What is a fluorophore and how does it work in immunofluorescence microscopy?

A fluorophore is a molecule that absorbs light energy at a specific wavelength through excitation, then immediately releases the energy at a different wavelength through emission. Fluorophores are conjugated to antibodies and introduced into tissue samples through immunostaining. When the antibody binds to the target protein, the fluorophore labels it, allowing visualization under a fluorescence microscope.

How does a fluorescence microscope separate excitation and emission light?

A fluorescence microscope uses specialized optical components to separate wavelengths. Excitation light passes through an excitation filter, then reflects off a dichroic mirror toward the objective lens, which focuses it on the sample. Emitted light from excited fluorophores returns through the objective and dichroic mirror, which allows only emission wavelengths to pass. An emission filter removes unwanted wavelengths before the image reaches the eyepiece or camera.

Why is rehydration necessary before immunofluorescence staining of paraffin-embedded tissue?

Tissue sections are dehydrated during the paraffin embedding process. Before staining, sections must be rehydrated through graded ethanol incubations and PBS washes to restore tissue hydration and prepare it for antibody binding. This step ensures proper antibody penetration and reduces non-specific binding during the immunostaining procedure.

What is the purpose of a blocking buffer in immunofluorescence staining?

Blocking buffer reduces non-specific binding of antibodies to the tissue section. The tissue is incubated with blocking buffer for one hour at room temperature before primary antibody application. This step prevents the antibody from binding to sites other than the target protein, improving staining specificity and reducing background fluorescence in the final image.

Why is a control slide included in immunofluorescence staining procedures?

A control slide is treated identically to experimental slides but receives only blocking buffer instead of primary antibody. This control helps identify any non-specific binding of the secondary antibody to the tissue. By comparing the control to experimental slides, researchers can distinguish true target protein localization from background fluorescence caused by non-specific antibody interactions.

How can multiple proteins be visualized simultaneously in a single tissue sample?

Multiple different fluorophores with distinct excitation and emission wavelengths can be used to label different proteins within the same sample. DNA binding fluorescent dyes like DAPI label nuclei as a reference point. By using multiple fluorophores, researchers can compare the localization of different proteins and analyze their spatial relationships within the tissue section.

What information can immunofluorescence imaging provide about tissue samples?

Immunofluorescence imaging provides data on protein intensity and localization within tissue sections, revealing cell type heterogeneity, activation of signaling pathways, and biomarker expression. Researchers can quantify the frequency of specific cell populations by counting positively stained cells and comparing them to the total cell population, calculated using a simple ratio equation.

Immunfluoreszenzmikroskopie: Immunfluoreszenzfärbung paraffin-embedded Tissue Sections

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1. Einrichtung

Das typische Färbeprotokoll umfasst die folgenden Schritte:
1. Rehydratisierung der Gewebeabschnitte auf den Dias mit einer Reihe von abgestuften Ethanolen.
2. Inkubation der Gewebeabschnitte mit einem Sperrpuffer, der dazu beiträgt, die unspezifische Bindung von Antikörpern an das Gewebe zu blockieren und die Hintergrundfluoreszenz zu reduzieren.
3. Entfernen des Sperrpuffers und Inkubation des Abschnitts im primären Antikörper, zu diesem Zeitpunkt bindet der Antikörper sein Peptidziel.
4. Entfernen des primären Antikörpers und Waschen der Abschnitte ausgiebig im Waschpuffer.
5. Inkubation der Abschnitte mit sekundärem Antikörper, um eine Bindung an primärer Antikörper zu ermöglichen, wenn der primäre Antikörper nicht direkt mit einem Fluorophor gekennzeichnet ist und ein sekundärer Antikörper erforderlich ist.
6. Waschen des sekundären Antikörpers von den Dias.
7. Montage der Dias in Montagemedien und Trocknen vor der Visualisierung auf einem Fluoreszenzmikroskop.
Folgende Gegenstände werden benötigt: Gleithalter (Glas oder Kunststoff), Gläser, Pipetten, Pap-Stift, feuchte Kammer, Deckelscheine und Montagemedien mit DAPI.
Xylol wird zur Rehydrierung von Dias verwendet. Xylol ist gefährlich und sollte in einer Dunstabzugshaube zusammen mit geeigneten PSA, einschließlich Handschuhen und einem Labormantel, verwendet werden.
Rezepte für Puffer, Lösungen und Reagenzien
1. Abgestufte Ethanole
  Ethanol - 160 ml 200 proof EtOH und 40mL ddH₂O
  Ethanol - 140 ml 200 proof EtOH und 60mL ddH₂O
2. Antigen-Retrieval-Lösung
  10 mM Natriumcitrat, pH 6,0
3. Blockierpuffer
  100 L Serum von Wirtstier, aus dem sekundärer Antikörper hergestellt wurde
  900 l 1X PBS
  Hinweis: Dies ist das Volumen für 10 Abschnitte; das Volumen je nach Bedarf für ca. 100 L Puffer pro Abschnitt anpassen.
4. Waschpuffer (1X PBS)

2. Protokoll

Rehydrierung mit Xylolen und Ethanolen
1. Platzieren Sie Die Folien in einen Folienhalter, und tauchen Sie die Folien in die 100% Xylenisomere-Lösung ein, um sicherzustellen, dass die Folien vollständig mit Lösung abgedeckt sind.
2. Inkubieren Sie Dias in den 100% Xylol-Isomere für 3 min. Wiederholen Sie zweimal für insgesamt 3 separate Inkubationen. Achten Sie darauf, das Schiebegeregal mit einem Papiertuch abzuwischen, bevor Sie auf eine neue Lösung übertragen werden, um Verunreinigungen zu minimieren.
  Hinweis: Es wird empfohlen, diese Inkubationen in drei separaten Behältern durchzuführen.
3. Inkubieren Sie Dias in 100% EtOH für 2 min. Wiederholen Sie zweimal für insgesamt 3 separate Inkubationen.
  Hinweis: Es wird empfohlen, diese Inkubationen in drei separaten Behältern durchzuführen.
4. Inkubieren Sie Dias in 95% EtOH für 2 min.
5. Inkubieren Sie Dias in 80% EtOH für 2 min.
6. Inkubieren Sie Dias in 70% EtOH für 2 min.
7. Inkubieren Sie Dias in 1X PBS für 5 min.
(Optional) Antigen-Retrieval zur Entlarvung von Epitopen, die vom primären Antikörper erkannt werden
Anmerkung 1: Dieses Verfahren ist stark von dem verwendeten Antikörper abhängig, und es wird empfohlen, erste Optimierungsverfahren durchzuführen, um die Anforderung für den Antigenabruf zu bestimmen.
Anmerkung 2: Dieses Verfahren wurde nicht mit der unten gezeigten F4/80-Färbung durchgeführt. Die Anforderung für den Antigenabruf sollte mit jedem neuen Antikörper optimiert werden.
1. Legen Sie Dias in einen hitzebeständigen Kunststoff- oder Glasschieberhalter und stellen Sie sicher, dass das Rack mit Dias gefüllt ist, um eine gleichmäßige Wärmeverteilung zu gewährleisten. Leere Folien können verwendet werden, wenn sich weniger Samples als Steckplätze im Rack befinden.
2. Rack in 1000 ml Antigen-Entlarvungslösung in 2L Becher - 10 ml Antigen-Entlarvung stämmenden Bestand auf 990 ml Wasser legen.
3. Mikrowelle auf hoch für insgesamt 20 Minuten, stellen Sie sicher, dass Die Rutschen mit Wasser bedeckt bleiben.
4. Kühle Rutschen für 20 Minuten im Becher.
5. Gleitträger in Schiebehaltern mit ddH₂O für jeweils 5 min waschen. Wiederholen Sie dies zweimal für insgesamt 3 separate Inkubationen mit frischem ddH₂O jedes Mal. Die Dias können bei jeder Wäsche im selben Diahalter gewaschen werden.
6. Inkubieren Sie Dias in 1X PBS für 5 min.
Kreisabschnitte mit einem Pap-Stift. Dies ermöglicht die Verwendung eines minimalen Volumens von Puffern, die zur Abdeckung der Gewebeabschnitte benötigt werden. Lassen Sie die Gewebeabschnitte nicht austrocknen.
Fügen Sie jedem Abschnitt einen Blockierungspuffer hinzu. Die Menge des Puffers, der für die Abdeckung des Abschnitts benötigt wird, variiert je nach Größe des Abschnitts, kann aber zwischen 25-500 l liegen. Es sollte genügend Puffer verwendet werden, um eine Perle zu bilden, die die gesamte Schnittfläche einschließlich der Kanten abdeckt.
Hinweis: Die Auswahl des Blockierpuffers kann je nach verwendeter Antikörper variieren. Beispielsweise können 10 % Serum des Wirtstiers, in dem der sekundäre Antikörper aufgezogen wurde, verwendet werden, um die unspezifische Bindung des sekundären Antikörpers zu reduzieren (z. B. kann normales Ziegenserum verwendet werden, wenn der sekundäre Antikörper in Ziege aufgebracht wurde). Für jeden primären Antikörper sollte eine Optimierung des Blockierungspuffers durchgeführt werden. Um Brusttumorabschnitte mit F4/80 zu färben, wurde 0,1 ml von 10% normalem Ziegenserum in PBS verwendet.
Inkubieren Sie die Abschnitte im Sperrpuffer in einer befeuchteten Kammer für 1 Stunde bei Raumtemperatur oder 4°C bis zu 24 Stunden. Die befeuchtete Kammer sorgt dafür, dass die Abschnitte nicht austrocknen.
Entfernen Sie den Sperrpuffer, indem Sie ihn von der Folie ablassen. Alternativ kann der Sperrpuffer mit einer Pipette entfernt werden, wobei darauf zu achten ist, den Abschnitt nicht mit der Pipettenspitze zu berühren.
Verdünnen Sie den primären Antikörper im Blockierpuffer.
Hinweis: Die richtige Verdünnung muss für jeden Antikörper- und Probentyp bestimmt werden. Die Optimierung würde die Durchführung einer Reihe von Verdünnungen umfassen, um eine optimale Färbung zu identifizieren. Um Brusttumorabschnitte mit F4/80 zu färben, wurden Gewebeabschnitte über Nacht bei 4°C in 0,1 ml Rattenanti-F4/80-Antikörper verdünnt 1:100 in 1% normalem Ziegenserum in PBS inkubiert.
Fügen Sie den primären Antikörper zu jedem Abschnitt hinzu und inkubieren Sie in einer befeuchteten Kammer bis zu 16 Stunden (über Nacht) bei 4°C. Lassen Sie mindestens einen Abschnitt im Blockierpuffer ohne primären Antikörper als Kontrolle dienen, was dazu beiträgt, die unspezifische Bindung durch den sekundären Antikörper zu identifizieren.
Entleeren Sie den primären Antikörper oder Sperrpuffer aus dem Abschnitt, und waschen Sie Abschnitte mit PBS, indem Sie Dias in das Schiebeträgerlegen und in einen Schiebehalter mit 1x PBS legen. Waschen Sie 3 mal für 10 min jedes Mal.
Verdünnen Sie den sekundären Antikörper 1:200 im Blockierpuffer. Die Verdünnung kann je nach Sekundärantikörper optimiert werden.
Fügen Sie den sekundären Antikörper zu allen Abschnitten hinzu, einschließlich der Steuerung, und brüten Sie 1 Stunde lang in einer befeuchteten Kammer, die vor Licht geschützt ist.
Den sekundären Antikörper von den Abschnitten abtropfen lassen und jedes Mal 10 min in PBS waschen.
Fügen Sie den Dias 2-3 Tropfen Montagemedien mit DAPI hinzu und legen Sie einen Deckzettel auf die Proben. Wenn es sich bei dem Montagemedium nicht um ein schnell trocknendes Medium handelt, kann es notwendig sein, die Ränder des Schlittens mit geschmolzenem Paraffinwachs oder Fingernagellack zu versiegeln, um Leckagen zu verhindern und die Proben langfristig zu halten.
Lassen Sie die Dias über Nacht im Dunkeln trocknen und stellen Sie die Abschnitte mit einem Fluoreszenzmikroskop ab.

3. Datenanalyse und Ergebnisse

Gefärbte Abschnitte werden mit einem Fluoreszenzmikroskop analysiert. Die spezifischen Details der Bildaufnahme und -analyse hängen von den Spezifikationen des Mikroskops und der Software ab, die für die Analyse verwendet wird. In der Regel können Bilder als einfarbige Bilder aufgenommen und überlappend gemacht werden, um mehrfarbige Bilder zu erzeugen. Prozentpositive Zellen können quantifiziert werden, indem die Anzahl der positiv gefärbten Zellen gezählt und durch die Gesamtzahl der DAPI-gefärbten Zellen innerhalb eines Abschnitts dividiert wird. Für F4/80-Färbung von Brusttumorabschnitten wurden mit der Software Leica Application Suite, Version 3.8, unter der Registerkarte Acquire und im Bild-Overlay-Erfassungsmodus DAPI und RFP aktiviert. Exposure, Gain und Gamma wurden angepasst (20,0 ms, 1,0x bzw. 1,53 für DAPI und 944,2 ms, 1,0x bzw. 1,08 für RFP), obwohl dies zwischen den Experimenten variiert. Die Schaltfläche Overlay erfassen wurde verwendet, um Overlay-Bilder der DAPI- und RFP-Belichtungen zu erstellen.
Das Bild unten (Abbildung 1) zeigt ein Beispiel-Immunfluoreszenzbild eines mit F4/80 gebeizten Tumorabschnitts, der ein Antigen an Makrophagen und anderen myeloiden Zellen erkennt. Der Abschnitt wurde mit DAPI-haltigen Montagemedien montiert und die Kerne sind blau dargestellt.

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Quelle: Thomas Chaffee¹, Thomas S. Griffith^2,3,4, und Kathryn L. Schwertfeger^1,3,4
¹ Institut für Labormedizin und Pathologie, University of Minnesota,…