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Quelle: Michael S. Lee1 und Tonya J. Webb1
1 Department of Microbiology and Immunology, University of Maryland School of Medicine and the Marlene and Stewart Greenebaum Comprehensive Cancer Center, Baltimore, Maryland 21201
Immunhistochemie (IHC) und Immunzytochemie (ICC) sind Techniken, die verwendet werden, um die Expression und Lokalisierung spezifischer Antigene mit Antikörpern zu visualisieren. Die erste veröffentlichte Anwendung von IHC war 1941, als Albert Coons die Technik benutzte, um das Vorhandensein von Pneumokokken-Antigen in Gewebeabschnitten von Mäusen zu visualisieren, die mit Pneumokokken infiziert waren (1). Der Name, Immunhistochemie, leitet sich von den Wurzeln "immuno-" in Bezug auf Antikörper und "Histo-" in Bezug auf die gewebeabschnitte ab, die in IHC verwendet werden. Die Wurzel "Cyto-" in der Immunzytochemie unterstreicht den entscheidenden Unterschied zwischen ICC und IHC. Während IHC Teile des gesamten Gewebes verwendet, verwendet ICC Zellen, die aus Gewebe isoliert oder in Kultur gewachsen sind. Der Unterschied in den verwendeten Proben bedeutet, dass die Probenvorbereitung technisch zwischen IHC und ICC unterschiedlich ist, aber ansonsten sind die Protokolle für ICC und IHC identisch und man wird feststellen, dass die Begriffe häufig austauschbar verwendet werden.
Sowohl bei IHC als auch bei ICC werden Antikörper mit chemischen oder fluoreszierenden Tags, wie Peroxidase bzw. Rhodalin, verwendet, um die Verteilung jedes Antigens von Interesse durch spezifische Bindung des markierten Antikörpers an das Antigen zu visualisieren. Im Falle von IHC werden dünne Gewebescheiben auf einem Dia immobilisiert, um die Struktur des Gewebes zu erhalten, bevor es gebeizt wird, was die Visualisierung von Antigenen im Kontext ganzer Gewebe ermöglicht (Abbildung 1). Im Falle von ICC werden Zellen gleichmäßig auf einem Dia verteilt, bevor sie gefärbt werden, was die Visualisierung der Antigenverteilung innerhalb einzelner Zellen ermöglicht, aber nicht innerhalb der Struktur eines bestimmten Gewebes. Aufgrund der Ähnlichkeiten zwischen den beiden Protokollen wird sich dieses Protokoll auf IHC konzentrieren, um die zusätzlichen Komplexitäten der Probenvorbereitung im Zusammenhang mit IHC zu beheben.
Abbildung 1: Gliederung des IHC-Protokolls. Visuelle Umriss eines IHC-Protokolls für paraffinintegriertes Gewebe, das von einer Maus seziert wurde. Dieses Protokoll verwendet einen biotinylierten Sekundärantikörper und Strepavidin-HRP, um die Position der Antikörperbindung zu visualisieren. Andere Optionen, wie fluoreszierend markierte Antikörper, sind ebenfalls möglich. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Die erste wichtige Entscheidung bei der Durchführung von IHC ist, wie die Gewebeabschnitte vorbereitet werden, um die Struktur des Gewebes während des gesamten Färbeprozesses zu erhalten. Die beiden wichtigsten Optionen sind formalin-feste Abschnitte von Paraffin-eingebettetem Gewebe oder frische Abschnitte von gefrorenem Gewebe. Es gibt keine einfache Antwort darauf, welche Methode verwendet werden soll, da es davon abhängt, welche nachgelagerte Analyse durchgeführt wird. Formalin-Fixierung von Paraffin eingebetteten Geweben wird im Allgemeinen gedacht, um Gewebemorphologie für eine optimale Bildgebung besser zu erhalten, während das Einfrieren von frischem Gewebe die Proteinfunktion für nachfolgende Assays außerhalb von IHC erhalten kann. Darüber hinaus haben sich frisch gefrorene Gewebeabschnitte als besser für die Genexpressionsanalyse geeignet erwiesen (2). Eine dritte Überlegung ist, ob die Antikörper für Ihr Antigen von Interesse für feste oder gefrorene Gewebeabschnitte geeignet sind, da einige Antikörper nur für eine bestimmte Art von Abschnitt optimiert wurden und möglicherweise nicht für andere arbeiten. Schließlich muss auch festgestellt werden, wie lange sie die Gewebeabschnitte lagern müssen, da frische gefrorene Proben bei -80°C aufbewahrt werden müssen und nicht länger als ein Jahr dauern dürfen, während feste Abschnitte viel länger bei Raumtemperatur gelagert werden können. Dies sind einige der wichtigsten Überlegungen, um zu bestimmen, ob formalin-feste Abschnitte von Paraffin-eingebettetem Gewebe oder frische Abschnitte von gefrorenem Gewebe verwendet werden sollen. Letztlich, wenn man genug Gewebe hat, kann es am besten sein, nur einige von beiden zu haben.
In diesem Experiment machten wir uns daran, festzustellen, ob die Cyclin-D1-Expression in vergrößerten Milz aus einem spontanen Mausmodell der Lymphomentwicklung erhöht wurde. Splenic-Gewebeproben wurden zuerst entweder von Wildtyp-Mäusen, transgenen Mäusen ohne Lymphom oder transgenen Mäusen, die spontan Lymphom entwickelt haben, isoliert. Die Milzgewebeproben wurden in Paraformaldehyd fixiert, in Paraffin eingebettet, geschnitten, mit einem Maus-Anti-Cyclin-D1-Primärantikörper, gefolgt von einem Pferde-Anti-Maus-Sekundärantikörper, gebeizt und mit 3,3-Diaminobenzidin (DAB) entwickelt. Die Abschnitte wurden dann in Harris Hematoxylin Solution gegenstainiert und dann wurden die Abschnitte bei 20-facher Vergrößerung abgebildet.
Reagenzien
Paraffin-Eingebettete Abschnitte
Frische gefrorene Abschnitte
Färbung
1. Präparation von Zellen für die Immunzytochemie
2. Vorbereitung von Formalin-Fixed, Paraffin-Embedded-Abschnitten für die Färbung
Deparaffinisierung
Rehydration
Blockieren der aktivitäten der endogene Peroxidase
Antigen Retrieval
3. Vorbereitung von frisch gefrorenen, OTC-eingebetteten Abschnitten für die Färbung
4. Färbung
Blockieren
Primäre Antikörper-Inkubation
Sekundäre Antikörperinkubation
Farbentwicklung
Gegenfärbung (falls gewünscht)
austrocknung
Montage- und Deckbedeckungsapplikation
Mikroskopische Analyse
Immunzytochemie und Immunhistochemie sind Färbemethoden für ein Protein von Interesse in kultivierten Zellen bzw. Geweben. Das Grundprinzip beider verwandter Techniken besteht darin, spezifische Antikörper zu verwenden, die mit einem Detektionssystem markiert sind, um das Protein zu identifizieren und zu visualisieren und seine Position innerhalb der Zellen und Gewebe sowie die relativen Werte zu bestimmen. Der Prozess in beiden Experimenten beginnt mit der Probenvorbereitung.
Für die Immunzyztochemie, die speziell Protein- oder Antigenpositionen in Zellen visualisiert, umfasst dies drei Schritte. Der erste Schritt ist die Beschichtung, die die Kultivierung der Zellen in Wachstumsmedien auf einem Decksrutsch oder -schlitten, typischerweise, in den Brunnen einer Kulturplatte beinhaltet. Es folgt eine Fixierung, bei der den Zellen ein ausfällendes oder vernetzbares Mittel wie Paraformaldehyd zugesetzt wird, um die strukturelle Integrität der Proteine zu erhalten und zu verhindern, dass die Enzymaktivität sie abbaut. Der letzte Schritt ist die Permeabilisierung, bei der ein Reinigungsmittel hinzugefügt wird, um die Zellmembranen für die Färbung durchlässig zu machen.
Bei der Gegenmethode werden Immunhistochemie, Proteine oder Antigene in Geweben visualisiert und die Probenvorbereitung hat fünf Schritte. Zunächst wird das gesamte Gewebe fixiert, in der Regel mit Paraformaldehyd. Es folgt die Einbettung des Gewebes in einen Paraffinblock und dann das Schneiden dieses Blocks mit einer Maschine namens Mikrotome, um das Gewebe in dünne Scheiben zu schneiden, die auf Dias platziert werden können. Als nächstes werden die Dias einer Deparaffinierung oder Entfernung des Paraffins aus der Umgebung der Gewebescheibe unterzogen. Anschließend kann ein optionaler Antigen-Abrufschritt durchgeführt werden. Dies kann entweder mit Wärme oder Enzymen durchgeführt werden, um Epitope zu entlarven, die während der Fixierung vernetzt wurden, so dass sie für die Antikörperbindung zur Verfügung stehen. Nach der entsprechenden Probenvorbereitung wird der Zelle oder Gewebeprobe ein zielspezifischer Primärantikörper zugesetzt. Dieser primäre Antikörper sollte an das Protein von Interesse binden. Als Nächstes wird ein sekundärer Antikörper hinzugefügt, der den primären Antikörper erkennt und an ihn bindet. Dieser sekundäre Antikörper wird mit einem Enzym namens HRP konjugiert oder kann es binden. Wenn sein spezifisches Substrat DAB hinzugefügt wird, wandelt HRP dies in einen unlöslichen, braunen Niederschlag um. Dieser braune Fleck markiert die Position des Zielproteins. Die Dias sind auch mit Hämatoxylin befleckt, das die Kerne blau beschriftet und einen räumlichen Bezugspunkt zur Bestimmung der subzellulären Lokalisation bietet. Danach wird dem Dia Einbaumedien hinzugefügt, gefolgt von einem Abdeckschlupf, um die gebeizte Probe zu versiegeln und zu konservieren. Schließlich können die Dias auf einem Lichtmikroskop abgebildet werden.
In diesem Video beobachten Sie die Probenvorbereitungstechnik für plattierte Zellen und Gewebeabschnitte, gefolgt von der Immunfärbung der Gewebeabschnitte.
Zunächst müssen die Zellen von Interesse auf Deckellips sitzen. Dazu legen Sie bei der Arbeit in einer Gewebekulturhaube einzelne Deckel in die Brunnen einer 24-Well-Platte. Schließen Sie dann den Flügel und schalten Sie das UV-Licht ein, um die Abdeckungen mindestens 15 Minuten lang zu sterilisieren. Schalten Sie als Nächstes das UV-Licht aus. Um die von Interesse interessierten Zellen von einer konfluenten 10-Zentimeter-Schale zu heben, die Medien anzusaugen, kurz mit PBS zu waschen und trypsin für 2 Minuten in die Zellen zu geben. Tippen Sie dann auf die Seite der Platte, um sicherzustellen, dass sich die Zellen gelöst haben, und neutralisieren Sie das Trypsin mit Medien. Fügen Sie als Nächstes 0 hinzu. 5 ml der Zellsuspension in jedem Brunnen, stellen Sie sicher, dass die Abdeckungen abdeckung. Legen Sie die Platte in einen befeuchteten CO2-Inkubator und lassen Sie die Zellen bei 37 Grad Celsius wachsen, bis sie 50-70% konfluent sind.
Sobald die Zellen die optimale Konfluenz erreicht haben, aspirieren Sie das Kulturmedium aus jedem Brunnen und fixieren Sie die Zellen, indem Sie sie in in. 5 ml 4% Paraformaldehyd in 1X PBS für 20 Minuten bei Raumtemperatur verdünnt. Nach dem Entfernen des Fixativs spülen Sie die Zellen 1 ml 1X PBS über jeden Coverslip hinzu. Sofortiges Aspirieren der PBS, dann wiederholen Sie die Spülung 2 weitere Male für insgesamt 3 Wähbe.
Jetzt, permeablizieren Sie die Zellen durch Hinzufügen von 0,5 ml von 0,1% Triton X-100 in 1X PBS zu jedem Brunnen. Lassen Sie die Platte bei Raumtemperatur für 15 Minuten. Saugen Sie den Permeabilisierungspuffer ab und spülen Sie die Zellen dann, indem Sie jedem Bohrkörper 1 ml 1X PBS hinzufügen. Sofortiges Absaugen der PBS und wiederholen Sie die Spülung 2 weitere Male für insgesamt 3 Wähbe. Nun, da die Zellen auf den Decklippen fixiert und permeabilisiert sind, gehen Sie mit dem Färbungsverfahren für das folgende Immunhistochemie-Beispiel mit der Ausnahme, dass die Inkubationen innerhalb der Brunnen der 24-Well-Platte durchgeführt werden sollten und nicht direkt auf einer Gewebesektionsrutsche.
Um zu beginnen, erhalten Sie vorbereitete, formalinfixierte, paraffin-eingebettete Gewebeabschnitte. Entparaffinisieren Sie die Dias, indem Sie sie in ein Diaregal legen und sie dann vollständig in 250 ml 100% Xylol eintauchen. Lassen Sie die Dias für 5 Minuten im Xylol brüten. Dann entfernen Sie die Rutschen aus dem Behälter, wischen Sie sie mit einem Papiertuch ab und legen Sie sie in ein neues Xylolbad in einem frischen Behälter für weitere 5 Minuten.
Als nächstes rehydrieren Sie die Abschnitte in einer Reihe von abgestuften Ethanol-Lösungen, beginnend mit 100% Ethanol für 3 Minuten. Wischen Sie das Schiebegestell mit einem Papiertuch ab und übertragen Sie die Dias für weitere 3 Minuten in einen neuen Behälter mit 100 % Ethanol. Setzen Sie diesen Zyklus des Waschens, Trocknens mit einem Papiertuch und der Übertragung der Dias in ein neues Bad nach den angegebenen Ethanolkonzentrationen für die angegebene Zeit fort. Nach dem letzten Ethanolwaschen das Gestell mit einem Papiertuch abwischen und die Dias in 100 ml von 0,3 % Wasserstoffperoxid 30 Minuten bei Raumtemperatur bebrüten, um eine endogene Peroxidaseaktivität zu blockieren. Waschen Sie die Dias in 250 ml 1X PBS für 5 Minuten. Wiederholen Sie diese Wäsche in einem Behälter mit frischen 1X PBS für weitere 5 Minuten.
Als nächstes führen Sie antigen-retrieval durch, indem Sie die Dias in 250 ml IHC-Citratpuffer bei pH 6,0 eintauchen und 20 Minuten kochen. Fahren Sie dann mit dem Färbeprotokoll fort.
Um den Färbungsprozess für IHC zu beginnen, kreisen Sie die Abschnitte mit einem hydrophoben Stift, um den minimalen Bereich zu identifizieren, den der Puffer abdecken muss. Verwenden Sie dann eine Pipette, um 100 Mikroliter Sperrpuffer, der in diesem Experiment Pferdeserum in 1X PBS verdünnt wird, über den Abschnitt zu legen. Inkubieren Sie die Dias für 1 Stunde bei Raumtemperatur. Entfernen Sie anschließend den Sperrpuffer mit einer Pipette.
Als nächstes verdünnen Sie den primären Antikörper und den Sperrpuffer bei einer Verdünnung von 1:100, indem Sie 990 Mikroliter Pferdeserum in 1X PBS zu einer 1 verdünnt enden. 5 mL Eppendorf-Röhre, gefolgt von 10 Mikrolitern des Primärantikörpers. Fügen Sie 100 Mikroliter des verdünnten Primärantikörpers zu jedem Abschnitt hinzu und inkubieren Sie die Dias 30 Minuten lang bei Raumtemperatur. Wenn der Timer ertönt, entleeren Sie den primären Antikörper von jedem Dia, und waschen Sie ihn dann in 250 ml 1X PBS für 5 Minuten. Wiederholen Sie diese Wäsche noch einmal mit frischen 1X PBS.
Während die Dias in 1X PBS waschen, verdünnen Sie den sekundären Antikörper auf eine Verdünnung von 1:200, indem Sie 995 Mikroliter Blockierpuffer zu einem 1,5 ml Schlauch hinzufügen, gefolgt von 5 Mikrolitern des sekundären Antikörpers, der in diesem Fall biotinylierte Seimat-Anti-Maus-IGG ist. Fügen Sie 100 Mikroliter des verdünnten Sekundärantikörpers zu jedem Abschnitt hinzu und inkubieren Sie die Dias dann 30 Minuten lang bei Raumtemperatur. Nach 30 Minuten den sekundären Antikörper entfernen, indem Sie ihn von den Abschnitten abtropfen lassen, und waschen Sie die Dias dann 5 Minuten lang in 250 ml 1X PBS. Wiederholen Sie diese Wäsche mit frischen 1X PBS.
Fügen Sie nun 100 Mikroliter Avidin-Biotin-Komplex-Reagenz hinzu und bebrüten die Abschnitte im Dunkeln 30 Minuten bei Raumtemperatur. Als nächstes waschen Sie die Dias, indem Sie sie 5 Minuten lang in 250 ml 1X PBS eintauchen. Ähnlich wie bei früheren Waschschritten, wiederholen Sie diese Wäsche noch einmal mit frischen 1X PBS. Als nächstes entwickeln Sie die Dias, indem Sie die Abschnitte in 100 Mikroliter DAB für bis zu 5 Minuten inkubieren. Stoppen Sie die Entwicklung, indem Sie die Abschnitte 5 Minuten lang in 250 ml destilliertes Wasser eintauchen.
Jetzt können Dias auf Wunsch gegengefärbt werden. Dazu tauchen Sie die Dias kurz in 250 ml Harris Hematoxylin Solution ein. Spülen Sie den Gegenfleck ab, indem Sie die Rutschen in 250 ml destilliertem Wasser für 5 Minuten waschen. Wiederholen Sie diese Wäsche 1 weitere Zeit mit frischem destilliertem Wasser. Als nächstes dehydrieren Sie die Abschnitte. Um dies zu tun, zuerst inkubieren Sie die Dias in 95% Ethanol für 5 Minuten. Die Dias auf ein Papiertuch bumgen und für weitere 5 Minuten in einen neuen Behälter mit frischem 95% Ethanol geben. Setzen Sie den Zyklus des Waschens, Blotens mit einem Papiertuch und übertragen Sie die Rutschen in ein neues Bad, nach den angegebenen Lösungen für jeweils 5 Minuten.
Nach der letzten Inkubation die Dias mit einem Papiertuch bedrucken und dann einen Tropfen Montagemedien, wie Organo-Limonene Mount, zu den Dias hinzufügen. Platzieren Sie nun einen Deckelschlupf über die Abschnitte, wobei Sie darauf achten, keine Luftblasen einzufangen. Die Dias können nun unter dem Mikroskop zur Analyse beobachtet werden.
Um die gebeizten Abschnitte zu beobachten, verwenden Sie ein Standard-Lichtmikroskop, um den Fleck zu visualisieren, und eine Digitalkamera, um das Bild zu erfassen. In diesem speziellen Beispiel von IHC werden Milzgewebe von Wil-Typ und spontanen, doppeltransgenen oder DTG-Mäusen zur Untersuchung der Dyclin-D1-Expression bei Lymphomen verglichen. Die Gewebe wurden paraffin-eingebettet, geschnitten und mit Anticyclin-D1-Antikörpern gefärbt und mit 20-facher Vergrößerung abgebildet. Cyclin D1-exemittierte Zellen werden durch die rötlich-braune Farbe vor dem blauen Gewebehintergrund angezeigt. Vergleicht man die Färbeintensitäten zwischen den Bildern der verschiedenen Mäuse, so haben die nicht vergrößerten Milzen unabhängig vom Mausgenotyp relativ geringe Mengen an Cyclin-D1-Expression. Im Gegensatz dazu zeigt die vergrößerte Milz der DTG-Maus eine erhöhte rötlich-braune Färbung, die auf eine Korrelation zwischen Krebsentwicklung und Cyclin-D1-Expression in diesem Mausmodell hinweist.
Immunzytochemie und Immunhistochemie sind Färbemethoden für ein Protein von Interesse in kultivierten Zellen bzw. Geweben. Das Grundprinzip beider verwandter Techniken besteht darin, spezifische Antikörper zu verwenden, die mit einem Nachweissystem markiert sind, um das Protein zu identifizieren und zu visualisieren und seine Position in den Zellen und Geweben sowie die relativen Niveaus zu bestimmen. Der Prozess in beiden Experimenten beginnt mit der Probenvorbereitung.
Für die Immunzyktochemie, die gezielt Protein- oder Antigenpositionen in Zellen sichtbar macht, sind dies drei Schritte. Der erste Schritt ist die Beschichtung, bei der die Zellen in Wachstumsmedien auf einem Deckglas oder Objektträger kultiviert werden, typischerweise in den Vertiefungen einer Kulturplatte. Darauf folgt die Fixierung, bei der den Zellen ein Fällungs- oder Vernetzungsmittel wie Paraformaldehyd zugesetzt wird, um die strukturelle Integrität der Proteine zu erhalten und zu verhindern, dass die Enzymaktivität sie abbaut. Der letzte Schritt ist die Permeabilisierung, bei der ein Detergens hinzugefügt wird, um die Zellmembranen für die Färbung durchlässig zu machen.
Bei der Gegenstückmethode werden Immunhistochemie, Proteine oder Antigene in Geweben sichtbar gemacht und die Probenvorbereitung erfolgt in fünf Schritten. Zunächst wird das gesamte Gewebe fixiert, meist mit Paraformaldehyd. Darauf folgt die Einbettung des Gewebes in einen Paraffinblock und das anschließende Durchtrennen dieses Blocks mit einer Maschine, die als Mikrotom bezeichnet wird, um das Gewebe in dünne Scheiben zu schneiden, die auf Objektträger gelegt werden können. Als nächstes werden die Objektträger einer Entparaffinisierung unterzogen, d. h. der Entfernung des Paraffins aus der Umgebung der Gewebescheibe. Anschließend kann ein optionaler Schritt zur Antigengewinnung durchgeführt werden. Dies kann entweder mit Hitze oder Enzymen erfolgen, um Epitope zu demaskieren, die während der Fixierung vernetzt wurden, um sie für die Antikörperbindung verfügbar zu machen. Nach der entsprechenden Probenvorbereitung wird der Zell- oder Gewebeprobe ein zielspezifischer Primärantikörper zugesetzt. Dieser Primärantikörper sollte an das gewünschte Protein binden. Als nächstes wird ein Sekundärantikörper hinzugefügt, der den Primärantikörper detektiert und an ihn bindet. Dieser Sekundärantikörper ist an ein Enzym namens HRP konjugiert oder kann an dieses binden. Wenn sein spezifisches Substrat DAB hinzugefügt wird, wandelt HRP dieses in einen unlöslichen, braunen Niederschlag um. Dieser braune Fleck markiert die Position des Zielproteins. Die Objektträger sind ebenfalls mit Hämatoxylin gefärbt, das die Zellkerne blau markiert und einen räumlichen Referenzpunkt für die Bestimmung der subzellulären Lokalisation bietet. Danach wird der Objektträger mit Eindeckmedien befüllt, gefolgt von einem Deckglas, um die gefärbte Probe zu versiegeln und zu konservieren. Abschließend können die Objektträger auf einem Lichtmikroskop abgebildet werden.
In diesem Video sehen Sie die Probenvorbereitungstechnik für plattierte Zellen und Gewebeschnitte, gefolgt von der Immunfärbung der Gewebeschnitte.
Zuerst müssen die interessierenden Zellen auf Deckgläser gesetzt werden. Zu diesem Zweck werden in einer Gewebekulturhaube einzelne Deckgläser in die Vertiefungen einer 24-Well-Platte gelegt. Schließen Sie dann den Flügel und schalten Sie das UV-Licht ein, um die Deckgläser mindestens 15 Minuten lang zu sterilisieren. Schalten Sie anschließend das UV-Licht aus. Um die interessierenden Zellen aus einer konfluenten 10-Zentimeter-Schale zu heben, aspirieren Sie das Medium, waschen Sie es kurz mit PBS und fügen Sie den Zellen 2 Minuten lang Trypsin hinzu. Klopfen Sie dann auf die Seite der Platte, um sicherzustellen, dass sich die Zellen abgelöst haben, und neutralisieren Sie das Trypsin mit Medien. Addieren Sie als Nächstes 0. 5 ml der Zellsuspension in jede Vertiefung geben und dabei darauf achten, dass die Deckgläser bedeckt sind. Stellen Sie die Platte in einen befeuchteten CO2-Inkubator und lassen Sie die Zellen bei 37 Grad Celsius wachsen, bis sie zu 50-70 % zusammenfließen.
Sobald die Zellen die optimale Konfluenz erreicht haben, aspirieren Sie das Kulturmedium aus jeder Vertiefung und fixieren Sie die Zellen, indem Sie sie in inkubieren. 5 mL 4% Paraformaldehyd verdünnt in 1X PBS für 20 Minuten bei Raumtemperatur. Spülen Sie die Zellen nach dem Entfernen des Fixiermittels aus und fügen Sie 1 ml 1X PBS über jedes Deckglas hinzu. Saugen Sie das PBS sofort ab und wiederholen Sie das Spülen noch 2 Mal für insgesamt 3 Wäschen.
Permeablizieren Sie nun die Zellen, indem Sie 0,5 ml 0,1 % Triton X-100 in 1X PBS in jede Vertiefung geben. Den Teller 15 Minuten bei Raumtemperatur stehen lassen. Aspirieren Sie den Permeabilisierungspuffer und spülen Sie dann die Zellen, indem Sie 1 ml 1X PBS in jede Vertiefung geben. Saugen Sie das PBS sofort ab und wiederholen Sie die Spülung noch 2 Mal für insgesamt 3 Wäschen. Nachdem nun die Zellen auf den Deckgläsern fixiert und permeabilisiert sind, fahren Sie mit dem Färbeverfahren fort, das für das folgende immunhistochemische Beispiel demonstriert wurde, mit der Ausnahme, dass die Inkubationen in den Vertiefungen der 24-Well-Platte und nicht direkt auf einem Gewebeschnittobjektträger durchgeführt werden sollten.
Zu Beginn erhalten Sie vorbereitete, formalinfixierte, in Paraffin eingebettete Gewebeschnitte. Entparaffinieren Sie die Objektträger, indem Sie sie in ein Objektträgergestell legen und dann vollständig in 250 mL 100% Xylol eintauchen. Lassen Sie die Objektträger 5 Minuten lang im Xylol inkubieren. Nehmen Sie dann die Objektträger aus dem Behälter, wischen Sie sie mit einem Papiertuch ab und legen Sie sie für weitere 5 Minuten in ein neues Xylolbad in einem frischen Behälter.
Als nächstes rehydrieren Sie die Abschnitte in einer Reihe von abgestuften Ethanollösungen, beginnend mit 100 % Ethanol für 3 Minuten. Wischen Sie das Objektträgergestell mit einem Papiertuch ab und geben Sie die Objektträger für weitere 3 Minuten in einen neuen Behälter mit 100 % Ethanol. Setzen Sie diesen Waschzyklus fort, trocknen Sie sie mit einem Papiertuch und übertragen Sie die Objektträger in ein neues Bad mit den angegebenen Ethanolkonzentrationen für die angegebene Zeit. Wischen Sie nach der abschließenden Ethanolwäsche den Rost mit einem Papiertuch ab und inkubieren Sie die Objektträger 30 Minuten lang bei Raumtemperatur in 100 ml 0,3 % Wasserstoffperoxid, um jegliche endogene Peroxidaseaktivität zu blockieren. Waschen Sie die Objektträger 5 Minuten lang in 250 ml 1X PBS. Wiederholen Sie diese Wäsche in einem Behälter mit frischem 1X PBS für weitere 5 Minuten.
Führen Sie als Nächstes eine Antigengewinnung durch, indem Sie die Objektträger in 250 ml IHC-Citratpuffer bei einem pH-Wert von 6,0 tauchen und 20 Minuten lang kochen. Fahren Sie dann mit dem Färbeprotokoll fort.
Um den Färbeprozess für IHC zu starten, kreisen Sie die Abschnitte mit einem hydrophoben Stift ein, um den minimalen Bereich zu identifizieren, den der Puffer abdecken muss. Verwenden Sie dann eine Pipette, um 100 Mikroliter Blockierungspuffer, der in diesem Experiment Pferdeserum ist, das in 1X PBS verdünnt ist, auf den Schnitt zu geben. Inkubieren Sie die Objektträger 1 Stunde lang bei Raumtemperatur. Entfernen Sie anschließend den Blockierungspuffer mit einer Pipette.
Als nächstes verdünnen Sie den primären Antikörper und den Blockierungspuffer in einer Verdünnung von 1:100, indem Sie 990 Mikroliter Pferdeserum, verdünnt in 1X PBS, zu einer 1 hinzufügen. 5 mL Eppendorf-Röhrchen, gefolgt von 10 Mikrolitern des primären Antikörpers. Geben Sie 100 Mikroliter des verdünnten Primärantikörpers in jeden Abschnitt und inkubieren Sie die Objektträger 30 Minuten lang bei Raumtemperatur. Wenn der Timer ertönt, lassen Sie den primären Antikörper von jedem Objektträger ab und waschen Sie ihn dann 5 Minuten lang in 250 ml 1X PBS. Wiederholen Sie diese Wäsche noch einmal mit frischem 1X PBS.
Während die Objektträger in 1X PBS gewaschen werden, verdünnen Sie den Sekundärantikörper auf eine Verdünnung von 1:200, indem Sie 995 Mikroliter Blockierungspuffer in ein 1,5-ml-Röhrchen geben, gefolgt von 5 Mikrolitern des Sekundärantikörpers, bei dem es sich in diesem Fall um biotinyliertes Pferde-Anti-Maus-IGG handelt. Geben Sie 100 Mikroliter des verdünnten Sekundärantikörpers in jeden Abschnitt und inkubieren Sie die Objektträger dann 30 Minuten lang bei Raumtemperatur. Entfernen Sie nach 30 Minuten den sekundären Antikörper, indem Sie ihn von den Abschnitten abtropfen lassen, und waschen Sie die Objektträger dann 5 Minuten lang in 250 ml 1X PBS. Wiederholen Sie diese Wäsche mit frischem 1X PBS.
Fügen Sie nun 100 Mikroliter Reagenz des Avidin-Biotin-Komplexes hinzu und inkubieren Sie die Schnitte 30 Minuten lang im Dunkeln bei Raumtemperatur. Waschen Sie anschließend die Objektträger, indem Sie sie 5 Minuten lang in 250 ml 1X PBS tauchen. Wiederholen Sie ähnlich wie bei den vorherigen Waschschritten diese Wäsche noch einmal mit frischem 1X PBS. Entwickeln Sie anschließend die Objektträger, indem Sie die Abschnitte bis zu 5 Minuten lang in 100 Mikrolitern DAB inkubieren. Stoppen Sie die Entwicklung, indem Sie die Abschnitte 5 Minuten lang in 250 ml destilliertes Wasser tauchen.
Nun können die Objektträger auf Wunsch gegengefärbt werden. Tauchen Sie dazu die Objektträger kurz in 250 mL Harris Hämatoxylin-Lösung. Spülen Sie den Gegenfleck ab, indem Sie die Objektträger 5 Minuten lang in 250 ml destilliertem Wasser waschen. Wiederholen Sie diese Wäsche noch 1 Mal mit frischem destilliertem Wasser. Als nächstes dehydrieren Sie die Abschnitte. Inkubieren Sie dazu die Objektträger zunächst 5 Minuten lang in 95%igem Ethanol. Tupfen Sie die Objektträger auf ein Papiertuch und geben Sie sie für weitere 5 Minuten in einen neuen Behälter mit frischem 95%igem Ethanol. Setzen Sie den Waschgang fort, tupfen Sie sie mit einem Papiertuch ab und übertragen Sie die Objektträger in ein neues Bad, wobei Sie jeweils 5 Minuten lang den angegebenen Lösungen folgen.
Tupfen Sie die Objektträger nach der letzten Inkubation mit einem Papiertuch ab und geben Sie dann einen Tropfen Einbettmedien, wie z. B. Organo-Limonen-Passepartout, auf die Objektträger. Legen Sie nun ein Deckglas über die Abschnitte und achten Sie darauf, dass keine Luftblasen eingeschlossen werden. Die Objektträger sind nun bereit, um zur Analyse unter einem Mikroskop betrachtet zu werden.
Um die gefärbten Abschnitte zu betrachten, verwenden Sie ein Standardlichtmikroskop, um den Fleck zu visualisieren, und eine Digitalkamera, um das Bild aufzunehmen. In diesem speziellen Beispiel von IHC werden Milzgewebe von Wildtyp- und spontanen, doppeltransgenen oder DTG-Mäusen verglichen, um die Dyclin D1-Expression bei Lymphomen zu untersuchen. Die Gewebe wurden in Paraffin eingebettet, geschnitten und mit Anticyclin-D1-Antikörpern gefärbt und mit 20-facher Vergrößerung abgebildet. Cyclin D1-exprimierende Zellen sind durch die rötlich-braune Farbe vor dem blauen Gewebehintergrund gekennzeichnet. Vergleicht man die Färbeintensitäten zwischen den Bildern der verschiedenen Mäuse, so weist die nicht vergrößerte Milz unabhängig vom Mausgenotyp relativ geringe Mengen an Cyclin D1-Expression auf. Im Gegensatz dazu zeigt die vergrößerte Milz der DTG-Maus eine erhöhte rötlich-braune Färbung, was auf eine Korrelation zwischen der Krebsentstehung und der Expression von Cyclin D1 in diesem Mausmodell hinweist.
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