Konfokale Fluoreszenzmikroskopie: Eine Technik zur Bestimmung der Lokalisierung von Proteinen in Maus-Fibroblasten

Die konfokale Fluoreszenzmikroskopie ist ein spezialisiertes bildgebendes Verfahren zur Lokalisierung eines Proteins oder Antigens von Interesse in einer Zell- oder Gewebeprobe, indem das Antigen mit einem Antikörper-konjugierten Fluoreszenzfarbstoff markiert und das Fluoreszenzsignal nachgewiesen wird. Sie bietet eine höhere räumliche Auflösung als die Weitfeld-Fluoreszenzmikroskopie, mit Hilfe von zwei Lochblenden, die in den Brennebenen der Objektivlinse platziert sind, was ihr den Namen konfokal gibt. Es ermöglicht dem Anwender, die Färbung auf subzellulärer Ebene zu visualisieren, wie z.B. die Unterscheidung zwischen Oberflächenmembranfärbung und intrazellulärer Färbung.

Ein konfokales Mikroskop folgt einem ähnlichen Grundprinzip wie ein klassisches Fluoreszenzmikroskop. Der Strahl einer Lichtquelle, in der Regel ein konfokaler Laser, wird von einem dichroitischen Spiegel reflektiert und durch eine Objektivlinse auf die Probe fokussiert. Dieses Licht regt die Fluorophore an, eine andere Wellenlänge zu emittieren, die durch die Objektivlinse und den dichroitischen Spiegel zurück zu einer Kamera oder einem Okular wandert.

Die erhöhte Auflösung eines konfokalen Mikroskops ist hauptsächlich auf das Vorhandensein von zwei Lochblenden zurückzuführen, bei denen es sich um sehr kleine Löcher handelt, durch die Licht auf dem Anregungs- und Emissionslichtweg dringt. Die Lochblenden sind strategisch in der Brennebene der Objektivlinse platziert. Wechseln wir nun zu einem Schema der Mikroskopanordnung in der Seitenansicht, um den Strahlengang zu überprüfen. Nach dem Durchgang durch die Anregungslochblende hat der Anregungslichtstrahl den Effekt, dass er von einem Brennpunkt ausgeht, was es der Objektivlinse ermöglicht, das Licht dann ebenfalls auf einen Punkt auf der Probe zu fokussieren. Der Emissionsstrahl von diesem Brennpunkt konvergiert an der Emissionslochblende, wodurch er durchgelassen werden kann. Während der Anregung werden nun auch Fluorophore innerhalb des Strahlengangs, oberhalb und unterhalb des Brennpunkts, leicht angeregt. Während das vom Brennpunkt ausgehende Emissionslicht durch die Lochblende fällt, konvergieren die Emissionen der unscharfen Punkte vor oder nach der Lochblende und werden daher blockiert, was zu einer verringerten Hintergrundfluoreszenz führt.

Der Anregungs-Emissions-Detektionszyklus muss für jeden Bildpunkt in der interessierenden Region wiederholt werden, was auf verschiedene Arten erfolgen kann. Beim konfokalen Laserscanning werden beispielsweise Galvanometer-Scanning-Spiegel verwendet, die das Anregungslicht in verschiedenen Winkeln ablenken. Daher wird der Lichtstrahl über die Probe in der XY-Ebene geschwenkt. Bei der konfokalen Spinning-Scheibe wird eine Scheibe mit einer Anordnung von Lochblenden verwendet, die sich dreht, um die Anordnung der Lochblenden zu verschieben. Auf diese Weise können jedes Mal mehrere kleine Bildpunkte in der Probe beleuchtet werden, die beim Drehen der Scheibe allmählich den gesamten Bereich abdecken. Infolge der Lochblenden stellt das XY-Bild am Detektor eine schmale Z-Ebene dar. Daher können Bilder aus einer Reihe aufeinanderfolgender Z-Ebenen gesammelt werden, die häufig als Z-Stapel bezeichnet werden. Aus diesen Bildern kann eine entsprechende Software eine 3D-Darstellung des Fluoreszenzsignalmusters in der Probe erzeugen.

In diesem Protokoll beobachten Sie die Immunfärbung von Mausfibroblasten, gefolgt von der Bildgebung an einem konfokalen Mikroskop, um ein Zelloberflächenprotein und ein lysosomales Protein unterschiedlich sichtbar zu machen.

Zu Beginn resuspendieren Sie die interessierenden Zellen mit sterilen Techniken in 500 Mikrolitern Wachstumsmedium pro Vertiefung und säen sie dann in die Vertiefungen eines Objektträgers mit vier Vertiefungen. Hier verwenden wir Maus-Fibroblasten, die transfiziert wurden, um das Antigen-präsentierende Molekül CD1d zu exprimieren. Damit die Zellen am Glas haften können, legen Sie den Objektträger in einen 5%igen Kohlendioxid-Inkubator bei 37 Grad Celsius und inkubieren Sie ihn über Nacht. Saugen Sie morgens das Medium aus jeder Vertiefung an und waschen Sie die Zellen dann einmal einige Sekunden lang mit 500 Mikrolitern PBS.

Um die Zellen zu fixieren, geben Sie 500 Mikroliter 1%ige Paraformaldehydlösung in jede Vertiefung und inkubieren Sie sie 15 Minuten lang bei Raumtemperatur. Sammeln Sie nach der Inkubation das Paraformaldehyd in einem geeigneten Behälter für gefährliche flüssige Abfälle und entfernen Sie dann alle Reste des Fixiermittels, indem Sie die Zellen einige Sekunden lang dreimal mit PBS waschen.

Um das Eindringen von Antikörpern in die Zellen zu ermöglichen, geben Sie 500 Mikroliter Permeabilisierungspuffer in jede Vertiefung und inkubieren Sie 15 Minuten lang bei Raumtemperatur auf der Bank. Waschen Sie die Zellen nach der Permeabilisierung dreimal kurz mit 500 Mikrolitern PBS. Geben Sie anschließend 500 Mikroliter Blockierungspuffer in jede Vertiefung und inkubieren Sie eine Stunde lang bei vier Grad Celsius, um eine unspezifische Antikörperbindung zu verhindern.

Bereiten Sie die primären Antikörper, Anti-CD1d und Anti-LAMP-1, in geeigneten Arbeitskonzentrationen vor. Aspirieren Sie dann den Puffer aus den Vertiefungen und bedecken Sie die Zellen in jeder Vertiefung mit 500 Mikrolitern verdünnter Primärantikörperlösung und inkubieren Sie den Objektträger dann über Nacht auf einer ebenen Fläche bei vier Grad Celsius. Am nächsten Morgen werden die Sekundärantikörper, in diesem Fall ein Anti-Maus- und ein Anti-Ratten-Antikörper mit unterschiedlichen Fluoreszenz-Tags, in einem Blockpuffer auf geeignete Arbeitskonzentrationen verdünnt. Als nächstes aspirieren Sie die primäre Antikörperlösung aus den Vertiefungen und waschen die Zellen dann viermal mit 500 Mikrolitern PBS. Geben Sie dann 500 Mikroliter der verdünnten Sekundärantikörperlösung in jede Vertiefung und inkubieren Sie eine Stunde lang bei Raumtemperatur im Dunkeln. Nach der Inkubation aspirieren Sie die Sekundärantikörperlösung und waschen Sie die Vertiefungen viermal mit 500 Mikrolitern PBS, um alle ungebundenen Sekundärantikörper zu entfernen.

Um die Proben nach der letzten Wäsche zu montieren, lösen Sie die Kammern vorsichtig vom Objektträger und entfernen Sie sie. Um das restliche PBS zu entfernen, halten Sie den Objektträger schräg über ein empfindliches Tuch und entfernen Sie die Flüssigkeit von den Rändern, ohne die Zellen zu berühren. Sobald das überschüssige PBS entfernt ist, geben Sie einen Tropfen Antifading-Eindeckmedium, das den Kernfleck DAPI enthält, auf jeden Zellabschnitt. Nehmen Sie als Nächstes ein 20 x 60 Millimeter großes Deckglas und senken Sie das Deckglas mit nur den Fingerspitzen langsam an beiden Kanten ab, wobei Sie darauf achten, dass sich keine Blasen über den Zellen bilden. Wischen Sie überschüssiges Montagemedium auf den Objektträgern mit einem zarten Arbeitstuch ab und lagern Sie die Objektträger bis zu einer Woche lang im Dunkeln bei Raumtemperatur.

Um mit dem Imaging der Zellen zu beginnen, klicken Sie zunächst auf das NIS-Software-Symbol auf dem Desktop. Sobald Sie sich im Steuerungsfenster befinden, klicken Sie oben auf die Registerkarte TiPad und wählen Sie das gewünschte Objektiv für die Bildgebung aus. Legen Sie dann den Objektträger mit den Zellen auf den Tisch und zentrieren Sie ihn unter der Linse. Richten Sie anschließend auf der Registerkarte A1plus Compact GUI neben der Registerkarte TiPad die Laser ein, die für die verwendeten Fluorophore geeignet sind. Klicken Sie auf das Zahnradsymbol, um das Menü mit den Farb- und Spektraleinstellungen zu öffnen. Sobald das Menü für die Farb- und Spektraleinstellungen geöffnet ist, wählen Sie die gewünschten Kanäle aus und stellen Sie den Laser für jeden Kanal ein. Wählen Sie dann die entsprechenden Emissionen im Dropdown-Menü unter dem ersten dichroitischen Spiegel aus. Klicken Sie anschließend im A1plus Compact GUI-Fenster auf Ch.Series, um die Linienkanalserie einzurichten, die festlegt, ob die verwendeten Laser gleichzeitig oder nacheinander auf die Probe feuern.

Starten Sie danach den Scanvorgang, indem Sie auf das Pfeiltipp-Symbol oben klicken. Klicken Sie zu diesem Zeitpunkt, während das Bild live ist, im A1plus Compact GUI-Fenster auf die Schiebeskala und ändern Sie die Lochblendengröße, um sicherzustellen, dass unscharfes Licht begrenzt wird. Stellen Sie als Nächstes die Hochspannungs- und Offset-Einstellungen unter jedem Laser auf ein geeignetes Niveau ein, indem Sie die Schiebeskalen verwenden, um die Erkennung der spezifischen Färbung zu ermöglichen und gleichzeitig mögliche Hintergrundflecken zu begrenzen. Wenn eine positive Färbeprobe verfügbar ist, beginnen Sie mit der Abbildung dieser Probe für jeden Kanal, um sicherzustellen, dass die Lasereinstellungen ein optimales Signal-Rausch-Verhältnis ergeben. Nachdem Sie die optimalen HV- und Offset-Werte für jeden Laser eingestellt haben, klicken Sie auf die Registerkarte ND-Erfassung und wählen Sie dann das Z-Symbol aus, um die Parameter für die z-Serie einzurichten.

Wenn Sie als Nächstes ein Live-Bild des Beispiels aufnehmen, legen Sie zunächst den unteren Rand des Bildes fest, indem Sie den unteren Rand des Bildes suchen und auf die untere Schaltfläche klicken. Suchen Sie dann die obere Position des Beispiels und klicken Sie auf die obere Schaltfläche. Legen Sie die Schrittweite fest, indem Sie entweder die bevorzugte Schrittgröße in Mikrometern für jeden Schritt eingeben oder indem Sie angeben, wie viele Schritte insgesamt erforderlich sind. Um die gewünschte Größe/Pixelauflösung des Bildes auszuwählen, klicken Sie auf das Aiplus Compact GUI-Fenster und wählen Sie unter dem Größensymbol die gewünschte Auflösung aus.

Um das Rauschen des Bildes zu verringern, können Sie das Dropdown-Menü neben dem Theta-Symbol auswählen, um die ausgewählte Anzahl von Bildern zu mitteln. Klicken Sie anschließend im Menü ND-Erfassung auf die Registerkarte Jetzt ausführen, um mit der Bildgebung der Probe zu beginnen. Nachdem das Imaging abgeschlossen ist, speichern Sie das Bild, indem Sie auf Datei und dann auf Speichern unter klicken, wodurch die Bilddatei mit der Erweiterung dot-nd2 exportiert wird. Wiederholen Sie abschließend den Vorgang für jede der anderen Proben.

In diesem Experiment wurden Mausfibroblasten, die das Oberflächenglykoprotein-Gen CD1d exprimieren, fixiert, immungefärbt und auf einem konfokalen Mikroskop abgebildet. Dieses Bild zeigt einen einzelnen Ausschnitt eines Z-Stapels bei 40-facher Vergrößerung, in dem CD1d rot gefärbt ist. Die Probe wurde mit LAMP-1, einem lysosomalen Marker, in grün gefärbt. Die Kernfärbung DAPI wurde verwendet, um die Zellkerne zu zeigen.

In einem zusammengesetzten Bild, in dem die drei verschiedenen Kanäle verschmolzen sind, resultiert das Erscheinungsbild von Gelb aus der Überlappung der roten und grünen Kanäle und zeigt einen Bereich an, in dem CD1d und LAMP-1 in den Lysosomen kolokalisiert sind. Bereiche, in denen nur eine Farbe vorhanden ist, weisen auf das Vorhandensein von CD1d oder LAMP-1 ohne Co-Lokalisierung hin. Dieses Bild zeigt ein 3D-Rendering der Zellen, die aus Bildern erstellt wurden, die im Z-Stapel aufgenommen wurden, und diese Methode ermöglichte die Erstellung einer Seitenansicht dieser Zellgruppe. Das folgende Bild zeigt einen Ausschnitt aus dem Z-Stapel bei 100-facher Vergrößerung, der die Expressionsmuster dieser beiden Proteine im Detail zeigt. Das rosa umrandete Feld auf der rechten Seite des Bildes zeigt den Querschnitt der X-Koordinate an, die durch die rosa Linie im Bild gekennzeichnet ist, die die Seitenansicht an der rosa Linie darstellt. In ähnlicher Weise zeigt das blau umrandete Feld am unteren Rand des Bildes den Querschnitt der Y-Koordinate, die durch die blaue Linie im Bild gekennzeichnet ist und die Vorderansicht an der blauen Linie darstellt. Das 3D-Rendering des Z-Stapel-Bildes ermöglicht es Benutzern, das Bild in 3D anzuzeigen und alle X-, Y- und Z-Ebenen zu visualisieren. Dies kann verwendet werden, um die Co-Lokalisation der verschiedenen Färbungen in verschiedenen Regionen innerhalb der Zelle zu untersuchen.