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Immunfluoreszenzmikroskopie: Immunfluoreszenzfärbung paraffin-embedded Tissue Sections

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Immunology

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Immunofluorescence Microscopy: Immunofluorescence Staining of Paraffin-Embedded Tissue Sections

5.6: Antibody Generation: Producing Monoclonal Antibodies Using Hybridomas

5.8: Confocal Fluorescence Microscopy: A Technique to Determine the Localization of Proteins in Mouse Fibroblasts

53,535 Views

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09:56 min

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April 30, 2023

Overview

Quelle: Thomas Chaffee¹, Thomas S. Griffith^2,3,4, und Kathryn L. Schwertfeger^1,3,4
¹ Institut für Labormedizin und Pathologie, University of Minnesota, Minneapolis, MN 55455
² Department of Urology, University of Minnesota, Minneapolis, MN 55455
³ Freimaurerkrebszentrum, University of Minnesota, Minneapolis, MN 55455
⁴ Zentrum für Immunologie, University of Minnesota, Minneapolis, MN 55455

Pathologische Analysen von Gewebeabschnitten können verwendet werden, um ein besseres Verständnis der normalen Gewebestruktur zu erhalten und zu unserem Verständnis von Krankheitsmechanismen beizutragen. Gewebebiopsien, entweder von Patienten oder aus experimentellen In-vivo-Modellen, werden oft durch Fixierung in Formalin oder Paraformaldehyd und Einbettung in Paraffinwachs konserviert. Dies ermöglicht eine langfristige Lagerung und die Verteilung des Gewebes. Gewebe werden mit einem Mikrotome in dünne Abschnitte (5 m) geschnitten und die Abschnitte auf Glasgletten verkleben. Die Gewebeabschnitte können mit Antikörpern gefärbt werden, die den Nachweis bestimmter Proteine innerhalb der Gewebeabschnitte ermöglichen. Färbung mit Antikörpern, die mit Fluorophoren konjugiert sind (auch als Fluorchrome bekannt) – Verbindungen, die Licht bei bestimmten Wellenlängen emittieren, wenn sie von einem Laser angeregt werden – wird als Immunfluoreszenz bezeichnet. Die Fähigkeit, Proteine innerhalb eines Abschnitts zu erkennen, kann Informationen wie Die heterogenität der Zelltypen im Gewebe, die Aktivierung bestimmter Signalwege und die Expression von Biomarkern liefern. Je nach verwendetem Fluorophor und Art des für die Analyse verfügbaren Mikroskops können mehrere Farben verwendet werden, was eine Multiplexanalyse von Zielen ermöglicht.

Das folgende Protokoll beschreibt die grundlegenden Schritte bei der Immunfluoreszenzfärbung von Paraffin-eingebetteten Gewebeabschnitten. Es ist wichtig zu beachten, dass dieses Protokoll keine Details über die Fixierung von Gewebe, den Prozess der Paraffineinbettung oder das Teilen des Gewebes enthalten wird. Nachdem Gewebe geschnitten und auf Glasrutschen platziert wurden, werden sie durch eine Reihe von abgestuften Ethanol -Inkubationen (EtOH) rehydriert. Die Abschnitte werden mit einem blockierenden Reagenz inkubiert, um die unspezifische Bindung von Antikörpern an den Gewebeabschnitt zu reduzieren. Die Abschnitte werden dann mit einem primären Antikörper inkubiert, der direkt mit einem Fluorophor beschriftet werden kann oder auch nicht. Wenn der primäre Antikörper nicht direkt beschriftet ist, werden die Abschnitte mit einem sekundären Antikörper beziffert, der mit einem Fluorophor gekennzeichnet ist. Verschiedene Antikörper können unterschiedliche Färbebedingungen erfordern, daher sind Vorschläge zur Optimierung von Antikörpern enthalten. Nach dem Waschen, um alle ungebundenen Antikörper zu entfernen, werden die Dias mit Medien montiert, die DAPI enthalten, um den Kern fluoreszierend zu kennzeichnen. Sobald das Montagemedium getrocknet ist, können die Dias mit einem Mikroskop mit Lasern abgebildet werden, die die verschiedenen Fluorophore erkennen können.

Procedure

1. Einrichtung

Das typische Färbeprotokoll umfasst die folgenden Schritte:
1. Rehydratisierung der Gewebeabschnitte auf den Dias mit einer Reihe von abgestuften Ethanolen.
2. Inkubation der Gewebeabschnitte mit einem Sperrpuffer, der dazu beiträgt, die unspezifische Bindung von Antikörpern an das Gewebe zu blockieren und die Hintergrundfluoreszenz zu reduzieren.
3. Entfernen des Sperrpuffers und Inkubation des Abschnitts im primären Antikörper, zu diesem Zeitpunkt bindet der Antikörper sein Peptidziel.
4. Entfernen des primären Antikörpers und Waschen der Abschnitte ausgiebig im Waschpuffer.
5. Inkubation der Abschnitte mit sekundärem Antikörper, um eine Bindung an primärer Antikörper zu ermöglichen, wenn der primäre Antikörper nicht direkt mit einem Fluorophor gekennzeichnet ist und ein sekundärer Antikörper erforderlich ist.
6. Waschen des sekundären Antikörpers von den Dias.
7. Montage der Dias in Montagemedien und Trocknen vor der Visualisierung auf einem Fluoreszenzmikroskop.
Folgende Gegenstände werden benötigt: Gleithalter (Glas oder Kunststoff), Gläser, Pipetten, Pap-Stift, feuchte Kammer, Deckelscheine und Montagemedien mit DAPI.
Xylol wird zur Rehydrierung von Dias verwendet. Xylol ist gefährlich und sollte in einer Dunstabzugshaube zusammen mit geeigneten PSA, einschließlich Handschuhen und einem Labormantel, verwendet werden.
Rezepte für Puffer, Lösungen und Reagenzien
1. Abgestufte Ethanole
  Ethanol – 160 ml 200 proof EtOH und 40mL ddH₂O
  Ethanol – 140 ml 200 proof EtOH und 60mL ddH₂O
2. Antigen-Retrieval-Lösung
  10 mM Natriumcitrat, pH 6,0
3. Blockierpuffer
  100 L Serum von Wirtstier, aus dem sekundärer Antikörper hergestellt wurde
  900 l 1X PBS
  Hinweis: Dies ist das Volumen für 10 Abschnitte; das Volumen je nach Bedarf für ca. 100 L Puffer pro Abschnitt anpassen.
4. Waschpuffer (1X PBS)

2. Protokoll

Rehydrierung mit Xylolen und Ethanolen
1. Platzieren Sie Die Folien in einen Folienhalter, und tauchen Sie die Folien in die 100% Xylenisomere-Lösung ein, um sicherzustellen, dass die Folien vollständig mit Lösung abgedeckt sind.
2. Inkubieren Sie Dias in den 100% Xylol-Isomere für 3 min. Wiederholen Sie zweimal für insgesamt 3 separate Inkubationen. Achten Sie darauf, das Schiebegeregal mit einem Papiertuch abzuwischen, bevor Sie auf eine neue Lösung übertragen werden, um Verunreinigungen zu minimieren.
  Hinweis: Es wird empfohlen, diese Inkubationen in drei separaten Behältern durchzuführen.
3. Inkubieren Sie Dias in 100% EtOH für 2 min. Wiederholen Sie zweimal für insgesamt 3 separate Inkubationen.
  Hinweis: Es wird empfohlen, diese Inkubationen in drei separaten Behältern durchzuführen.
4. Inkubieren Sie Dias in 95% EtOH für 2 min.
5. Inkubieren Sie Dias in 80% EtOH für 2 min.
6. Inkubieren Sie Dias in 70% EtOH für 2 min.
7. Inkubieren Sie Dias in 1X PBS für 5 min.
(Optional) Antigen-Retrieval zur Entlarvung von Epitopen, die vom primären Antikörper erkannt werden
Anmerkung 1: Dieses Verfahren ist stark von dem verwendeten Antikörper abhängig, und es wird empfohlen, erste Optimierungsverfahren durchzuführen, um die Anforderung für den Antigenabruf zu bestimmen.
Anmerkung 2: Dieses Verfahren wurde nicht mit der unten gezeigten F4/80-Färbung durchgeführt. Die Anforderung für den Antigenabruf sollte mit jedem neuen Antikörper optimiert werden.
1. Legen Sie Dias in einen hitzebeständigen Kunststoff- oder Glasschieberhalter und stellen Sie sicher, dass das Rack mit Dias gefüllt ist, um eine gleichmäßige Wärmeverteilung zu gewährleisten. Leere Folien können verwendet werden, wenn sich weniger Samples als Steckplätze im Rack befinden.
2. Rack in 1000 ml Antigen-Entlarvungslösung in 2L Becher – 10 ml Antigen-Entlarvung stämmenden Bestand auf 990 ml Wasser legen.
3. Mikrowelle auf hoch für insgesamt 20 Minuten, stellen Sie sicher, dass Die Rutschen mit Wasser bedeckt bleiben.
4. Kühle Rutschen für 20 Minuten im Becher.
5. Gleitträger in Schiebehaltern mit ddH₂O für jeweils 5 min waschen. Wiederholen Sie dies zweimal für insgesamt 3 separate Inkubationen mit frischem ddH₂O jedes Mal. Die Dias können bei jeder Wäsche im selben Diahalter gewaschen werden.
6. Inkubieren Sie Dias in 1X PBS für 5 min.
Kreisabschnitte mit einem Pap-Stift. Dies ermöglicht die Verwendung eines minimalen Volumens von Puffern, die zur Abdeckung der Gewebeabschnitte benötigt werden. Lassen Sie die Gewebeabschnitte nicht austrocknen.
Fügen Sie jedem Abschnitt einen Blockierungspuffer hinzu. Die Menge des Puffers, der für die Abdeckung des Abschnitts benötigt wird, variiert je nach Größe des Abschnitts, kann aber zwischen 25-500 l liegen. Es sollte genügend Puffer verwendet werden, um eine Perle zu bilden, die die gesamte Schnittfläche einschließlich der Kanten abdeckt.
Hinweis: Die Auswahl des Blockierpuffers kann je nach verwendeter Antikörper variieren. Beispielsweise können 10 % Serum des Wirtstiers, in dem der sekundäre Antikörper aufgezogen wurde, verwendet werden, um die unspezifische Bindung des sekundären Antikörpers zu reduzieren (z. B. kann normales Ziegenserum verwendet werden, wenn der sekundäre Antikörper in Ziege aufgebracht wurde). Für jeden primären Antikörper sollte eine Optimierung des Blockierungspuffers durchgeführt werden. Um Brusttumorabschnitte mit F4/80 zu färben, wurde 0,1 ml von 10% normalem Ziegenserum in PBS verwendet.
Inkubieren Sie die Abschnitte im Sperrpuffer in einer befeuchteten Kammer für 1 Stunde bei Raumtemperatur oder 4°C bis zu 24 Stunden. Die befeuchtete Kammer sorgt dafür, dass die Abschnitte nicht austrocknen.
Entfernen Sie den Sperrpuffer, indem Sie ihn von der Folie ablassen. Alternativ kann der Sperrpuffer mit einer Pipette entfernt werden, wobei darauf zu achten ist, den Abschnitt nicht mit der Pipettenspitze zu berühren.
Verdünnen Sie den primären Antikörper im Blockierpuffer.
Hinweis: Die richtige Verdünnung muss für jeden Antikörper- und Probentyp bestimmt werden. Die Optimierung würde die Durchführung einer Reihe von Verdünnungen umfassen, um eine optimale Färbung zu identifizieren. Um Brusttumorabschnitte mit F4/80 zu färben, wurden Gewebeabschnitte über Nacht bei 4°C in 0,1 ml Rattenanti-F4/80-Antikörper verdünnt 1:100 in 1% normalem Ziegenserum in PBS inkubiert.
Fügen Sie den primären Antikörper zu jedem Abschnitt hinzu und inkubieren Sie in einer befeuchteten Kammer bis zu 16 Stunden (über Nacht) bei 4°C. Lassen Sie mindestens einen Abschnitt im Blockierpuffer ohne primären Antikörper als Kontrolle dienen, was dazu beiträgt, die unspezifische Bindung durch den sekundären Antikörper zu identifizieren.
Entleeren Sie den primären Antikörper oder Sperrpuffer aus dem Abschnitt, und waschen Sie Abschnitte mit PBS, indem Sie Dias in das Schiebeträgerlegen und in einen Schiebehalter mit 1x PBS legen. Waschen Sie 3 mal für 10 min jedes Mal.
Verdünnen Sie den sekundären Antikörper 1:200 im Blockierpuffer. Die Verdünnung kann je nach Sekundärantikörper optimiert werden.
Fügen Sie den sekundären Antikörper zu allen Abschnitten hinzu, einschließlich der Steuerung, und brüten Sie 1 Stunde lang in einer befeuchteten Kammer, die vor Licht geschützt ist.
Den sekundären Antikörper von den Abschnitten abtropfen lassen und jedes Mal 10 min in PBS waschen.
Fügen Sie den Dias 2-3 Tropfen Montagemedien mit DAPI hinzu und legen Sie einen Deckzettel auf die Proben. Wenn es sich bei dem Montagemedium nicht um ein schnell trocknendes Medium handelt, kann es notwendig sein, die Ränder des Schlittens mit geschmolzenem Paraffinwachs oder Fingernagellack zu versiegeln, um Leckagen zu verhindern und die Proben langfristig zu halten.
Lassen Sie die Dias über Nacht im Dunkeln trocknen und stellen Sie die Abschnitte mit einem Fluoreszenzmikroskop ab.

3. Datenanalyse und Ergebnisse

Gefärbte Abschnitte werden mit einem Fluoreszenzmikroskop analysiert. Die spezifischen Details der Bildaufnahme und -analyse hängen von den Spezifikationen des Mikroskops und der Software ab, die für die Analyse verwendet wird. In der Regel können Bilder als einfarbige Bilder aufgenommen und überlappend gemacht werden, um mehrfarbige Bilder zu erzeugen. Prozentpositive Zellen können quantifiziert werden, indem die Anzahl der positiv gefärbten Zellen gezählt und durch die Gesamtzahl der DAPI-gefärbten Zellen innerhalb eines Abschnitts dividiert wird. Für F4/80-Färbung von Brusttumorabschnitten wurden mit der Software Leica Application Suite, Version 3.8, unter der Registerkarte Acquire und im Bild-Overlay-Erfassungsmodus DAPI und RFP aktiviert. Exposure, Gain und Gamma wurden angepasst (20,0 ms, 1,0x bzw. 1,53 für DAPI und 944,2 ms, 1,0x bzw. 1,08 für RFP), obwohl dies zwischen den Experimenten variiert. Die Schaltfläche Overlay erfassen wurde verwendet, um Overlay-Bilder der DAPI- und RFP-Belichtungen zu erstellen.
Das Bild unten (Abbildung 1) zeigt ein Beispiel-Immunfluoreszenzbild eines mit F4/80 gebeizten Tumorabschnitts, der ein Antigen an Makrophagen und anderen myeloiden Zellen erkennt. Der Abschnitt wurde mit DAPI-haltigen Montagemedien montiert und die Kerne sind blau dargestellt.

Die Funktion eines Proteins in einer Zelle hängt weitgehend von seiner richtigen Lokalisierung innerhalb der Zelle ab. Die Immunfluoreszenzmikroskopie ist eine Methode, mit der ein Protein in Zellen mit Fluoreszenzfarbstoffen visualisiert werden kann. Ein Fluoreszenzfarbstoff ist ein Fluorophor, d. h. ein Molekül, das Lichtenergie bei einer bestimmten Wellenlänge durch einen Prozess namens Anregung absorbiert und dann sofort die Energie bei einer anderen Wellenlänge, der sogenannten Emission, abgibt.

Fluoreszierende Farbstoffe werden zu einem zielspezifischen Antikörper konjugiert und durch Immunfärbung in kultivierte Zellen oder Gewebe eingeführt. Wenn dieser primäre Antikörper an das Protein von Interesse bindet, wird das Protein mit dem Fluoreszenzfarbstoff gekennzeichnet. Alternativ kann der Fluoreszenzfarbstoff anstelle des primären Antikörpers zu einem sekundären Antikörper konjugiert werden, und der sekundäre Antikörper bindet an den Protein-Primärantikörperkomplex, um das Ziel zu kennzeichnen. Danach wird die Probe in einem Antifade-Montagemedium versiegelt, um die Fluoreszenz-Etikettierung zu erhalten, und ist dann bereit für die Bildgebung auf einem Fluoreszenzmikroskop.

Ein Fluoreszenzmikroskop ist mit einer leistungsstarken Lichtquelle ausgestattet. Der Lichtstrahl durchläuft zunächst einen Anregungsfilter, der nur das Licht an der Anregungswellenlänge passieren lässt. Das Anregungslicht erreicht dann einen speziellen Spiegel, einen sogenannten dichroitischen Spiegel oder einen Strahlsplitter, der die Anregungswellenlänge selektiv in Richtung einer Objektivlinse reflektiert. Die Linse fokussiert das Licht dann auf einen kleinen Bereich in der Probe. Beim Erreichen der Probe erregt das Licht die Fluorophore, die dann die Lichtenergie bei einer anderen Wellenlänge abgeben. Dieses Licht wird durch die Objektivlinse zurück zum dichroitischen Spiegel übertragen. Da sich die Emissionswellenlänge von der Anregungswellenlänge unterscheidet, lässt der dichroitische Spiegel das Emissionslicht passieren. Dann geht es durch einen zweiten Filter, den sogenannten Emissionsfilter, der Licht von allen anderen Wellenlängen eliminiert, die vorhanden sein können. Danach erreichen die Lichtstrahlen nun das Okular oder die Kamera, wo sie ein vergrößertes Bild präsentieren, das aus dem emittierten Licht aus den spezifischen Fluorophoren erzeugt wird. Dieses Bild stellt die Position des Proteins dar, das in der Zelle von Interesse ist.

DNA-bindende Fluoreszenzfarbstoffe werden häufig zusammen mit Immunostainierung verwendet, um Kerne als Bezugspunkt innerhalb der Zellen zu kennzeichnen. Mehrere verschiedene Fluorophore mit unterschiedlichen Anregungsemissionswellenlängen können für verschiedene Proteine innerhalb derselben Probe verwendet werden, um die Lokalisation der Proteine zu vergleichen.

Dieses Video zeigt das Verfahren zur immunfluoreszenten Färbung eines Proteins von Interesse in einer Gewebeprobe, gefolgt von der Abbildung der Probe auf einem Fluoreszenzmikroskop.

Bevor der Färbevorgang begonnen wird, müssen die Abschnitte, die während des Einbettungsprozesses dehydriert wurden, rehydriert werden. Um dies zu tun, legen Sie zuerst die Dias in einen Diahalter und tauchen Sie dann die Dias vollständig in 100% Xlene-Isomer ein. Lassen Sie die Folien drei Minuten lang inkubieren. Dann entfernen Sie die Rutschen aus dem Behälter, wischen Sie überschüssiges Xylol mit einem Papiertuch ab und legen Sie sie in ein neues Xylolbad in einen frischen Behälter, für weitere drei Minuten. Wiederholen Sie diese Inkubation jedes Mal in einem neuen Behälter mit frischem Xylol und wischen Sie die Dias mit Papiertüchern ab, bevor Sie in den neuen Behälter überführen, für insgesamt drei Inkubationen. Als nächstes inkubieren Sie die Abschnitte in einer Reihe von abgestuften Ethanol-Lösungen, beginnend mit 100% Ethanol für zwei Minuten. Wischen Sie das Schiebegestell mit einem Papiertuch ab und übertragen Sie die Dias für weitere zwei Minuten in einen neuen Behälter mit 100 % Ethanol. Setzen Sie den Zyklus des Waschens, Wischen überschüssiges Ethanol mit einem Papiertuch, und die Übertragung der Rutschen in ein neues Bad, nach den angegebenen Konzentrationen von Ethanol für die angegebene Zeit. Nach dem letzten Ethanolwaschen die überschüssige Lösung abschütteln und die Dias in 1X PBS für fünf Minuten inkubieren.

Um den Färbungsprozess zu beginnen, kreisen Sie zunächst die Abschnitte mit einem PAP-Stift, um den minimalen Bereich zu identifizieren, den die Puffer abdecken müssen. Sobald die Abschnitte auf der Folie deutlich markiert sind, fügen Sie jedem Dia 100 Mikroliter Blockierpuffer hinzu, um sicherzustellen, dass die gesamte Abschnittsoberfläche abgedeckt ist. Nachdem die Gewebe mit einem Sperrpuffer bedeckt sind, legen Sie die Dias in eine befeuchtete Kammer. Lassen Sie die Dias für eine Stunde bei Raumtemperatur inkubieren.

Entfernen Sie den Sperrpuffer nach der gewünschten Inkubationszeit, indem Sie ihn von der Folie ablassen. Verdünnen Sie als Nächstes den primären Antikörper im Blockierpuffer. Für eine Verdünnung von 1:100 990 Mikroliter Blockierpuffer zu einem 1,5 Milliliter Zentrifugenrohr hinzufügen, gefolgt von 10 Mikrolitern des primären Antikörpers an ein und demselben Rohr. Beschriften Sie eine Folie als Steuerelement, und fügen Sie dann 100 Mikroliter Blockierpuffer hinzu. Diese Kontrolle wird dazu beitragen, eine nicht spezifische Bindung des sekundären Antikörpers zu identifizieren. Fügen Sie nun 100 Mikroliter primärer Antikörperpuffer zu den verbleibenden Folien hinzu. Inkubieren Sie die Abschnitte über Nacht in einer befeuchteten Kammer bei vier Grad Celsius, im Dunkeln.

Entfernen Sie nach der nächtlichen Inkubation die Abschnitte aus der Kammer und entleeren Sie den primären Antikörper von jedem Schlitten und den Blockierpuffer von der Steuerung. Legen Sie die Dias in ein Schieberegal und waschen Sie sie dann dreimal in 1X PBS für jeweils zehn Minuten. Während die Dias in 1X PBS waschen, verdünnen Sie den sekundären Antikörper im Sperrpuffer. Für eine Verdünnung von 1:200 995 Mikroliter Sperrpuffer zu einem 1,5 Milliliter-Rohr hinzufügen, gefolgt von fünf Mikrolitern des sekundären Antikörpers an ein und demselben Rohr. Fügen Sie den sekundären Antikörper zu allen Abschnitten, einschließlich der Steuerung, hinzu und inkubieren Sie sie für eine Stunde in einer befeuchteten Kammer, die vor Licht geschützt ist. Wenn der Timer ertönt, entfernen Sie die Folien aus dem Inkubator. Entleeren Sie den sekundären Antikörper von den Abschnitten. Sobald der sekundäre Antikörper entfernt wurde, legen Sie die Dias in ein Dia-Rack und tauchen Sie die Dias dann für 10 Minuten vollständig in 1X PBS ein, geschützt vor Licht. Wiederholen Sie diese Wäsche dreimal, mit frischen 1X PBS für jede Wäsche. Fügen Sie nach dem Einwaschzwei bis drei Tropfen Montagemedien, die DAPI enthalten, zu jedem Dia hinzu und legen Sie einen Glasdeckel auf die Proben. Lassen Sie die Dias über Nacht an einem dunklen Ort trocknen, bevor Sie die Abschnitte mit einem fluoreszierenden Bereich bebildern.

Während der Bildgebung hängen die Details der Bildaufnahme vom jeweiligen Mikroskop und der verfügbaren Software ab. In diesem speziellen Beispiel jedoch die Software Leica Application Suite, Version 3. 8, wird verwendet, um die Analyse durchzuführen. Klicken Sie mit diesem Programm auf die Registerkarte “Erwerben” und aktivieren Sie im Modus Bild-Overlay-Erfassung sowohl DAPI als auch RFP. Passen Sie als Nächstes belichtung, Gain und Gamma für DAPI und RFP an, indem Sie eine Initiale mit den von der Software definierten Standardeinstellungen vornehmen und dann die Helligkeit optimieren, indem Sie die Belichtungszeit und die Verstärkung ändern, wobei zu berücksichtigen ist, dass minimale optimale Einstellungen bildsättigung und Photobleichung der Proben zu vermeiden. Gamma kann geändert werden, um dunklere Bereiche eines Bildes zu optimieren.

Sobald die Einstellungen angepasst wurden, drücken Sie die Schaltfläche Overlay erfassen, um Overlay-Bilder der DAPI- und RFP-Belichtungen zu erstellen. Dieses Mit der demonstrierten Technik aufgenommene Beispielbild zeigt einen Maus-Brusttumorabschnitt, der mit dem Antikörper F4/80 befleckt ist und ein rot dargestelltes Antigen auf Makrophagen und anderen myeloischen Zellen erkennt. Da DAPI-haltige Montagemedien verwendet wurden, werden Kerne blau dargestellt. Die Daten aus der Bildgebung liefern Informationen über die Intensität und Lokalisierung des Proteins innerhalb des Gewebeabschnitts.

Im Bild des mit F4/80 gebeizten Tumors wird beispielsweise die Zelloberflächenfärbung dieses Antigens beobachtet. Diese Daten können auch Informationen über die Häufigkeit bestimmter Zellpopulationen innerhalb des Gewebeabschnitts liefern. Dies kann quantifiziert werden, indem die Anzahl der positiv gefärbten Zellen, hier rot dargestellt, gezählt und mit der gesamten Zellpopulation verglichen wird, die blau dargestellt ist, und die Häufigkeit mit der folgenden Gleichung berechnet.

Results

Abbildung 1:F4/80 Färbung eines Brusttumorabschnitts. Nach der Fixierung wurde ein Maus-Mammary-Tumor mit Anti-F4/80 geschnitten und gebeizt und mit einem DAPI-haltigen Montagemedium montiert. Die Färbung wird durch die Zelloberfläche F4/80 Färbung in Rot gezeigt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Die aus der Bildgebung gewonnenen Daten werden Informationen über die Intensität und Lokalisierung der Expression des Proteins von Interesse innerhalb des Gewebeabschnitts liefern. Je nach untersuchtem Protein könnten diese Daten auch Informationen über die Häufigkeit bestimmter Zellpopulationen innerhalb des Gewebeabschnitts liefern. Dies kann quantifiziert werden, indem die Anzahl der positiv gefärbten Zellen gezählt und mit der Gesamtzellpopulation verglichen wird.

Applications and Summary

Die Immunfluoreszenz ermöglicht die Untersuchung der Proteinexpression und -lokalisation im Rahmen eines Gewebeabschnitts. Diese Technik kann verwendet werden, um zu verstehen, wie sich Gewebe im Kontext von Krankheiten verändern, indem die Proteinlokalisierung oder die Zellzahl in normalen und kranken Geweben untersucht wird. Änderungen in der Lokalisierung oder in Ausdrucksmustern können bestimmt und mit bestimmten Attributen der Stichproben verknüpft werden.

References

Im K, Mareninov S., Diaz MFP, Yong WH. An Introduction to Performing Immunofluorescence Staining. Yong W. (eds) Biobanking. Methods in Molecular Biology. 1897, Humana Press, New York, NY (2019)
Ramos-Vara JA. Principles and Methods of Immunohistochemistry. Gautier JC. (eds) Drug Safety Evaluation. Methods in Molecular Biology. 1641, Humana Press, New York, NY (2017)
Donaldson JG. Immunofluorescence Staining. Current protocols in Cell Biology. 69 (1):1 4.3.1-4.3.7. (2015)

Transcript

The function of a protein in a cell is largely dependent on its proper localization within the cell. Immunofluorescence microscopy is a method by which a protein can be visualized inside cells using fluorescent dyes. A fluorescent dye is a fluorophore, that is a molecule that absorbs light energy at a specific wavelength by a process called excitation, and then immediately releases the energy at a different wavelength, known as emission.

Fluorescent dyes are conjugated to a target-specific antibody and introduced into cultured cells or tissue by immunostaining. When this primary antibody binds to the protein of interest, the protein gets labeled with the fluorescent dye. Alternatively, the fluorescent dye can be conjugated to a secondary antibody, instead of the primary antibody, and the secondary antibody binds to the protein primary antibody complex to label the target. After that, the sample is sealed in an antifade mounting medium to preserve the fluorescence labeling and is then ready for imaging on a fluorescence microscope.

A fluorescence microscope is equipped with a powerful light source. The light beam first passes through an excitation filter, which allows only the light at the excitation wavelength to pass through. The excitation light then reaches a specialized mirror, called a dichroic mirror or a beam splitter, which is designed to selectively reflect the excitation wavelength towards an objective lens. The lens then focuses the light onto a small region in the sample. Upon reaching the sample, the light excites the fluorophores, which then emit the light energy at a different wavelength. This light is transmitted back through the objective lens to the dichroic mirror. Since the emission wavelength is different from the excitation wavelength, the dichroic mirror allows the emission light to pass through. Then, it goes through a second filter, called the emission filter, which eliminates light from any other wavelengths that may be present. After that, the light rays now reach the eyepiece or camera, where they present a magnified image created from the emitted light from the specific fluorophores. This image represents the location of the protein of interest within the cell.

DNA binding fluorescent dyes are often used along with immunostaining to label nuclei as a point of reference within the cells. Multiple different fluorophores, with different excitation emission wavelengths, can be used for different proteins within the same sample to compare localization of the proteins.

This video demonstrates the procedure for immunofluorescent staining of a protein of interest in a tissue sample followed by imaging the sample on a fluorescence microscope.

Before beginning the staining process, the sections, which were dehydrated during the embedding process, need to be rehydrated. To do this, first, place the slides into a slide holder and then completely submerge the slides in 100% Xlene isomers. Allow the slides to incubate for three minutes. Then, remove the slides from the container, wipe off any excess Xylene with a paper towel, and place them into a new Xylene bath in a fresh container, for a further three minutes. Repeat this incubation each time in a new container with fresh Xylene and wiping down the slides with paper towels before transferring to the new container, for a total of three incubations. Next, incubate the sections in a series of graded ethanol solutions, starting with 100% ethanol for two minutes. Wipe off the slide rack with a paper towel, and transfer the slides to a new container of 100% ethanol for another two minutes. Continue the cycle of washing, wiping excess ethanol with a paper towel, and transferring the slides to a new bath, following the indicated concentrations of ethanol for the specified time. After the final ethanol wash, shake off the excess solution and incubate the slides in 1X PBS for five minutes.

To begin the staining process, first, circle the sections with a PAP pen to identify the minimal area that the buffers need to cover. Once the sections are clearly marked on the slide, add 100 microliters of blocking buffer to each slide, making sure to cover the entire section surface. After the tissues are covered in blocking buffer, place the slides in a humidified chamber. Leave the slides to incubate for one hour at room temperature.

Following the desired incubation time, remove the blocking buffer by draining it off the slide. Next, dilute the primary antibody in blocking buffer. For a 1:100 dilution, add 990 microliters of blocking buffer to a 1.5 milliliter centrifuge tube, followed by 10 microliters of the primary antibody to the same tube. Label one slide as a control and then add 100 microliters of blocking buffer. This control will help identify any non-specific binding of the secondary antibody. Now, add 100 microliters of primary antibody buffer to the remaining slides. Incubate the sections overnight in a humidified chamber at four degrees celsius, in the dark.

Following the overnight incubation, remove the sections from the chamber and drain the primary antibody off each slide and the blocking buffer from the control. Place the slides into a slide rack and then wash them three times in 1X PBS for ten minutes each. While the slides are washing in 1X PBS, dilute the secondary antibody in blocking buffer. For a 1:200 dilution, add 995 microliters of blocking buffer to a 1.5 milliliter tube, followed by five microliters of the secondary antibody to the same tube. Add the secondary antibody to all of the sections, including the control, and incubate them for one hour in a humidified chamber protected from light. When the timer sounds, remove the slides from the incubator. Drain the secondary antibody off the sections. Once the secondary antibody is removed, place the slides in a slide rack and then completely submerge the slides in 1X PBS for 10 minutes, protected from light. Repeat this wash three times, using fresh 1X PBS for each wash. Following the washes, add two to three drops of mounting media containing DAPI to each slide and place a glass coverslip on the samples. Allow the slides to dry overnight in a dark place before imaging the sections using a fluorescent scope.

During imaging, the details of image capture will depend upon the specific microscope and software available. However, in this particular example, the software Leica Application Suite, Version 3. 8, is used to perform the analysis. Using this program, click on the Acquire tab and in Image Overlay Acquisition mode, enable both DAPI and RFP. Next, adjust the Exposure, Gain, and Gamma for both DAPI and RFP, by taking an initial using the default settings defined by the software, and then optimizing for brightness by modifying the exposure time and the gain, keeping in mind that minimal optimal settings are desirable to avoid image saturation and photobleaching of the samples. Gamma can be modified to optimize darker areas of an image.

Once the settings are adjusted, press the Acquire Overlay button to create overlay images of the DAPI and RFP exposures. This example image, captured using the demonstrated technique, shows a mouse mammary tumor section, stained with the antibody F4/80, which detects an antigen, depicted in red, on macrophages and other myeloid cells. Since DAPI-containing mounting media was used, nuclei are shown in blue. The data from the imaging will provide information regarding the intensity and localization of the protein within the tissue section.

For example, in the image of the tumor stained with F4/80, cell surface staining of this antigen is observed. These data can also provide information regarding the frequency of specific cell populations within the tissue section. This can be quantified by counting the number of positively stained cells, here shown in red, and comparing that with the total cell population, shown in blue, and calculating the frequency using the following equation.

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