Immunhistochemie und Immunzytochemie: Gewebebildgebung mittels Lichtmikroskopie

1. Präparation von Zellen für die Immunzytochemie

1. Saatzellen von Interesse auf kammerförmigen Dias oder kammerförmigen Decklippen durch Zugabe von 0,5 ml Zellsuspension zu den Brunnen einer 24 Brunnenkulturplatte.
   Hinweis: Einige Zellen können Wachstum auf behandelten Coverlips erfordern, wie z. B. Mit Polylysin behandelte Abdeckungen. Die optimalen Behandlungsbedingungen sollten vom Anwender in Abhängigkeit vom verwendeten Zelltyp bestimmt werden.
2. Legen Sie die Platte in einen befeuchteten CO2-Inkubator und lassen Sie die Zellen bei 37°C bis 50-70% Konflukation wachsen.
3. Sobald die Zellen eine optimale Koninfluenza erreicht haben, entfernen Sie die Kulturmedien aus jedem Brunnen und fixieren Sie die Zellen, indem Sie sie in 0,5 ml von 4% PFA (in 1X PBS) inkubieren und 20 min bei Raumtemperatur inkubieren.
4. Entfernen Sie die Fixierung und waschen Sie die Brunnen dreimal mit 1 ml 1X PBS.
5. Als nächstes permeabilisieren Sie die Zellen, indem Sie 0,5 ml von 0,1% Triton-X-100 in 1X PBS zu jedem Brunnen hinzufügen und 15 min bei Raumtemperatur inkubieren.
6. Den Permeabilisationspuffer absaugen und die Brunnen dreimal mit 1 ml 1X PBS waschen.
7. Die Zellen auf Denlips sind nun fixiert und permeabilisiert. Gehen Sie mit dem Färbungsverfahren für das folgende Immunohistochemie Beispiel gezeigt - mit der Ausnahme, dass die Inkubationen innerhalb der Brunnen der 24 Well-Platte statt direkt auf einem Gewebeabschnitt Dia durchgeführt werden sollte.

2. Vorbereitung von Formalin-Fixed, Paraffin-Embedded-Abschnitten für die Färbung

1. Erhalten Sie vorbereitete formalinfixierte, paraffineingebettete Gewebeabschnitte.

Deparaffinisierung

2. Tauchen Sie die Dias in 100% Xylol 2 mal für 5 min jeder.

Rehydration

3. Tauchen Sie die Dias in 100% Ethanol 2 mal für jeweils 3 min ein.
4. Tauchen Sie die Dias in 95% Ethanol für 3 min ein.
5. Tauchen Sie die Dias in 70% Ethanol für 3 min ein.
6. Tauchen Sie die Dias in 50% Ethanol für 3 min ein.

Blockieren der aktivitäten der endogene Peroxidase

7. Inkubieren Sie die Dias in 100 ml von 0,3% H₂O₂ für 30 min bei Raumtemperatur.
8. Waschen Sie die Dias mit 1X PBS 2 mal für je 5 min.

Antigen Retrieval

9. Tauchen Sie die Dias in den IHC-Citratpuffer (pH 6) ein und kochen Sie sie 20 min hoch.
10. Geweberutschen sind nun zur Färbung bereit.

3. Vorbereitung von frisch gefrorenen, OTC-eingebetteten Abschnitten für die Färbung

1. Legen Sie 5 mm frisch isoliertes Gewebe in eine Form und fügen Sie OCT hinzu, bis der Abschnitt vollständig abgedeckt ist.
2. Tauchen Sie den Gewebeblock langsam in flüssigen Stickstoff ein, bis er vollständig eingefroren ist. Die Probe kann nun bis zu einem Jahr bei -80°C gelagert werden.
3. Sobald sie zum Schnitt bereit sind, übertragen Sie den gefrorenen Gewebeblock in einen Kryostat und lassen Sie das gesamte Setup auf -20°C kommen.
4. Schneiden Sie 5-10 m dicke Gewebeabschnitte mit einem Kryostat und verwenden Sie Pinsel, um Abschnitte direkt auf IHC-kompatible Glasschlitten zu platzieren.
5. Lassen Sie Die Dias über Nacht bei Raumtemperatur trocknen. Die Dias können auch bei -80°C gelagert werden.
6. Tauchen Sie die Dias in 250 ml von 4% PFA für 15 min bei Raumtemperatur ein, um die Dias vor der Färbung zu fixieren. Die optimale Fixierungsmethode sollte vom Benutzer bestimmt werden.
7. Tauchen Sie die Dias in 250 ml 1X PBS 2 mal für 5 min pro Stück ein.
8. Tauchen Sie die Dias in 250 ml von 0,3%_H2O2 für 30 min bei Raumtemperatur ein, um jede endogene Peroxidaseaktivität zu blockieren.
9. Tauchen Sie die Dias in 250 ml 1X PBS 2 mal für 5 min pro Stück ein.
10. Die Dias sind nun zur Färbung bereit.

4. Färbung

1. Kreisen Sie das Gewebe mit einer hydrophoben Barriere mit einem Barrierestift.

Blockieren

2. Mit einer Pipette 100 l Sperrpuffer (Pferdeserum in 1X PBS verdünnt) - über den Abschnitt für 1 Stunde bei Raumtemperatur.
3. Entfernen Sie den Blockierpuffer mit einer Pipette.

Primäre Antikörper-Inkubation

4. Inkubieren Sie das eingekreiste Gewebe mit 100 l verdünnter Primärantikörperlösung (Maus antihumanes Cyclin D1 verdünnt 1:100 im Sperrpuffer) 30 min bei Raumtemperatur.
5. Entleeren Sie den primären Antikörper von jedem Schlitten und waschen Sie die Dias mit 1X PBS 2 mal für jeweils 5 min.

Sekundäre Antikörperinkubation

6. Inkubieren Sie die Probe mit 100 l verdünntem biotinylierten Sekundärantikörper (biotinyliertes Pferd Antimaus-IgG verdünnt 1:200) für 30 min bei Raumtemperatur.
7. Entfernen Sie den sekundären Antikörper, indem Sie die Abschnitte abtropfen lassen und mit 1X PBS 2 mal für jeweils 5 min waschen.

Farbentwicklung

8. Visualisierung mit HRP: Add 100 l Avidin-Biotin-Komplex (ABC) Reagenz und inkubieren die Abschnitte in dunkel in für 30 min bei Raumtemperatur
   Hinweis: Fluoreszierend markierte Antikörper können auch mit einem geeigneten Mikroskop verwendet und visualisiert werden.
9. Waschen Sie die Dias mit 1X PBS 2 mal für je 5 min.
10. Entwickeln Sie die Dias, indem Sie die Abschnitte in 100 l DAB für bis zu 5 min inkubieren.
11. Stoppen Sie die Entwicklung, indem Sie destilliertes Wasser (dH₂O) für 5 min bei Raumtemperatur hinzufügen.

Gegenfärbung (falls gewünscht)

12. Tauchen Sie die Dias kurz in Harris Hematoxylin Solution (oder 0,5% Methylgrün in 0,1M Natriumacetat (pH 4,2)) für 10 min.
13. Spülen Sie den Gegenfleck ab, indem Sie rutschen in dH₂O zweimal für jeweils 5 min waschen.

austrocknung

14. Tauchen Sie die Dias in 95% Ethanol 2 mal für 5 min jeder.
15. Tauchen Sie die Dias in 100% Ethanol 2 mal für 5 min jeder.
16. Tauchen Sie die Dias in 100% Xylol 2 mal für 5 min jeder.
17. Blot die Dias mit einem Papiertuch.

Montage- und Deckbedeckungsapplikation

18. Fügen Sie den Dias einen Tropfen Montagemedien wie Organo-Limonene Mount hinzu und legen Sie einen Deckzettel über die Abschnitte.

Mikroskopische Analyse

19. Beobachten Sie die gebeizten Abschnitte unter einem geeigneten Mikroskop für die Analyse. Hier wurde ein Standard-Lichtmikroskop zur Beobachtung und eine montierte Digitalkamera zur Bildgebung eingesetzt.