ELISPOT-Assay: Nachweis von IFN-γ-sezernierenden Splenozyten

1. Einrichtung

Puffer und Reagenzien

1. Sterile Phosphat-gepufferte Saline (PBS) ohne Calcium oder Magnesium
2. Beschichtungspuffer - entweder steriles PBS oder Karbonatpuffer
3. Assay Verdünner - 10% fetales Rinderserum (FBS) in PBS
4. Zellkultur mittel- RPMI 1640 mit 10% FBS, Penicillin/Streptomycin, & L-Glutamin
5. Waschpuffer- PBS mit 0,05% Tween20
6. Doppelt destilliertes Wasser (ddH₂O)
7. Nachweis substrat- 100 mg AEC (3-Amino-9-ethyl-carbazol) in 10 ml DMF (N,N, Dimethylformamid).

ausrüstung

8. Laminare Durchflusshaube
9. Befeuchtter Inkubator (eingestellt auf 37°C, 5% CO₂)
10. Automatisiertes ELISPOT-Lesegerät oder Sezieren von Mikroskop

Materialien

11. ELISPOT-Platten
12. Sterile und nichtsterile Reservoirs
13. Pipettierer und Spitzen
14. Sterile serologische Pipetten
15. Sterile, konische Polypropylenrohre
16. Zwei Squeeze-Flaschen zum Plattenwaschen

Assay Spezifische Reagenzien

17. Zellen - Primärzellen oder Zelllinien (hier wurden Splenozyten von C57BL/6-Mäusen verwendet)
18. Stimulanzien- Mitogen oder Antigen (hier wurden phorbol 12-Myristate 13-Acetat (PMA, 50 ng/ml) und Ionomycin (1 m) verwendet)
19. Primärer Antikörper- biotinylatierter Antizytokin-Detektionsantikörper (verdünnt auf 2 g/ml in Assay-Verdünnungsmittel)
20. Sekundäre Antikörper- Streptavidin-Meerrettichperoxidase (SAv-HRP)

2. Verfahren

überzug

1. Um die Bedingungen steril und in einer laminaren Durchflusshaube zu halten, verdünnen Sie den gereinigten Antizytokin-Capture-Antikörper auf eine Endkonzentration von 0,5-4,0 g/ml im sterilen Beschichtungspuffer. (Hinweis: für IFN- - und IL-6 verwenden Sie 5 g/ml).
2. Übertragen Sie die Capture-Antikörperlösung, 100 l/well, auf die ELISPOT-Platte.
3. Bedecken Sie die Platte mit einer Plattenabdeckung und versiegeln Sie sie, um Verdunstung zu verhindern.
4. Inkubieren Sie die Platte über Nacht bei 4°C.

Blockieren

5. Am nächsten Tag entdecken Sie die ELISPOT-Platte in der laminaren Strömungshaube. Um die Platte schnell auf sterile Tücher umzukehren, um die Capture-Antikörperlösung aus jedem Brunnen zu entfernen.
6. Fügen Sie dann jedem Brunnen 200 L Zellkulturmedium hinzu. Dieser Schritt blockiert die unspezifische Bindung während des Testes.
7. Ersetzen Sie die Plattenabdeckung und inkubieren Sie die Platte für 2 Stunden bei 37°C.

Beschichtungs- und Aktivierungszellen

8. Während der Inkubation der Platte, bereiten Sie eine 2X Mitogen-Lösung mit 50 ng/ml PMA und 1 M Ionomycin in Zellkultur Medium.
9. Bereiten Sie dann Zielzellsuspensionen auf eine Lagerkonzentration von 2 x 10⁶ Zellen/ml vor.
10. Nachdem die Inkubation abgeschlossen ist, entfernen Sie das Zellkulturmedium aus jedem Brunnen, indem Sie die Platte schnell auf sterile Tücher in der laminaren Strömungshaube umkehren.
11. Als Nächstes generieren Sie eine 2x serielle Verdünnung der Stammzellsuspensionslösung. Dazu fügen Sie zunächst 200 l der vorbereiteten zellulären Suspensionsstocklösung in die Brunnen in der oberen Reihe der ELISPOT-Platte ein.
12. Fügen Sie dann 100 L des mediums einfache Zellkultur zu den nächsten fünf Reihen der Platte unter den Reihen hinzu, die eine zelluläre Stammlösung enthalten.
13. Führen Sie danach eine 2-fache serielle Verdünnung durch, indem Sie 100 l der Zellsuspension aus der oberen Reihe in die Reihe direkt darunter pipetieren. Sorgen Sie für eine ordnungsgemäße Durchmischung, indem Sie diese Lösung vorsichtig nach oben und unten pipetieren, um eine gleichmäßige Verteilung der Zellen zu gewährleisten.
14. Wiederholen Sie diesen Vorgang für die verbleibenden vier Zeilen.
15. Lassen Sie die sechste Reihe nur mit dem Kulturmedium. Es wird als experimentelle Kontrolle dienen.
16. Als nächstes fügen Sie 100 l der vorbereiteten Mitogenlösung in die Versuchsbrunnen der ersten fünf Reihen der Platte ein. In den Kontrollbrunnen und der sechsten Reihe fügen Sie 100 L der Zellkulturmedien ohne Mitogen hinzu.
17. Ersetzen Sie die Plattenabdeckung und inkubieren Platte bei 37°C, 5%_CO2 in einem Inkubator für 20-48 Stunden. (Hinweis: 20-24 Stunden sind in der Regel ausreichend, um IL-2 und TNF- zu erkennen, während 48 Stunden optimal für IL-4 und IFN-A sind).

entdeckung

Primärer Antikörper

18. Bereiten Sie den biotinylierten Antizytokin-Detektionsantikörper auf eine Konzentration von 2 g/ml in Assay-Verdünnungsmittel vor.
19. Bereiten Sie 20-25 ml Waschpuffer zu diesem Zeitpunkt durch Mischen von 0,05% Tween-20 in PBS.
20. Nachdem die Inkubation abgeschlossen ist, entkappen Sie die Platte und kehren Sie sie schnell über eine Spüle um, um alle Flüssigkeit aus den Brunnen zu entfernen. (Hinweis: Nach diesem Punkt muss die Platte nicht mehr steril gehalten werden).
21. Dann waschen Sie die Platte, indem Sie jedem Brunnen einen Waschpuffer von 200 L hinzufügen. Vertreiben Sie diese Flüssigkeit, indem Sie die Platte schnell umkehren und über eine Spüle flicken. Wiederholen Sie diesen Vorgang für insgesamt fünf Wähbe.
22. Als nächstes fügen Sie jedem Brunnen 100 l der verdünnten biotinylierten Antizytokin-Erkennungslösung hinzu. Bei Raumtemperatur 2 Stunden bei Raumtemperatur oder über Nacht bei 4°C inkubieren.

Sekundärer Antikörper

23. Nachdem die Inkubation abgeschlossen ist, vertreiben Sie den Detektionsantikörper, indem Sie die Platte umkehren und über das Waschbecken flicken.
24. Waschen Sie die Platte wie bisher 5 Mal mit einem Waschpuffer von 200 l, wodurch die Flüssigkeit zwischen den einzelnen Waschanlagen ausgegart ist.
25. Als nächstes fügen Sie jedem Brunnen 100 l verdünnte Streu-Meerrettich-Peroxidase-Lösung hinzu (verdünnt auf ihre vorbestimmte optimale Konzentration im Assay-Verdünnungsmittel).
26. Ersetzen Sie die Plattenabdeckung und inkubieren Sie bei Raumtemperatur 1,5-2 Stunden bei 37°C.

Substrat

27. Nach der Inkubation, nicht mehr als 15 Minuten vor Gebrauch, aktivieren Sie zuerst AEC Substratlösung nach Herstelleranweisungen.
28. Als nächstes entsorgen Sie den Inhalt der Brunnen und waschen Sie die Platte fünfmal mit Waschpuffer, wie zuvor.
29. Dann fügen Sie sofort 100 l vorbereitete AEC-Substratlösung in jeden Brunnen ein.
30. Inkubieren Sie die Platte bei Raumtemperatur für 10-20 Minuten, während Sie die Punktentwicklung überwachen.
31. Stoppen Sie die Reaktion, indem Sie die Platte mit Wasser abspülen und die Platte über das Waschbecken streichen.
32. Bloten Sie die Platte auf Papiertücher und lassen Sie die Platte über Nacht trocknen oder bis sie vollständig trocken ist. Das Entfernen der Kunststoffschale unter der Platte erleichtert das Trocknen.

3. Datenerfassung und -analyse

1. Nach dem Trocknen können die Spots mit einem automatisierten Plattenleser gezählt werden. Hier wird der CTL Immunospot Reader verwendet, aber dieses Protokoll kann für jeden Leser angepasst werden.
2. Schalten Sie zuerst das Gerät ein, dann den Computer. Öffnen Sie dann das CTL-Programm und klicken Sie auf "Scananzahl".
3. Drücken Sie "Auswurf" für das Fach, um sich von der Maschine zu erstrecken. Entfernen Sie dann den Kunststoffadapter und richten Sie die Reihe "A" auf der ELISPOT-Platte und dem Adapter aus.
4. Wählen Sie einen Dateinamen und Speicherort für die zu speichernde Datei aus, und laden Sie die Platte auf das Fach.
5. Klicken Sie dann auf "Laden" auf die Software und schließen Sie die Tür auf der Seite der Maschine.
6. Drücken Sie "Start- nach dem Zählen". Stellen Sie sicher, dass die Datei gespeichert ist, und öffnen Sie dann die Software "QC" der Qualitätskontrolle, um die Daten zu analysieren und die Anzahl der Spots zu zählen.

Notizen:

1. Die Mindestanzahl der Zellen sollte in Vorversuchen bestimmt werden. Die optimale Anzahl von Spots ist 50 €/gut. Wenn zu viele Zellen geladen werden, ist es schwierig, einzelne Stellen zu erkennen. Darüber hinaus überlappen sich die Zellen und bilden möglicherweise keine Monoschicht auf der Membran, so dass der Nachweisgrad reduziert werden kann.
2. Berücksichtigen Sie bei der Optimierung des Experiments den erwarteten Expressionsgrad des Zielproteins. Je niedriger der Ausdruck, desto höher ist die Anzahl der Zellen, die pro Bohrkörper benötigt werden.
3. Im Gegensatz zu ELISA ist es besser, die Platte von Hand zu waschen, als eine Plattenwäscherin zu verwenden. ELISPOT Platten sind empfindlicher und man sollte vermeiden, die PVDF-Membran zu punktieren.
4. Man sollte die Bewegung der Platte während der Inkubationszeit begrenzen, da es dazu führen kann, dass die Flecken verschmieren.
5. Platten sollten im Dunkeln gelagert werden, da die Exposition gegenüber direktem Licht dazu führt, dass Flecken verblassen.