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Quelle: Dominique R. Bollino1, Eric A. Legenzov2, Tonya J. Webb1
1 Department of Microbiology and Immunology, University of Maryland School of Medicine and the Marlene and Stewart Greenebaum Comprehensive Cancer Center, Baltimore, Maryland 21201
2 Center for Biomedical Engineering and Technology, University of Maryland School of Medicine, Baltimore, Maryland 21201
Die konfokale Fluoreszenzmikroskopie ist eine bildgebende Technik, die eine höhere optische Auflösung im Vergleich zur herkömmlichen "Weitfeld"-Epifluoreszenzmikroskopie ermöglicht. Konfokale Mikroskope sind in der Lage, eine verbesserte x-y optische Auflösung durch "Laserscanning" zu erreichen - typischerweise eine Reihe von spannungsgesteuerten Spiegeln (Galvanometer oder "Galvo"-Spiegel), die Laserbeleuchtung auf jedes Pixel der Probe zu einem Zeitpunkt leiten. Noch wichtiger ist, dass konfokale Mikroskope eine überlegene z-axiale Auflösung erreichen, indem sie ein Loch verwenden, um aus fokussiertem Licht zu entfernen, das von Orten stammt, die sich nicht in der zu scannenden Z-Ebene befinden, wodurch der Detektor Daten von einer bestimmten Z-Ebene sammeln kann. Durch die hohe Z-Auflösung, die in der konfokalen Mikroskopie erreichbar ist, ist es möglich, Bilder aus einer Reihe von Z-Ebenen (auch z-stack genannt) zu sammeln und ein 3D-Bild durch Software zu konstruieren.
Bevor Sie den Mechanismus eines konfokalen Mikroskops diskutieren, ist es wichtig zu überlegen, wie eine Probe mit Licht interagiert. Licht besteht aus Photonen, Paketen elektromagnetischer Energie. Ein Photon, das auf eine biologische Probe einwirkt, kann mit den Molekülen interagieren, die die Probe umfassen, auf eine von vier Arten: 1) das Photon interagiert nicht und durchläuft die Probe; 2) das Photon reflektiert/gestreut wird; 3) das Photon wird von einem Molekül absorbiert und die absorbierte Energie wird als Wärme durch Prozesse freigesetzt, die kollektiv als nicht-radioativer Zerfall bekannt sind; und 4) das Photon wird absorbiert und die Energie wird dann schnell als sekundäres Photon durch den als Fluoreszenz bekannten Prozess übersendet. Ein Molekül, dessen Struktur die Fluoreszenzemission zulässt, wird als Fluorophor bezeichnet. Die meisten biologischen Proben enthalten vernachlässigbare endogene Fluorophore; daher müssen exogene Fluorophore verwendet werden, um Merkmale hervorzuheben, die für die Probe von Interesse sind. Während der Fluoreszenzmikroskopie wird die Probe mit Licht der entsprechenden Wellenlänge für die Absorption durch das Fluorophor beleuchtet. Bei der Aufnahme eines Photons wird ein Fluorophor als "erregt" bezeichnet und der Absorptionsprozess wird als "Erregung" bezeichnet. Wenn ein Fluorophor Energie in Form eines Photons aufgibt, wird das Verfahren als "Emission" bezeichnet, und das emittierte Photon wird Fluoreszenz genannt.
Der Lichtstrahl, der zur Erregung eines Fluorophors verwendet wird, wird durch die Objektivlinse eines Mikroskops fokussiert und konvergiert an einem "Fokalpunkt", wo er maximal fokussiert ist. Jenseits des Brennpunkts weicht das Licht wieder ab. Die ein- und austretenden Balken können als kegelndes Kegelpaar visualisiert werden, das sich am Brennpunkt berührt (siehe Abbildung 1, linkes Panel). Das Phänomen der Beugung setzt eine Grenze, wie eng ein Lichtstrahl fokussiert werden kann - der Strahl konzentriert sich tatsächlich auf einen Punkt von endlicher Größe. Zwei Faktoren bestimmen die Größe des Brennpunkts: 1) die Wellenlänge des Lichts und 2) die Lichtaufnahmefähigkeit der Objektivlinse, die sich durch ihre numerische Blende (NA)auszeichnet. Der brennpunktige "Spot" erstreckt sich nicht nur in der x-y-Ebene, sondern auch in z-Richtung und ist in Wirklichkeit ein Brennvolumen. Die Abmessungen dieses Brennvolumens definieren die maximale Auflösung, die durch optische Bildgebung erreicht wird. Obwohl die Anzahl der Photonen innerhalb des Brennvolumens am größten ist, enthalten die konischen Lichtpfade oberhalb und unterhalb des Fokus auch eine geringere Dichte von Photonen. Jedes Fluorophor im Lichtpfad kann so angeregt werden. In der konventionellen (Weitfeld-)Epifluoreszenzmikroskopie tragen die Emissionen von Fluorophoren oberhalb und unterhalb der Brennebene zur außerfokussierenden Fluoreszenz bei (ein "hazy background"), was die Bildauflösung und den Kontrast reduziert, wie in Abbildung 1 der rote Würfel, der die Fluorophoremission über der Brennebene (roter Stern) darstellt, die zu einer nicht fokussierten Fluoreszenz führt (oben rechts). Dieses Problem wird in der konfokalen Mikroskopie durch die Verwendung eines Lochs gemildert. (Abbildung 2, unten rechts). Wie in Abbildung 3 dargestellt, ermöglicht das Loch Emissionen, die vom Brennpunkt ausgehen, den Detektor (links) zu erreichen, während die nicht fokussierte Fluoreszenz (rechts) am Erreichen des Detektors gehindert wird, wodurch sowohl die Auflösung als auch der Kontrast verbessert werden.
Abbildung 1. Optische Auflösung der Epifluoreszenz versus konfokale Mikroskopie. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Der Lichtstrahl, der zur Anregung eines Fluorophors verwendet wird, wird durch die Objektivlinse eines Mikroskops fokussiert und konvergiert bei einem Brennvolumen und weicht dann ab (links). Der rote Stern stellt die Brennebene einer Probe dar, die abgebildet wird, während das rote Quadrat die Fluorophoremission über der Brennebene darstellt. Bei der Aufnahme eines Bildes dieser Probe mit einem Epifluoreszenzmikroskop wird die Emission des roten Quadrats a-fokus sichtbar und trägt zu einem "hazy background" (oben rechts) bei. Konfokale Mikroskope haben ein Loch, das die Erkennung von Licht verhindert, das außerhalb der Brennebene emittiert wird, wodurch der "hazy background" (unten rechts) eliminiert wird.
Abbildung 2. Locheffekt in der konfokalen Mikroskopie. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Obwohl die höchste Intensität des Anregungslichts am Brennpunkt der Linse (links, rot oval) liegt, erhalten andere Teile der Probe, die sich nicht im Brennpunkt befindet (rechts, roter Stern), Licht und Fluoreszenz. Um zu verhindern, dass Licht aus diesen nicht fokussierten Bereichen zum Detektor gelangt, befindet sich ein Bildschirm mit einem Loch vor dem Detektor. Nur das von der Brennebene emittende Infokuslicht (links) kann durch das Loch reisen und den Detektor erreichen. Das nicht fokussierte Licht (rechts) wird mit dem Loch blockiert und erreicht den Detektor nicht.
Abbildung 3. Hauptkomponenten eines konfokalen Laserscanmikroskops. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Der Einfachheit halber wird sich die mechanistische Beschreibung eines konfokalen Mikroskops auf die des Nikon Eclipse Ti A1R beschränken. Obwohl es geringfügige technische Unterschiede zwischen verschiedenen konfokalen Mikroskopen geben kann, dient das A1R sowohl als gutes Modell für die Beschreibung der konfokalen Mikroskopfunktion. Der anregungslichtstrahl, der durch eine Reihe von Diodenlasern erzeugt wird, wird vom primären dichroitischen Spiegel in das Objektiv reflektiert, der das Licht auf die abgebildete Probe fokussiert. Der primäre dichroitische Spiegel reflektiert selektiv das Anregungslicht und lässt gleichzeitig Licht bei anderen Wellenlängen passieren. Das Licht trifft dann auf die Scanspiegel, die den Lichtstrahl x-y x-y über die Probe fegen und gleichzeitig ein einzelnes (x,y) Pixel beleuchten. Fluoreszenz, die von Fluorophoren am beleuchteten Pixel emittiert wird, wird von der Objektivlinse erfasst und durchläuft den primären dichroitischen Spiegel, um eine Reihe von Photomultiplierröhren (PMTs) zu erreichen. Sekundäre dichroitische Spiegel leiten das Emissionslicht auf das entsprechende PMT. Von der Probe in das Objektiv gestreutes Anregungslicht wird durch den primären dichroitischen Spiegel zurück zur Probe reflektiert und somit am Eindringen in den Nachweis gehindert. Lichtpfad und erreichen die PMTs (siehe Abbildung 3). Dadurch kann die relativ schwache Fluoreszenz ohne Kontamination durch Licht quantifiziert werden, das vom Anregungslichtstrahl gestreut wird, der typischerweise um Größenordnungen intensiver ist als die Fluoreszenz. Da das Loch Licht von außerhalb des Brennvolumens blockiert, kommt das Licht, das beim Detektor ankommt, von einer schmalen, ausgewählten Z-Ebene. Daher können Bilder aus einer Reihe benachbarter z-Ebenengesammelt werden; diese Bilderserie wird oft als "Z-Stack" bezeichnet. Mit der entsprechenden Software kann ein z-Stackverarbeitet werden, um ein 3D-Bild der Probe zu erzeugen. Ein besonderer Vorteil der konfokalen Mikroskopie ist die Fähigkeit, die subzelluläre Lokalisation der Färbung zu unterscheiden. Zum Beispiel die Unterscheidung zwischen Membranfärbung und intrazellulärer Färbung, die bei der konventionellen Epifluoreszenzmikroskopie (1, 2, 3) sehr anspruchsvoll ist.
Die Probenvorbereitung ist eine wichtige Facette der konfokalen Bildgebung. Eine Stärke der optischen Mikroskopie-Techniken ist die Flexibilität, lebende oder feste Zellen abzubilden. Beim Versuch, 3D-Bilder zu erzeugen, ist die Verwendung fester Zellen aufgrund der Anzahl der Bilder, die für einen Z-Stack erworben werden müssen, der Schwierigkeit, die Zellgesundheit zu erhalten, und der Bewegung von lebenden Zellen und ihren Organellen typisch. Das Verfahren zur Fixierung und Färbung von Zellen zur konfokalen Fluoreszenz ähnelt dem, das konventionell bei der Immunfluoreszenz verwendet wird. Nach der Kultur in Kammerrutschen oder auf Abdeckungen werden Zellen mit Paraformaldehyd fixiert, um die zelluläre Morphologie zu erhalten. Die unspezifische Antikörperbindung wird mit Rinderserumalbumin, Milch oder normalem Serum blockiert. Um die Spezifität der sekundären Antikörper aufrechtzuerhalten, sollte die verwendete Lösung nicht von derselben Art stammen, bei der die primären Antikörper erzeugt wurden. Die Zellen werden mit primären Antikörpern inkubiert, die das Antigen von Interesse binden. Bei der Kennzeichnung mehrerer zellulärer Ziele müssen die primären Antikörper jeweils von einer anderen Spezies abgeleitet werden. Antikörper, die ein Antigen kennzeichnen, werden dann durch fluorophorkonjugierte sekundäre Antikörper gebunden. Fluorophorkonjugierte Sekundärantikörper sollten so ausgewählt werden, dass sie mit den Wellenlängen der Lasererregung im konfokalen Mikroskop kompatibel sind. Bei der Visualisierung mehrerer Antigene sollten sich die Anregungs-/Emissionsspektren der Fluorophore so weit unterscheiden, dass ihre Signale durch mikroskopische Analysen diskriminiert werden können. Die gebeizte Probe wird dann zur Bildgebung auf einem Dia montiert. Ein Montagemedium wird verwendet, um Photobleichungen und Probenaustrocknung zu verhindern. Auf Wunsch kann ein Montagemedium verwendet werden, das einen nuklearen Gegenfleck enthält (z.B. DAPI oder Hoechst) (4).
Im folgenden Protokoll wurden Maus-Fibroblasten, die auf CD1d (LCD1) transfiziert wurden, mit Antikörpern gefärbt, die CD1d und CD107a (LAMP-1) erkennen. CD1d ist ein wichtiger Histokompatibilitätskomplex 1 (MHC 1)-ähnlicher Rezeptor, der auf der Oberfläche von Antigen-Präsentierenden Zellen vorhanden ist, die Lipidantigene darstellen. LAMP-1 (lysosomal assoziiertes Membranprotein-1) ist ein Transmembranprotein, das hauptsächlich in lysosomalen Membranen vorkommt. Für die richtige Antigen-Präsentation wird CD1d durch das niedrige pH-Lysosomalfach geschmuggelt, so dass LAMP-1 als Marker des lysosomalen Fachs für dieses Protokoll verwendet wird. Durch die Untersuchung der LCD1-Zellen mit Anti-CD1d und Anti-LAMP-1, die in verschiedenen Arten hergestellt wurden, können sekundäre Antikörper mit einzigartigen Fluorophoren verwendet werden, um die Lokalisation jedes Proteins in der Zelle zu bestimmen und ob CD1d in der LAMP-1-positiven lysosomalen Fächern.
1. Materialien
Puffer
ausrüstung
Materialien und Reagenzien
Assay Spezifische Reagenzien
2. Protokoll
Vorbereitung auf Antikörperfärbung
Säzellen
fixierung
Permeabilisierung
Blockieren
Primäre Antikörper-Inkubation
Hinweis: Wenn Sie nach mehr als einem Ziel suchen, stellen Sie sicher, dass die primären Antikörper unterschiedliche Isotypen sind. Die empfohlenen Antikörperkonzentrationen variieren zwischen den Herstellern und sollten vor der Anwendung titriert werden.
Sekundäre Antikörperinkubation
Hinweis: Die empfohlenen Antikörperkonzentrationen variieren je nach Hersteller und sollten vor der Anwendung titriert werden. Bei der Suche nach mehr als einem Ziel müssen sekundäre Antikörper mit verschiedenen Fluorophoren mit einzigartigen Anregungs-/Emissionsspektren konjugiert werden. Beachten Sie auch die Anregung/Emission des nuklearen Gegenflecks (d.h. DAPI) bei der Auswahl der Fluorophore. Die Fluorophorauswahl kann durch die Laserkonfiguration des verwendeten Konfokalmikroskops beeinflusst werden. Die Laserkonfiguration der Maschine bestimmt, welche Fluorophore für das Experiment geeignet sind.
3. Montage von Abdeckungen
4. Konfokale Bildgebung
Bildproben auf einem konfokalen Laserscanmikroskop. Für die in Abbildung 2 dargestellten Daten wurde die Nikon Eclipse Ti A1R mit der Software NIS Elements Advanced Research verwendet. Im folgenden Abschnitt wird das Verfahren zum Erfassen von Bildern mit der oben genannten Software beschrieben.
Die konfokale Fluoreszenzmikroskopie ist eine spezialisierte bildgebende Technik zur Lokalisierung eines Proteins oder Antigens von Interesse in einer Zell- oder Gewebeprobe, indem das Antigen mit einem antikörperkonjugierten Fluoreszenzfarbstoff gekennzeichnet und das fluoreszierende Signal erkannt wird. Es bietet eine höhere räumliche Auflösung als weiträumige Fluoreszenzmikroskopie, mit Hilfe von zwei Lochlöchern, die an den Brennebenen der Objektivlinse platziert werden, was ihm den Namen konfokale gibt. Es ermöglicht Benutzern, die Färbung auf subzellulärer Ebene zu visualisieren, wie die Unterscheidung zwischen Oberflächenmembranfärbung von intrazellulärer Färbung.
Ein konfokales Mikroskop folgt einem ähnlichen Grundprinzip wie ein klassisches Fluoreszenzmikroskop. Der Strahl einer Lichtquelle, in der Regel ein Laser für konfokale, wird von einem dichroitischen Spiegel reflektiert und durch eine Objektivlinse auf die Probe fokussiert. Dieses Licht regt die Fluorophore zu einer anderen Wellenlänge an, die durch die Objektivlinse und den dichroitischen Spiegel zu einer Kamera oder einem Okular zurückfließt.
Die verbesserte Auflösung eines konfokalen Mikroskops ist hauptsächlich auf das Vorhandensein von zwei Lochlöchern zurückzuführen, bei denen es sich um sehr kleine Löcher handelt, die Licht auf den Anregungs- und Emissionslichtpfaden passieren kann. Die Lochlöcher werden strategisch auf der Brennebene der Objektivlinse platziert. Wechseln wir nun zu einem Seitenansichtsschema der Mikroskopanordnung, um den Lichtpfad zu überprüfen. Nach dem Durchlaufen des Anregungslochs hat der Anregungslichtstrahl den Effekt, dass er von einem Brennpunkt ausgeht, was es der Objektivlinse ermöglicht, das Licht dann auch auf einen Punkt auf die Probe zu fokussieren. Der Emissionsstrahl von diesem Brennpunkt konvergiert am Emissionsloch, wodurch er passieren kann. Während der Anregung sind die Fluorophore innerhalb des Lichtweges oberhalb und unterhalb des Brennpunkts auch leicht aufgeregt. Während das vom Brennpunkt ausgehende Emissionslicht durch das Loch geht, konvergieren die Emissionen der out-of-fokus-Punkte vor oder nach dem Emissionsloch und werden daher blockiert, was zu einer reduzierten Hintergrundfluoreszenz führt.
Der Anregungs-Emissions-Erkennungszyklus muss für jeden Bildpunkt im Interessenbereich wiederholt werden, was auf verschiedene Weise erfolgen kann. Beispielsweise verwendet das Laserscanning confocal galvanometer-Scanning-Spiegel, die das Anregungslicht in verschiedenen Winkeln ablenken. Daher den Lichtstrahl über die Probe in der XY-Ebene zu fegen. Spinning Disc konfokale verwendet eine Scheibe mit einer Reihe von Lochlöchern, die sich dreht, um die Anordnung der Pinholes zu verschieben. Auf diese Weise können Benutzer jedes Mal mehrere kleine Bildstellen in der Probe beleuchten und nach und nach den gesamten Bereich abdecken, während sich die Scheibe dreht. Durch die Lochlöcher stellt das XY-Bild am Detektor eine schmale Z-Ebene dar. Daher können Bilder aus einer Reihe aufeinander folgender Z-Ebenen gesammelt werden, die oft als Z-Stack bezeichnet werden. Aus diesen Bildern kann eine entsprechende Software eine 3D-Darstellung des Fluoreszenzsignalmusters in der Probe erzeugen.
In diesem Protokoll beobachten Sie die Immunostainierung von Maus-Fibroblasten, gefolgt von einer Bildgebung auf einem konfokalen Mikroskop, um ein Zelloberflächenprotein und ein lysosomales Protein differenziell zu visualisieren.
Um mit sterilen Techniken zu beginnen, die Zellen von Interesse in 500 Mikroliter Wachstumsmedien pro Brunnen wieder auszusetzen, und sie dann in die Brunnen einer Vier-Brunnen-Kammerrutsche säen. Hier verwenden wir Maus-Fibroblasten, die transfiziert wurden, um das antigenpräsentierende Molekül CD1d auszudrücken. Damit die Zellen am Glas haften können, schieben Sie die Kammer in einen 5% Kohlendioxid-Inkubator bei 37 Grad Celsius und inkubieren Sie sie über Nacht. Am Morgen, aspirieren Sie die Medien aus jedem Brunnen, und dann waschen Sie die Zellen einmal mit 500 Mikroliter PBS für ein paar Sekunden.
Um die Zellen zu fixieren, fügen Sie 500 Mikroliter 1% Paraformaldehydlösung in jeden Brunnen ein und inkubieren Sie 15 Minuten bei Raumtemperatur. Nach der Inkubation das Paraformaldehyd in einen geeigneten Behälter für gefährliche Flüssigkeiten sammeln und dann alle Reste des Fixativs entfernen, indem Sie die Zellen dreimal mit PBS für ein paar Sekunden waschen.
Um das Eindringen von Antikörpern in die Zellen zu ermöglichen, fügen Sie jedem Bohrkörper 500 Mikroliter Permeabilisationspuffer hinzu und brüten sie 15 Minuten bei Raumtemperatur auf der Bank. Nach der Permeabilisation die Zellen mit 500 Mikroliter PBS kurz waschen. Als nächstes fügen Sie 500 Mikroliter Blockierpuffer zu jedem Brunnen hinzu und brüten für eine Stunde bei vier Grad Celsius, um eine unspezifische Antikörperbindung zu verhindern.
Bereiten Sie die primären Antikörper, Anti-CD1d und Anti-LAMP-1, in entsprechenden Arbeitskonzentrationen vor. Dann den Puffer aus den Brunnen ansaugen und die Zellen in jedem Brunnen mit 500 Mikrolitern verdünnter Primärantikörperlösung bedecken und dann den Schlitten über Nacht bei vier Grad Celsius auf einer ebenen Oberfläche bebrüten. Am nächsten Morgen verdünnen Sie die sekundären Antikörper, in diesem Fall einen Anti-Maus- und Rattenanti-Antikörper mit deutlichen Fluoreszenz-Tags, im Blockierpuffer zu entsprechenden Arbeitskonzentrationen. Als nächstes die primäre Antikörperlösung aus den Brunnen aspirieren und dann die Zellen viermal mit 500 Mikroliter PBS waschen. Dann 500 Mikroliter der verdünnten Sekundärantikörperlösung zu jedem Brunnen hinzufügen und bei Raumtemperatur für eine Stunde im Dunkeln inkubieren. Nach der Inkubation die sekundäre Antikörperlösung ansaugen und die Brunnen viermal mit 500 MikroliterPBS waschen, um alle ungebundenen Sekundärantikörper zu entfernen.
Um die Proben nach der letzten Wäsche zu montieren, lösen Sie die Kammern vorsichtig und entfernen Sie sie von der Rutsche. Um die verbleibende PBS zu entfernen, halten Sie die Folie in einem Winkel über einem empfindlichen Aufgabenwisch, und entfernen Sie die Flüssigkeit von den Rändern, ohne die Zellen zu berühren. Sobald die überschüssige PBS entfernt wurde, fügen Sie einen Tropfen Antifade-Montagemedium, das den kerntechnischen Fleck DAPI enthält, auf jeden Zellabschnitt ein. Nehmen Sie als Nächstes einen 20 mal 60-Millimeter-Abdeckungsslip, und mit nur Fingerspitzen beginnen Sie, den Coverslip langsam auf beiden Kanten zu senken, wobei darauf zu achten ist, dass Blasenbildung über den Zellen vermieden wird. Wischen Sie jedes zusätzliche Montagemedium auf den Dias mit einem zarten Aufgabenwisch ab und lagern Sie die Dias bei Raumtemperatur bis zu einer Woche im Dunkeln.
Um mit der Abbildung der Zellen zu beginnen, klicken Sie zuerst auf das NIS-Softwaresymbol auf dem Desktop. Sobald Sie im Kontrollfenster sind, klicken Sie oben auf die Registerkarte TiPad, und wählen Sie das gewünschte Ziel für die Bildgebung aus. Laden Sie dann den Dia mit Zellen auf die Bühne und zentrieren Sie ihn unter der Linse. Als nächstes richten Sie auf der Registerkarte A1plus Compact GUI neben dem TiPad-Tab die Fürdier verwendeten Laser ein. Klicken Sie auf das Zahnradsymbol, um das Menü Farb- und Spektraleinstellungen zu öffnen. Sobald das Menü farb- und spektrale Einstellungen geöffnet ist, wählen Sie die benötigten Kanäle aus und stellen Sie den Laser für jeden Kanal ein. Wählen Sie dann die entsprechenden Emissionen im Dropdown-Menü unter dem ersten dichroitischen Spiegel aus. Klicken Sie anschließend unter dem A1plus Compact GUI-Fenster auf Ch.Series, um die Linienkanalserie einzurichten, die festlegt, ob die verwendeten Laser gleichzeitig oder sequenziell auf die Probe feuern.
Danach beginnen Sie mit dem Scannen, indem Sie oben auf das Pfeilspitzensymbol klicken. An dieser Stelle, während die Bildgebung live ist, klicken Sie unter dem A1plus Compact GUI-Fenster auf die Schiebeskala, und ändern Sie die Lochgröße, um die Begrenzung von Nichtfokuslicht zu gewährleisten. Passen Sie als Nächstes die Hochspannungs- und Offseteinstellungen unter jedem Laser auf entsprechende Ebenen an, indem Sie die Gleitwaagen verwenden, um die Erkennung der spezifischen Färbung zu ermöglichen und gleichzeitig mögliche Hintergrundfärbungen einzuschränken. Wenn eine positive Färbeprobe verfügbar ist, beginnen Sie mit der Abbildung dieser Probe für jeden Kanal, um sicherzustellen, dass die Lasereinstellungen optimale Signal-Rausch-Verhältnisse ergeben. Nachdem Sie die optimalen HV- und Offsetwerte für jeden Laser eingestellt haben, klicken Sie auf die Registerkarte ND-Erfassung, und wählen Sie dann das Z-Symbol aus, um die Parameter für die Z-Serie einzurichten.
Wenn Sie als Nächstes ein Livebild des Beispiels abrufen, legen Sie zuerst den unteren Bereich des Bildes fest, indem Sie den unteren Rand des Bildes finden und auf die untere Schaltfläche klicken. Suchen Sie dann die obere Position des Beispiels und klicken Sie auf die obere Schaltfläche. Legen Sie die Schrittgröße fest, indem Sie die bevorzugte Schrittgröße für jeden Schritt in Mikrometer eingeben oder angeben, wie viele Schritte insgesamt erforderlich sind. Um die gewünschte Größe/Pixelauflösung des Bildes auszuwählen, klicken Sie auf das Aiplus Compact GUI-Fenster, und wählen Sie unter dem Größensymbol die gewünschte Auflösung aus.
Um das Rauschen des Bildes zu verringern, können Sie das Dropdown-Menü neben dem Theta-Symbol auswählen, um die ausgewählte Anzahl von Bildern zu durchschnittlich zu haben. Klicken Sie anschließend im Menü ND-Erfassung auf die Registerkarte Jetzt ausführen, um mit der Bildgebung des Beispiels zu beginnen. Nachdem die Bildgebung abgeschlossen ist, speichern Sie das Bild, indem Sie auf Datei klicken, und speichern Sie dann unter, wodurch die Bilddatei mit der Erweiterung dot-nd2 exportiert wird. Wiederholen Sie schließlich den Vorgang für jede der anderen Stichproben.
In diesem Experiment wurden Maus-Fibroblasten, die das Oberflächenglykoprotein-Gen CD1d exzessierten, fixiert, immungefärbt und auf einem konfokalen Mikroskop abgebildet. Dieses Bild zeigt einen einzelnen Abschnitt eines Z-Stacks bei 40-facher Vergrößerung, wobei CD1d rot gefärbt ist. Die Probe wurde mit LAMP-1, einem lysosomalen Marker, in Grün gecostainiert. Kernfleck DAPI wurde verwendet, um die Kerne der Zellen zu zeigen.
In einem zusammengesetzten Bild, in dem die drei verschiedenen Kanäle zusammengeführt werden, ergibt sich das Auftreten von Gelb aus der Überlappung der roten und grünen Kanäle und zeigt einen Bereich an, in dem CD1d und LAMP-1 in den Lysosomen kolokalisiert sind. Bereiche, in denen nur eine Farbe vorhanden ist, zeigen das Vorhandensein von CD1d oder LAMP-1 ohne Kolokalisierung an. Dieses Bild zeigt eine 3D-Rendering der Zellen aus Bildern im Z-Stack aufgenommen erstellt und diese Methode ermöglichte die Konstruktion einer Seitenansicht dieser Gruppe von Zellen. Die folgende Abbildung zeigt ein Segment aus dem Z-Stack bei 100-facher Vergrößerung, das die Expressionsmuster dieser beiden Proteine genauer demonstriert. Das rosa umrissene Feld auf der rechten Seite des Bildes zeigt den Querschnitt der x-Koordinate an, die durch die rosa Linie im Bild gekennzeichnet ist, die die Seitenansicht an der rosa Linie darstellt. In ähnlicher Weise zeigt das blau umrissene Feld am unteren Rand des Bildes den Querschnitt der y-Koordinate, der durch die blaue Linie im Bild bezeichnet wird, die die Vorderansicht der blauen Linie darstellt. Das 3D-Rendering des Z-Stack-Bildes ermöglicht es Benutzern, das Bild in 3D anzuzeigen und alle x-, y- und z-Ebenen zu visualisieren. Dies kann verwendet werden, um die Kolokalisierung der verschiedenen Flecken an verschiedenen Regionen innerhalb der Zelle zu untersuchen.
Die konfokale Fluoreszenzmikroskopie ist ein spezialisiertes bildgebendes Verfahren zur Lokalisierung eines Proteins oder Antigens von Interesse in einer Zell- oder Gewebeprobe, indem das Antigen mit einem Antikörper-konjugierten Fluoreszenzfarbstoff markiert und das Fluoreszenzsignal nachgewiesen wird. Sie bietet eine höhere räumliche Auflösung als die Weitfeld-Fluoreszenzmikroskopie, mit Hilfe von zwei Lochblenden, die in den Brennebenen der Objektivlinse platziert sind, was ihr den Namen konfokal gibt. Es ermöglicht dem Anwender, die Färbung auf subzellulärer Ebene zu visualisieren, wie z.B. die Unterscheidung zwischen Oberflächenmembranfärbung und intrazellulärer Färbung.
Ein konfokales Mikroskop folgt einem ähnlichen Grundprinzip wie ein klassisches Fluoreszenzmikroskop. Der Strahl einer Lichtquelle, in der Regel ein konfokaler Laser, wird von einem dichroitischen Spiegel reflektiert und durch eine Objektivlinse auf die Probe fokussiert. Dieses Licht regt die Fluorophore an, eine andere Wellenlänge zu emittieren, die durch die Objektivlinse und den dichroitischen Spiegel zurück zu einer Kamera oder einem Okular wandert.
Die erhöhte Auflösung eines konfokalen Mikroskops ist hauptsächlich auf das Vorhandensein von zwei Lochblenden zurückzuführen, bei denen es sich um sehr kleine Löcher handelt, durch die Licht auf dem Anregungs- und Emissionslichtweg dringt. Die Lochblenden sind strategisch in der Brennebene der Objektivlinse platziert. Wechseln wir nun zu einem Schema der Mikroskopanordnung in der Seitenansicht, um den Strahlengang zu überprüfen. Nach dem Durchgang durch die Anregungslochblende hat der Anregungslichtstrahl den Effekt, dass er von einem Brennpunkt ausgeht, was es der Objektivlinse ermöglicht, das Licht dann ebenfalls auf einen Punkt auf der Probe zu fokussieren. Der Emissionsstrahl von diesem Brennpunkt konvergiert an der Emissionslochblende, wodurch er durchgelassen werden kann. Während der Anregung werden nun auch Fluorophore innerhalb des Strahlengangs, oberhalb und unterhalb des Brennpunkts, leicht angeregt. Während das vom Brennpunkt ausgehende Emissionslicht durch die Lochblende fällt, konvergieren die Emissionen der unscharfen Punkte vor oder nach der Lochblende und werden daher blockiert, was zu einer verringerten Hintergrundfluoreszenz führt.
Der Anregungs-Emissions-Detektionszyklus muss für jeden Bildpunkt in der interessierenden Region wiederholt werden, was auf verschiedene Arten erfolgen kann. Beim konfokalen Laserscanning werden beispielsweise Galvanometer-Scanning-Spiegel verwendet, die das Anregungslicht in verschiedenen Winkeln ablenken. Daher wird der Lichtstrahl über die Probe in der XY-Ebene geschwenkt. Bei der konfokalen Spinning-Scheibe wird eine Scheibe mit einer Anordnung von Lochblenden verwendet, die sich dreht, um die Anordnung der Lochblenden zu verschieben. Auf diese Weise können jedes Mal mehrere kleine Bildpunkte in der Probe beleuchtet werden, die beim Drehen der Scheibe allmählich den gesamten Bereich abdecken. Infolge der Lochblenden stellt das XY-Bild am Detektor eine schmale Z-Ebene dar. Daher können Bilder aus einer Reihe aufeinanderfolgender Z-Ebenen gesammelt werden, die häufig als Z-Stapel bezeichnet werden. Aus diesen Bildern kann eine entsprechende Software eine 3D-Darstellung des Fluoreszenzsignalmusters in der Probe erzeugen.
In diesem Protokoll beobachten Sie die Immunfärbung von Mausfibroblasten, gefolgt von der Bildgebung an einem konfokalen Mikroskop, um ein Zelloberflächenprotein und ein lysosomales Protein unterschiedlich sichtbar zu machen.
Zu Beginn resuspendieren Sie die interessierenden Zellen mit sterilen Techniken in 500 Mikrolitern Wachstumsmedium pro Vertiefung und säen sie dann in die Vertiefungen eines Objektträgers mit vier Vertiefungen. Hier verwenden wir Maus-Fibroblasten, die transfiziert wurden, um das Antigen-präsentierende Molekül CD1d zu exprimieren. Damit die Zellen am Glas haften können, legen Sie den Objektträger in einen 5%igen Kohlendioxid-Inkubator bei 37 Grad Celsius und inkubieren Sie ihn über Nacht. Saugen Sie morgens das Medium aus jeder Vertiefung an und waschen Sie die Zellen dann einmal einige Sekunden lang mit 500 Mikrolitern PBS.
Um die Zellen zu fixieren, geben Sie 500 Mikroliter 1%ige Paraformaldehydlösung in jede Vertiefung und inkubieren Sie sie 15 Minuten lang bei Raumtemperatur. Sammeln Sie nach der Inkubation das Paraformaldehyd in einem geeigneten Behälter für gefährliche flüssige Abfälle und entfernen Sie dann alle Reste des Fixiermittels, indem Sie die Zellen einige Sekunden lang dreimal mit PBS waschen.
Um das Eindringen von Antikörpern in die Zellen zu ermöglichen, geben Sie 500 Mikroliter Permeabilisierungspuffer in jede Vertiefung und inkubieren Sie 15 Minuten lang bei Raumtemperatur auf der Bank. Waschen Sie die Zellen nach der Permeabilisierung dreimal kurz mit 500 Mikrolitern PBS. Geben Sie anschließend 500 Mikroliter Blockierungspuffer in jede Vertiefung und inkubieren Sie eine Stunde lang bei vier Grad Celsius, um eine unspezifische Antikörperbindung zu verhindern.
Bereiten Sie die primären Antikörper, Anti-CD1d und Anti-LAMP-1, in geeigneten Arbeitskonzentrationen vor. Aspirieren Sie dann den Puffer aus den Vertiefungen und bedecken Sie die Zellen in jeder Vertiefung mit 500 Mikrolitern verdünnter Primärantikörperlösung und inkubieren Sie den Objektträger dann über Nacht auf einer ebenen Fläche bei vier Grad Celsius. Am nächsten Morgen werden die Sekundärantikörper, in diesem Fall ein Anti-Maus- und ein Anti-Ratten-Antikörper mit unterschiedlichen Fluoreszenz-Tags, in einem Blockpuffer auf geeignete Arbeitskonzentrationen verdünnt. Als nächstes aspirieren Sie die primäre Antikörperlösung aus den Vertiefungen und waschen die Zellen dann viermal mit 500 Mikrolitern PBS. Geben Sie dann 500 Mikroliter der verdünnten Sekundärantikörperlösung in jede Vertiefung und inkubieren Sie eine Stunde lang bei Raumtemperatur im Dunkeln. Nach der Inkubation aspirieren Sie die Sekundärantikörperlösung und waschen Sie die Vertiefungen viermal mit 500 Mikrolitern PBS, um alle ungebundenen Sekundärantikörper zu entfernen.
Um die Proben nach der letzten Wäsche zu montieren, lösen Sie die Kammern vorsichtig vom Objektträger und entfernen Sie sie. Um das restliche PBS zu entfernen, halten Sie den Objektträger schräg über ein empfindliches Tuch und entfernen Sie die Flüssigkeit von den Rändern, ohne die Zellen zu berühren. Sobald das überschüssige PBS entfernt ist, geben Sie einen Tropfen Antifading-Eindeckmedium, das den Kernfleck DAPI enthält, auf jeden Zellabschnitt. Nehmen Sie als Nächstes ein 20 x 60 Millimeter großes Deckglas und senken Sie das Deckglas mit nur den Fingerspitzen langsam an beiden Kanten ab, wobei Sie darauf achten, dass sich keine Blasen über den Zellen bilden. Wischen Sie überschüssiges Montagemedium auf den Objektträgern mit einem zarten Arbeitstuch ab und lagern Sie die Objektträger bis zu einer Woche lang im Dunkeln bei Raumtemperatur.
Um mit dem Imaging der Zellen zu beginnen, klicken Sie zunächst auf das NIS-Software-Symbol auf dem Desktop. Sobald Sie sich im Steuerungsfenster befinden, klicken Sie oben auf die Registerkarte TiPad und wählen Sie das gewünschte Objektiv für die Bildgebung aus. Legen Sie dann den Objektträger mit den Zellen auf den Tisch und zentrieren Sie ihn unter der Linse. Richten Sie anschließend auf der Registerkarte A1plus Compact GUI neben der Registerkarte TiPad die Laser ein, die für die verwendeten Fluorophore geeignet sind. Klicken Sie auf das Zahnradsymbol, um das Menü mit den Farb- und Spektraleinstellungen zu öffnen. Sobald das Menü für die Farb- und Spektraleinstellungen geöffnet ist, wählen Sie die gewünschten Kanäle aus und stellen Sie den Laser für jeden Kanal ein. Wählen Sie dann die entsprechenden Emissionen im Dropdown-Menü unter dem ersten dichroitischen Spiegel aus. Klicken Sie anschließend im A1plus Compact GUI-Fenster auf Ch.Series, um die Linienkanalserie einzurichten, die festlegt, ob die verwendeten Laser gleichzeitig oder nacheinander auf die Probe feuern.
Starten Sie danach den Scanvorgang, indem Sie auf das Pfeiltipp-Symbol oben klicken. Klicken Sie zu diesem Zeitpunkt, während das Bild live ist, im A1plus Compact GUI-Fenster auf die Schiebeskala und ändern Sie die Lochblendengröße, um sicherzustellen, dass unscharfes Licht begrenzt wird. Stellen Sie als Nächstes die Hochspannungs- und Offset-Einstellungen unter jedem Laser auf ein geeignetes Niveau ein, indem Sie die Schiebeskalen verwenden, um die Erkennung der spezifischen Färbung zu ermöglichen und gleichzeitig mögliche Hintergrundflecken zu begrenzen. Wenn eine positive Färbeprobe verfügbar ist, beginnen Sie mit der Abbildung dieser Probe für jeden Kanal, um sicherzustellen, dass die Lasereinstellungen ein optimales Signal-Rausch-Verhältnis ergeben. Nachdem Sie die optimalen HV- und Offset-Werte für jeden Laser eingestellt haben, klicken Sie auf die Registerkarte ND-Erfassung und wählen Sie dann das Z-Symbol aus, um die Parameter für die z-Serie einzurichten.
Wenn Sie als Nächstes ein Live-Bild des Beispiels aufnehmen, legen Sie zunächst den unteren Rand des Bildes fest, indem Sie den unteren Rand des Bildes suchen und auf die untere Schaltfläche klicken. Suchen Sie dann die obere Position des Beispiels und klicken Sie auf die obere Schaltfläche. Legen Sie die Schrittweite fest, indem Sie entweder die bevorzugte Schrittgröße in Mikrometern für jeden Schritt eingeben oder indem Sie angeben, wie viele Schritte insgesamt erforderlich sind. Um die gewünschte Größe/Pixelauflösung des Bildes auszuwählen, klicken Sie auf das Aiplus Compact GUI-Fenster und wählen Sie unter dem Größensymbol die gewünschte Auflösung aus.
Um das Rauschen des Bildes zu verringern, können Sie das Dropdown-Menü neben dem Theta-Symbol auswählen, um die ausgewählte Anzahl von Bildern zu mitteln. Klicken Sie anschließend im Menü ND-Erfassung auf die Registerkarte Jetzt ausführen, um mit der Bildgebung der Probe zu beginnen. Nachdem das Imaging abgeschlossen ist, speichern Sie das Bild, indem Sie auf Datei und dann auf Speichern unter klicken, wodurch die Bilddatei mit der Erweiterung dot-nd2 exportiert wird. Wiederholen Sie abschließend den Vorgang für jede der anderen Proben.
In diesem Experiment wurden Mausfibroblasten, die das Oberflächenglykoprotein-Gen CD1d exprimieren, fixiert, immungefärbt und auf einem konfokalen Mikroskop abgebildet. Dieses Bild zeigt einen einzelnen Ausschnitt eines Z-Stapels bei 40-facher Vergrößerung, in dem CD1d rot gefärbt ist. Die Probe wurde mit LAMP-1, einem lysosomalen Marker, in grün gefärbt. Die Kernfärbung DAPI wurde verwendet, um die Zellkerne zu zeigen.
In einem zusammengesetzten Bild, in dem die drei verschiedenen Kanäle verschmolzen sind, resultiert das Erscheinungsbild von Gelb aus der Überlappung der roten und grünen Kanäle und zeigt einen Bereich an, in dem CD1d und LAMP-1 in den Lysosomen kolokalisiert sind. Bereiche, in denen nur eine Farbe vorhanden ist, weisen auf das Vorhandensein von CD1d oder LAMP-1 ohne Co-Lokalisierung hin. Dieses Bild zeigt ein 3D-Rendering der Zellen, die aus Bildern erstellt wurden, die im Z-Stapel aufgenommen wurden, und diese Methode ermöglichte die Erstellung einer Seitenansicht dieser Zellgruppe. Das folgende Bild zeigt einen Ausschnitt aus dem Z-Stapel bei 100-facher Vergrößerung, der die Expressionsmuster dieser beiden Proteine im Detail zeigt. Das rosa umrandete Feld auf der rechten Seite des Bildes zeigt den Querschnitt der X-Koordinate an, die durch die rosa Linie im Bild gekennzeichnet ist, die die Seitenansicht an der rosa Linie darstellt. In ähnlicher Weise zeigt das blau umrandete Feld am unteren Rand des Bildes den Querschnitt der Y-Koordinate, die durch die blaue Linie im Bild gekennzeichnet ist und die Vorderansicht an der blauen Linie darstellt. Das 3D-Rendering des Z-Stapel-Bildes ermöglicht es Benutzern, das Bild in 3D anzuzeigen und alle X-, Y- und Z-Ebenen zu visualisieren. Dies kann verwendet werden, um die Co-Lokalisation der verschiedenen Färbungen in verschiedenen Regionen innerhalb der Zelle zu untersuchen.
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