als nächstes führen Sie eine serielle Verdünnung durch, indem Sie 100 Mikroliter der Zellsuspension aus der oberen Reihe in die Reihe direkt darunter pipetieren und die Lösung sanft nach oben und unten pipetieren, um die Zellen gleichmäßig zu verteilen. Wiederholen Sie diesen Vorgang für die verbleibenden Zeilen, indem Sie bei jedem Schritt 100 Mikroliter von der vorherigen Zeile in die darunter stehende Zeile verschieben und fortfahren, bis die fünfte Zeile seriell verdünnt wurde. Lassen Sie die sechste Zeile nur mit zellkulturellem Medium, um als Kontrolle zu dienen. Um die Zellen in den experimentellen Brunnen der Platte zu stimulieren, fügen Sie 100 Mikroliter der vorbereiteten Mitogenlösung zu den zellulären Suspensionen in jedem Brunnen der Reihen eins bis fünf hinzu. Achten Sie darauf, die sechste Reihe, die als Kontrolle dienen wird, unstimuliert zu verlassen. Ersetzen Sie den Deckel und inkubieren Sie die Platte bei 37 Grad Celsius und 5% CO2 für 24 bis 48 Stunden.

Bereiten Sie den verdünnten biotinylierten Antizytokin-Detektionsantikörper vor. Bereiten Sie zunächst 50 Milliliter Assay-Verdünnungsmittel vor, indem Sie 5 Milliliter 10% fetales Rinderserum zu 45 Milliliter PBS hinzufügen. Als nächstes verdünnen Sie den nachweisbaren Antikörper auf eine Konzentration von 2 Mikrogramm pro Milliliter in Assay-Verdünnungsmittel. Bereiten Sie zu diesem Zeitpunkt außerdem 20 bis 25 Milliliter Waschpuffer vor, indem Sie 0,05 % Tween-20 und PBS mischen.

Nachdem die Inkubation abgeschlossen ist, entfernen Sie die Platte und kehren Sie sie schnell um, um alle Flüssigkeit aus den Brunnen zu entfernen. Waschen Sie die Platte, indem Sie jedem Brunnen etwa 200 Mikroliter Waschpuffer hinzufügen. Vertreiben Sie diese Flüssigkeit, indem Sie die Platte schnell umkehren und über eine Spüle flicken. Wiederholen Sie diesen Vorgang vier weitere Male für insgesamt fünf Wähbe. Als nächstes fügen Sie 100 Mikroliter der verdünnten Detektions-Antikörperlösung zu jedem Brunnen hinzu, ersetzen Sie den Deckel und inkubieren Sie bei Raumtemperatur für zwei Stunden. Nach der Inkubation die Detektions-Antikörperlösung aus den Plattenbrunnen vertreiben, indem Sie die Platte umkehren und über das Waschbecken flicken.

Waschen Sie die Platte wie bisher fünfmal mit Waschpuffer und vertreiben Sie die Flüssigkeit zwischen den einzelnen Waschanlagen. Nach der letzten Wäsche die Streptavidin- Meerrettich-Peroxidase-Lösung vorbereiten, indem Sie sie gemäß den Anweisungen des Herstellers verdünnen. Als nächstes, mit den Brunnen der Platte leer, fügen Sie 100 Mikroliter verdünnt Streptavidin- Meerrettich Peroxidase Lösung zu jedem Brunnen. Legen Sie den Deckel wieder auf die Platte und brüten Sie bei Raumtemperatur für zwei Stunden.

Aktivieren Sie nach der Inkubation nicht mehr als 15 Minuten vor Gebrauch die vorgefertigte AEC-Substratlösung. Entsorgen Sie den Inhalt der Brunnen und waschen Sie den Teller fünfmal mit Waschpuffer, wie zuvor. Dann sofort 100 Mikroliter vorbereitete AEC Substratlösung in jeden Brunnen geben. Lassen Sie die Platte bei Raumtemperatur für etwa 10 bis 20 Minuten entwickeln, während die Spot-Entwicklung zu überwachen. Diese Flecken erscheinen als kleine, abgedunkelte Kreise auf der Oberfläche der Brunnen. Stoppen Sie dann die Reaktion, indem Sie die Platte mit Wasser abspülen und über das Waschbecken streicheln. Die Platte auf Papiertücher naugen und über Nacht oder bis zum Trocknen trocknen lassen. Das Entfernen der Kunststoffschale unter der Platte erleichtert das Trocknen. Nach dem Trocknen können die Spots mit einem automatisierten Plattenleser gezählt werden.

Hier wird der CTL ImmunoSpot Reader verwendet, aber dieses Protokoll kann für jeden Leser angepasst werden. Öffnen Sie dann das CTL-Programm und klicken Sie auf Scan Count. Drücken Sie den Auswurf für das Fach, um sich von der Maschine zu erstrecken. Entfernen Sie dann den Kunststoffadapter, und richten Sie Zeile A auf der ELISPOT-Platte und dem ADAPTER aus. Wählen Sie einen Dateinamen und Speicherort für die zu speichernde Datei aus, und laden Sie die Platte und den Adapter auf das Fach. Klicken Sie auf die Software laden und schließen Sie die Tür auf der Seite der Maschine. Drücken Sie dann Start after Counting. Stellen Sie sicher, dass die Datei gespeichert ist, und öffnen Sie dann die QC-Software Qualitätskontrolle, um die Daten zu analysieren und die Anzahl der Spots zu zählen. Exportieren Sie diese Daten als Excel-Datei. Sobald die Analyse abgeschlossen ist, klicken Sie auf Auswerfen, um die Platte abzurufen.

In diesem Experiment wurden Zellen von Wildtyp und tumortragenden Mäusen plattiert und auf IFN-Gamma analysiert. Beachten Sie, dass die Anzahl der Flecken mit abnehmender Zellkonzentration abnimmt. In der Regel werden ELISPOT-Daten als Anzahl der Spotzahlen pro Anzahl der plattierten Zellen dargestellt. In diesem Beispiel wurde die Anzahl der Spots in einem Balkendiagramm angezeigt, wobei die jeweilige Zellkonzentration auf der x-Achse aufgeführt ist. Beachten Sie, dass die Anzahl der Spots die Anzahl der aktivierten Zellen pro Gesamtzahl der Zellen in einer bestimmten Grundgesamtheit angibt.

Results

In diesem ELISPOT-Assay wurden milden Leukozyten von Wildtyp- und tumortragenden Mäusen auf IFN-A analysiert. Abbildung 2 A zeigt das visuelle Bild des Assay-Ergebnisses. Die Zahlen in der grünen Farbe geben die Anzahl der Flecken pro Bohrkörper an (TNTC gibt “zu zahlreich an, um zu zählen”). Beachten Sie, dass die Anzahl der Flecken mit abnehmender Zellkonzentration abnimmt.

Abbildung 2A: Verminderte Immunantworten bei tumortragenden Mäusen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

In der Regel werden ELISPOT-Daten als Anzahl der Spotzahlen pro Anzahl der plattierten Zellen dargestellt. In Abbildung 2 B wird die Anzahl der Flecken in einem Balkendiagramm angezeigt, wobei die jeweilige Zellkonzentration auf der X-Achse aufgeführt ist. Für Graphikzwecke wurde 150 verwendet, um die maximale Anzahl von Spots anzugeben. Die Zahl der IFN–N, die murine Milzleukozyten bei tumortragenden Tieren produzieren, ist geringer als die der wilden Tiere.

Abbildung 2B: Verminderte Immunantworten bei tumortragenden Mäusen. Splenozyten wurden von der Kontrolle C57BL/6 (Wildtyp) und tumortragenden Mäusen geerntet und 48 Stunden lang mit PMA/Ionomycin stimuliert. ELISPOT-Assays wurden verwendet, um die Anzahl der IFN–produzierenden Milzleukozyten zu quantifizieren. (A) Visuelle und (B) grafische Darstellung der Daten. TNTC gibt an, dass zu zahlreich gezählt werden kann. Für Graphikzwecke wurde 150 verwendet, um die maximale Anzahl von Spots anzugeben. Die grünen Zahlen geben die Anzahl der gezählten Spots pro Brunnen an. Die roten Zahlen geben die Referenzbrunnen an, die verwendet wurden, um zu bestimmen, welche Flecken Zellen waren und welche Flecken Trümmer, Artefakte oder Kanteneffekte waren und von der Analyse ausgeschlossen werden sollten.

Applications and Summary

Der ELISPOT-Assay ermöglicht es, die Aktivierung von Immunzellen zu bewerten, indem die Anzahl der Zellen bestimmt wird, die einen bestimmten Analyten absondern. Die Größe und Intensität der Flecken gibt Auskunft über die Menge an Analyt, die von jeder Zelle produziert wird. Das oben beschriebene Protokoll beschreibt den Nachweis eines einzelnen Zytokins. Die jüngsten Entwicklungen haben jedoch den Nutzen dieses Assays verbessert. Derzeit kann man fluoreszierende Detektionsfarbstoffe verwenden, um mehrere Analyten in einem Brunnen zu erkennen. Dies ermöglicht die Detektion verschiedener Subpopulationen von Zellen, die entweder ein oder beide Analyten absondern.

References

Czerkinsky, C. C., Nilsson, L. A., Nygren, H., Ouchterlony, O., & Tarkowski, A. A solid-phase enzyme-linked immunospot (ELISPOT) assay for enumeration of specific antibody-secreting cells. Journal of Immunological Methods, 65 (1), 109-121(1983).
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Transcript

The Enzyme-linked Immunospot, or ELISPOT, assay is a method to analyze the immune response to a pathogen or cell damage. It allows for quantification of the activation of different immune cells by detecting specific proteins they secrete. For example, ELISPOT is commonly used for measuring T-cell responses upon exposure to a foreign antigen by detecting secreted cytokines.

For a cytokine-based ELISPOT assay, the process begins with the coating of an ELISPOT microplate with a capture antibody, which is specific to the target cytokine. After the antibody coating, T-cells are added to the wells and stimulated by an external agent, like anti-CD3 antibody, for example. The cells then secrete the target cytokine, which immediately gets immobilized by the capture antibody. Since the protein is captured instantly post-secretion from live cells, without dilution or degradation, this assay has a high accuracy. After the target cytokine is immobilized, a detection antibody is added, which also binds to the captured cytokine.

The ELISPOT technique can also be used to quantify memory B-cells after an infection or vaccination by analyzing their production of specific antibodies. In an antibody-based ELISPOT, a specific antigen is used instead of an antibody for either the capture step, where the antigen will be bound to the plate, or at the detection step, where the antigen detects the target antibody post-capture. In all variations of the process, for T-cells or B-cells, the detection antibody or antigen is biotinylated, which allows it to bind to a streptavidin-conjugated detection enzyme, such as horseradish peroxidase. Then, upon addition of the peroxidase’s substrate, AEC, a dark, insoluble precipitate is produced. This precipitate marks the location of the captured protein, and each secretory cell results in a visible spot, which can be quantified using an ELISPOT reader or a microscope. The size of the spots is a relative estimate of the amount of protein secreted from each cell. This assay can detect immune responses from single cells, even in relatively small subpopulations of secretory cells, making it useful for studying immune responses at the cellular level.

In this video, you will learn how to perform an ELISPOT assay and then quantify the spots representing the secretory cells.

Throughout the experiment, ensure sterile conditions by working in a laminar flow hood and wearing gloves.

All calculations in this protocol are based on the volume needed for one 96-well plate.

First, dilute the anti-cytokine capture antibody. To do this, transfer 10 milliliters of buffer into a sterile 15 milliliter conical tube. Then, use a pipette to add 10 microliters of one milligram per milliliter of monoclonal antibody to the buffer to create a solution with a final concentration of one microgram per milliliter. Next, pour the capture antibody solution into a sterile reservoir and, using a multichannel pipette, distribute 100 microliters into each well of a 96-well ELISPOT plate.

Cover the plate with a plate cover, seal it to prevent evaporation, and incubate overnight at four degrees Celsius. The next day, uncover the ELISPOT plate in the laminar flow hood. Quickly invert the plate onto sterile wipes to remove the capture antibody solution from each well. Next, use a multichannel pipette to add 200 microliters of cell culture medium to each well. This step will block non-specific binding during the assay. Replace the plate cover and incubate in a 37 degrees Celsius incubator for two hours.

While the plate is incubating, prepare a 2X mitogen solution by adding one microliter of PMA and 20 microliters of ionomycin to 10 milliliters of cell culture medium to achieve a final concentration of 15 nanograms per milliliter PMA and one micromolar ionomycin.

Cellular suspensions of mouse splenocytes should also be prepared at this time in a sterile hood. Using a microscope and hemocytometer, measure the concentration of cells and adjust the total volume until a stock concentration of two million cells per milliliter is reached.

After incubation is complete, quickly invert the plate onto sterile wipes to remove the cell culture medium from each well. Next, add 200 microliters of the prepared cellular suspension stock solution to the wells in the top row of the ELISPOT plate. Set up the experiment in triplicate, so that each cell type tested will be plated in a set of three grouped columns. Below this, add 100 microliters of plain cell culture medium to the next five rows of the plate, below the rows containing cellular stock solution.

Next, perform a serial dilution by pipetting 100 microliters of the cell suspension from the top row into the row directly below, gently pipetting the solution up and down to evenly distribute the cells. Repeat this process for the remaining rows, moving 100 microliters from the previous row to the row below at each step, continuing until the fifth row has been serially diluted. Leave the sixth row with cell culture medium only, to serve as a control. To stimulate the cells in the experimental wells of the plate, add 100 microliters of the prepared mitogen solution to the cellular suspensions in each well of rows one through five. Be sure to leave the sixth row, which will serve as the control, unstimulated. Replace the lid and incubate the plate at 37 degrees Celsius and 5% CO2 for 24 to 48 hours.

Prepare the diluted biotinylated anti-cytokine detecting antibody. First, prepare 50 milliliters of assay diluent by adding 5 milliliters of 10% fetal bovine serum to 45 milliliters of PBS. Next, dilute the detecting antibody to a concentration of 2 micrograms per milliliter in assay diluent. Also, prepare 20 to 25 milliliters of wash buffer at this time, by mixing .05% Tween-20 and PBS.

After the incubation is complete, uncap the plate and quickly invert it to remove all liquid from the wells. Wash the plate by adding about 200 microliters of wash buffer to each well. Expel this liquid by quickly inverting and flicking the plate over a sink. Repeat this process four more times for a total of five washes. Next, add 100 microliters of the diluted detection antibody solution to each well, replace the lid, and incubate at room temperature for two hours. After incubation, expel the detection antibody solution from the wells of the plate by inverting and flicking the plate over the sink.

As before, wash the plate five times with wash buffer, expelling the liquid between each wash. After the final wash, prepare the streptavidin- horseradish peroxidase solution by diluting it according to the manufacturer’s instructions. Next, with the wells of the plate empty, add 100 microliters of diluted streptavidin- horseradish peroxidase solution to each well. Place the lid back onto the plate and incubate at room temperature for two hours.

After the incubation, no more than 15 minutes before use, activate pre-made AEC substrate solution. Discard the contents of the wells and wash the plate five times with wash buffer, as before. Then, immediately add 100 microliters of prepared AEC substrate solution into each well. Leave the plate at room temperature to develop for approximately 10 to 20 minutes, while monitoring spot development. These spots will appear as small, darkened circles on the surface of the wells. Then, stop the reaction by rinsing the plate with water and flicking it over the sink. Blot the plate on paper towels and allow to air dry overnight or until completely dry. Removing the plastic tray under the plate will facilitate drying. After drying, the spots are ready to be counted with an automated plate reader.

Here, the CTL ImmunoSpot reader is used, but this protocol can be adapted for any reader. Then, open the CTL program and click on Scan Count. Push eject for the tray to extend from the machine. Then, remove the plastic adapter and align row A on the ELISPOT plate and adapter. Choose a file name and location for the file to be saved and load the plate and adapter onto the tray. Click Load on the software and close the door on the side of the machine. Then, press Start After Counting. Ensure that the file is saved and then open the Quality Control QC software to analyze the data and count the number of spots. Export this data as an Excel file. Once analysis is complete, click Eject to retrieve the plate.

In this experiment, cells from wild type and tumor-bearing mice were plated and analyzed for IFN gamma. Notice that the number of spots decreases with decreasing cell concentration. Typically, ELISPOT data are presented as the number of spot counts per number of cells plated. In this example, the number of spots were displayed in a bar graph, with each respective cellular concentration listed on the x-axis. Notice that the number of spots indicates the number of activated cells per total number of cells in a given population.

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