Immunhistochemie und Immunzytochemie: Gewebebildgebung mittels Lichtmikroskopie

Immunzytochemie und Immunhistochemie sind Färbemethoden für ein Protein von Interesse in kultivierten Zellen bzw. Geweben. Das Grundprinzip beider verwandter Techniken besteht darin, spezifische Antikörper zu verwenden, die mit einem Nachweissystem markiert sind, um das Protein zu identifizieren und zu visualisieren und seine Position in den Zellen und Geweben sowie die relativen Niveaus zu bestimmen. Der Prozess in beiden Experimenten beginnt mit der Probenvorbereitung.

Für die Immunzyktochemie, die gezielt Protein- oder Antigenpositionen in Zellen sichtbar macht, sind dies drei Schritte. Der erste Schritt ist die Beschichtung, bei der die Zellen in Wachstumsmedien auf einem Deckglas oder Objektträger kultiviert werden, typischerweise in den Vertiefungen einer Kulturplatte. Darauf folgt die Fixierung, bei der den Zellen ein Fällungs- oder Vernetzungsmittel wie Paraformaldehyd zugesetzt wird, um die strukturelle Integrität der Proteine zu erhalten und zu verhindern, dass die Enzymaktivität sie abbaut. Der letzte Schritt ist die Permeabilisierung, bei der ein Detergens hinzugefügt wird, um die Zellmembranen für die Färbung durchlässig zu machen.

Bei der Gegenstückmethode werden Immunhistochemie, Proteine oder Antigene in Geweben sichtbar gemacht und die Probenvorbereitung erfolgt in fünf Schritten. Zunächst wird das gesamte Gewebe fixiert, meist mit Paraformaldehyd. Darauf folgt die Einbettung des Gewebes in einen Paraffinblock und das anschließende Durchtrennen dieses Blocks mit einer Maschine, die als Mikrotom bezeichnet wird, um das Gewebe in dünne Scheiben zu schneiden, die auf Objektträger gelegt werden können. Als nächstes werden die Objektträger einer Entparaffinisierung unterzogen, d. h. der Entfernung des Paraffins aus der Umgebung der Gewebescheibe. Anschließend kann ein optionaler Schritt zur Antigengewinnung durchgeführt werden. Dies kann entweder mit Hitze oder Enzymen erfolgen, um Epitope zu demaskieren, die während der Fixierung vernetzt wurden, um sie für die Antikörperbindung verfügbar zu machen. Nach der entsprechenden Probenvorbereitung wird der Zell- oder Gewebeprobe ein zielspezifischer Primärantikörper zugesetzt. Dieser Primärantikörper sollte an das gewünschte Protein binden. Als nächstes wird ein Sekundärantikörper hinzugefügt, der den Primärantikörper detektiert und an ihn bindet. Dieser Sekundärantikörper ist an ein Enzym namens HRP konjugiert oder kann an dieses binden. Wenn sein spezifisches Substrat DAB hinzugefügt wird, wandelt HRP dieses in einen unlöslichen, braunen Niederschlag um. Dieser braune Fleck markiert die Position des Zielproteins. Die Objektträger sind ebenfalls mit Hämatoxylin gefärbt, das die Zellkerne blau markiert und einen räumlichen Referenzpunkt für die Bestimmung der subzellulären Lokalisation bietet. Danach wird der Objektträger mit Eindeckmedien befüllt, gefolgt von einem Deckglas, um die gefärbte Probe zu versiegeln und zu konservieren. Abschließend können die Objektträger auf einem Lichtmikroskop abgebildet werden.

In diesem Video sehen Sie die Probenvorbereitungstechnik für plattierte Zellen und Gewebeschnitte, gefolgt von der Immunfärbung der Gewebeschnitte.

Zuerst müssen die interessierenden Zellen auf Deckgläser gesetzt werden. Zu diesem Zweck werden in einer Gewebekulturhaube einzelne Deckgläser in die Vertiefungen einer 24-Well-Platte gelegt. Schließen Sie dann den Flügel und schalten Sie das UV-Licht ein, um die Deckgläser mindestens 15 Minuten lang zu sterilisieren. Schalten Sie anschließend das UV-Licht aus. Um die interessierenden Zellen aus einer konfluenten 10-Zentimeter-Schale zu heben, aspirieren Sie das Medium, waschen Sie es kurz mit PBS und fügen Sie den Zellen 2 Minuten lang Trypsin hinzu. Klopfen Sie dann auf die Seite der Platte, um sicherzustellen, dass sich die Zellen abgelöst haben, und neutralisieren Sie das Trypsin mit Medien. Addieren Sie als Nächstes 0. 5 ml der Zellsuspension in jede Vertiefung geben und dabei darauf achten, dass die Deckgläser bedeckt sind. Stellen Sie die Platte in einen befeuchteten CO2-Inkubator und lassen Sie die Zellen bei 37 Grad Celsius wachsen, bis sie zu 50-70 % zusammenfließen.

Sobald die Zellen die optimale Konfluenz erreicht haben, aspirieren Sie das Kulturmedium aus jeder Vertiefung und fixieren Sie die Zellen, indem Sie sie in inkubieren. 5 mL 4% Paraformaldehyd verdünnt in 1X PBS für 20 Minuten bei Raumtemperatur. Spülen Sie die Zellen nach dem Entfernen des Fixiermittels aus und fügen Sie 1 ml 1X PBS über jedes Deckglas hinzu. Saugen Sie das PBS sofort ab und wiederholen Sie das Spülen noch 2 Mal für insgesamt 3 Wäschen.

Permeablizieren Sie nun die Zellen, indem Sie 0,5 ml 0,1 % Triton X-100 in 1X PBS in jede Vertiefung geben. Den Teller 15 Minuten bei Raumtemperatur stehen lassen. Aspirieren Sie den Permeabilisierungspuffer und spülen Sie dann die Zellen, indem Sie 1 ml 1X PBS in jede Vertiefung geben. Saugen Sie das PBS sofort ab und wiederholen Sie die Spülung noch 2 Mal für insgesamt 3 Wäschen. Nachdem nun die Zellen auf den Deckgläsern fixiert und permeabilisiert sind, fahren Sie mit dem Färbeverfahren fort, das für das folgende immunhistochemische Beispiel demonstriert wurde, mit der Ausnahme, dass die Inkubationen in den Vertiefungen der 24-Well-Platte und nicht direkt auf einem Gewebeschnittobjektträger durchgeführt werden sollten.

Zu Beginn erhalten Sie vorbereitete, formalinfixierte, in Paraffin eingebettete Gewebeschnitte. Entparaffinieren Sie die Objektträger, indem Sie sie in ein Objektträgergestell legen und dann vollständig in 250 mL 100% Xylol eintauchen. Lassen Sie die Objektträger 5 Minuten lang im Xylol inkubieren. Nehmen Sie dann die Objektträger aus dem Behälter, wischen Sie sie mit einem Papiertuch ab und legen Sie sie für weitere 5 Minuten in ein neues Xylolbad in einem frischen Behälter.

Als nächstes rehydrieren Sie die Abschnitte in einer Reihe von abgestuften Ethanollösungen, beginnend mit 100 % Ethanol für 3 Minuten. Wischen Sie das Objektträgergestell mit einem Papiertuch ab und geben Sie die Objektträger für weitere 3 Minuten in einen neuen Behälter mit 100 % Ethanol. Setzen Sie diesen Waschzyklus fort, trocknen Sie sie mit einem Papiertuch und übertragen Sie die Objektträger in ein neues Bad mit den angegebenen Ethanolkonzentrationen für die angegebene Zeit. Wischen Sie nach der abschließenden Ethanolwäsche den Rost mit einem Papiertuch ab und inkubieren Sie die Objektträger 30 Minuten lang bei Raumtemperatur in 100 ml 0,3 % Wasserstoffperoxid, um jegliche endogene Peroxidaseaktivität zu blockieren. Waschen Sie die Objektträger 5 Minuten lang in 250 ml 1X PBS. Wiederholen Sie diese Wäsche in einem Behälter mit frischem 1X PBS für weitere 5 Minuten.

Führen Sie als Nächstes eine Antigengewinnung durch, indem Sie die Objektträger in 250 ml IHC-Citratpuffer bei einem pH-Wert von 6,0 tauchen und 20 Minuten lang kochen. Fahren Sie dann mit dem Färbeprotokoll fort.

Um den Färbeprozess für IHC zu starten, kreisen Sie die Abschnitte mit einem hydrophoben Stift ein, um den minimalen Bereich zu identifizieren, den der Puffer abdecken muss. Verwenden Sie dann eine Pipette, um 100 Mikroliter Blockierungspuffer, der in diesem Experiment Pferdeserum ist, das in 1X PBS verdünnt ist, auf den Schnitt zu geben. Inkubieren Sie die Objektträger 1 Stunde lang bei Raumtemperatur. Entfernen Sie anschließend den Blockierungspuffer mit einer Pipette.

Als nächstes verdünnen Sie den primären Antikörper und den Blockierungspuffer in einer Verdünnung von 1:100, indem Sie 990 Mikroliter Pferdeserum, verdünnt in 1X PBS, zu einer 1 hinzufügen. 5 mL Eppendorf-Röhrchen, gefolgt von 10 Mikrolitern des primären Antikörpers. Geben Sie 100 Mikroliter des verdünnten Primärantikörpers in jeden Abschnitt und inkubieren Sie die Objektträger 30 Minuten lang bei Raumtemperatur. Wenn der Timer ertönt, lassen Sie den primären Antikörper von jedem Objektträger ab und waschen Sie ihn dann 5 Minuten lang in 250 ml 1X PBS. Wiederholen Sie diese Wäsche noch einmal mit frischem 1X PBS.

Während die Objektträger in 1X PBS gewaschen werden, verdünnen Sie den Sekundärantikörper auf eine Verdünnung von 1:200, indem Sie 995 Mikroliter Blockierungspuffer in ein 1,5-ml-Röhrchen geben, gefolgt von 5 Mikrolitern des Sekundärantikörpers, bei dem es sich in diesem Fall um biotinyliertes Pferde-Anti-Maus-IGG handelt. Geben Sie 100 Mikroliter des verdünnten Sekundärantikörpers in jeden Abschnitt und inkubieren Sie die Objektträger dann 30 Minuten lang bei Raumtemperatur. Entfernen Sie nach 30 Minuten den sekundären Antikörper, indem Sie ihn von den Abschnitten abtropfen lassen, und waschen Sie die Objektträger dann 5 Minuten lang in 250 ml 1X PBS. Wiederholen Sie diese Wäsche mit frischem 1X PBS.

Fügen Sie nun 100 Mikroliter Reagenz des Avidin-Biotin-Komplexes hinzu und inkubieren Sie die Schnitte 30 Minuten lang im Dunkeln bei Raumtemperatur. Waschen Sie anschließend die Objektträger, indem Sie sie 5 Minuten lang in 250 ml 1X PBS tauchen. Wiederholen Sie ähnlich wie bei den vorherigen Waschschritten diese Wäsche noch einmal mit frischem 1X PBS. Entwickeln Sie anschließend die Objektträger, indem Sie die Abschnitte bis zu 5 Minuten lang in 100 Mikrolitern DAB inkubieren. Stoppen Sie die Entwicklung, indem Sie die Abschnitte 5 Minuten lang in 250 ml destilliertes Wasser tauchen.

Nun können die Objektträger auf Wunsch gegengefärbt werden. Tauchen Sie dazu die Objektträger kurz in 250 mL Harris Hämatoxylin-Lösung. Spülen Sie den Gegenfleck ab, indem Sie die Objektträger 5 Minuten lang in 250 ml destilliertem Wasser waschen. Wiederholen Sie diese Wäsche noch 1 Mal mit frischem destilliertem Wasser. Als nächstes dehydrieren Sie die Abschnitte. Inkubieren Sie dazu die Objektträger zunächst 5 Minuten lang in 95%igem Ethanol. Tupfen Sie die Objektträger auf ein Papiertuch und geben Sie sie für weitere 5 Minuten in einen neuen Behälter mit frischem 95%igem Ethanol. Setzen Sie den Waschgang fort, tupfen Sie sie mit einem Papiertuch ab und übertragen Sie die Objektträger in ein neues Bad, wobei Sie jeweils 5 Minuten lang den angegebenen Lösungen folgen.

Tupfen Sie die Objektträger nach der letzten Inkubation mit einem Papiertuch ab und geben Sie dann einen Tropfen Einbettmedien, wie z. B. Organo-Limonen-Passepartout, auf die Objektträger. Legen Sie nun ein Deckglas über die Abschnitte und achten Sie darauf, dass keine Luftblasen eingeschlossen werden. Die Objektträger sind nun bereit, um zur Analyse unter einem Mikroskop betrachtet zu werden.

Um die gefärbten Abschnitte zu betrachten, verwenden Sie ein Standardlichtmikroskop, um den Fleck zu visualisieren, und eine Digitalkamera, um das Bild aufzunehmen. In diesem speziellen Beispiel von IHC werden Milzgewebe von Wildtyp- und spontanen, doppeltransgenen oder DTG-Mäusen verglichen, um die Dyclin D1-Expression bei Lymphomen zu untersuchen. Die Gewebe wurden in Paraffin eingebettet, geschnitten und mit Anticyclin-D1-Antikörpern gefärbt und mit 20-facher Vergrößerung abgebildet. Cyclin D1-exprimierende Zellen sind durch die rötlich-braune Farbe vor dem blauen Gewebehintergrund gekennzeichnet. Vergleicht man die Färbeintensitäten zwischen den Bildern der verschiedenen Mäuse, so weist die nicht vergrößerte Milz unabhängig vom Mausgenotyp relativ geringe Mengen an Cyclin D1-Expression auf. Im Gegensatz dazu zeigt die vergrößerte Milz der DTG-Maus eine erhöhte rötlich-braune Färbung, was auf eine Korrelation zwischen der Krebsentstehung und der Expression von Cyclin D1 in diesem Mausmodell hinweist.