A Magnetic Tether System zur visuellen und olfaktorischen Mediated Flight Control in Drosophila Untersuchen

Das wachsende Forschungsfeld der Joof-Olfaktion hat zunehmend anspruchsvolle Verhaltensassays motiviert, wie beispielsweise die olfaktorische magnetische Haltevorrichtung oder OMT. Bei diesem Verfahren wird der dorsale Thorax der Fliege auf einen Mnuchin-Pin geklebt. Die Fliege wird dann in einem Winkel von 30 Grad mit dem Pin in geeignetem Neigungswinkel zwischen zwei Dauermagneten aus Seltenen Erden ausgerichtet.

Wenn dies korrekt durchgeführt wird, ergibt sich ein freier Bewegungsspielraum. Anschließend wird eine Duftstofföffnung ausgerichtet, um einen Strom zu erzeugen, der gleichmäßig von der Abgabedüse über den Kopf der Fliege in die Vakuumkammer strömt. Anschließend wird die Fähigkeit der Fliege, den Duftstoff zu lokalisieren, in Gegenwart visueller Reize getestet.

Hallo, ich bin Brian DeMars aus dem Labor von Dr. Mark Fry am Department für Physiologische Wissenschaften der University of California Los Angeles. Heute zeigen wir Ihnen, wie man Fliegen für die Verwendung in einer olfaktorischen magnetischen Halterung befestigt. Außerdem zeigen wir Ihnen, wie man die Magnete und Duftöffnungen ausrichtet und die Massendurchflussraten für das Duftzufuhrsystem einstellt.

Wir verwenden dieses Verfahren in unserem Labor, um die visuell und olfaktorisch vermittelte Flugsteuerung bei Fruchtfliegen zu untersuchen. Beginnen wir also. Zum Starten des Anbindens sammeln Sie Fliegen vier bis sechs Tage nach ELOs und entziehen ihnen vier bis sechs Stunden lang Nahrung.

In einem Futtergefäße mit einem feuchten Kim-Tuch zur Verhinderung der Austrocknung anschließend überführen. Eine Charge markierter Fliegen in ein kleines Gefäß, das in einen Messingblock auf einer Peltier-Kühlstufe, die auf vier Grad Celsius eingestellt ist, eingeführt wurde. Bei dieser Temperatur werden sich die Fliegen innerhalb von etwa 30 Sekunden betäuben.

Legen Sie ein Kim-Tuch auf die Kühlstufe, um Feuchtigkeit aufzunehmen. Anschließend platzieren Sie anästhesierte Fliegen zur Sortierung auf der Stufe und wählen die größten Weibchen für die Fixierung aus. Mit einem feinen Pinsel schieben Sie eine einzelne Fliege in Position in den maßgeschneiderten sarcophagus, der speziell für ein einziges weibliches Wildtyp-Fruchtfliegen-Exemplar geformt ist.

Verwenden Sie nun das Mikroskop, um sicherzustellen, dass die Fliege korrekt mit ihrer dorsalen Seite nach oben positioniert ist. Das Kopfende der Fliege sollte zu Ihnen weisen und das Hinterende von Ihnen weg. Positionieren Sie anschließend einen Minuchin-Pin mit einer magnetischen Stange, die an einem Mikromanipulator befestigt ist.

Die Nadel sollte so ausgerichtet sein, dass das stumpfe Ende zur dorsalen Thoraxregion der Fliege zeigt. Dieser Bereich liegt direkt hinter dem Kopf zwischen den beiden Flügeln. Die Fliege muss korrekt entlang der drei Achsen auf der Nadel positioniert werden.

Die Neigung, die Rolllage und die Gierlage des Stifts müssen perfekt vertikal erscheinen, wenn man frontal auf die Augen blickt; selbst eine geringe Rollung zwischen Fliege und Stift ist nicht zulässig. Der seitliche Blickwinkel zwischen dem Stift und der langen Körperachse bzw. der Neigung sollte einen um 30 Grad nach oben geneigten Winkel relativ zum Horizont aufweisen. Beachten Sie, dass der Stift möglicherweise zur optimalen Befestigung gekürzt werden muss.

Das hängt vom Abstand zwischen den Suspensionmagneten ab. Sobald der Mnuchin-Pin ausgerichtet ist, tragen Sie mit einem dünnen Stahldraht einen kleinen Tropfen UV-aktivierten Klebstoff an das stumpfe Ende des Mnuchin-Pins auf. Bringen Sie nun den Pin so in Position, dass der Klebstofftropfen den Thorax der Fliege knapp oberhalb des Kopfes berührt.

Verwenden Sie nicht zu viel Klebstoff. Bei der richtigen Tropfengröße sollte der Klebstoff vom Stift auf das Thorax abfließen. Danach härtet man den Klebstoff mit zwei 22-ns-Impulsen von UV-Licht aus.

Nachdem die Fixierung abgeschlossen ist, reichen Sie mit einer Pinzette je ein kleines quadratisches Kim-Tuch an die Fliegen, da diese aufgrund eines instinktiven Landereflexes danach greifen. Die Fliegen werden sich an den Kim-Tüchern festhalten. Nach einer Erholungsphase von einer Stunde sind die fixierten Fliegen bereit für Experimente.

Um einen gleichmäßigen 360-Grad-Bewegungsbereich zu erreichen, ist es entscheidend, die Magnete korrekt auszurichten. Halten Sie dazu die unteren Ringmagnete horizontal mit einer Kunststoffhülle und platzieren Sie sie direkt auf einer klaren Vakuumkammer. Der obere Stabmagnet ist vertikal etwa drei Viertel Zoll über den unteren Magneten befestigt, wobei ein V-Doppelkugellager mit Epoxidharz an der Unterseite des oberen Magneten befestigt ist.

Dadurch wird die Positionierung der Fliege standardisiert und die Rotationsreibung minimiert. Beachten Sie, dass diese Magnete gefährlich sein können und ein unsachgemäßer Gebrauch zu Beschädigungen der Ausrüstung oder geringfügigen Verletzungen führen kann. Richten Sie anschließend die oberen und unteren Magnete grob visuell aus.

Indem man den oberen Stabmagneten direkt über dem Mittelpunkt der unteren Ringmagnete positioniert, ist es hilfreich, den oberen Magneten an einen Mikromanipulator zur feinen Justierung anzubringen. Setzen Sie nun eine Fliege in die Versuchsarena und justieren Sie die horizontale und vertikale Position des oberen Magneten, bis die Fliege zu Beginn jedes Experiments reibungslos und gleichmäßig 360 Grad rotieren kann. Jede Fliege sollte auf eine gleichmäßige Drehung überprüft werden, um sicherzustellen, dass die Magnete korrekt ausgerichtet sind und die Mnuchin-Nadeln nicht beschädigt sind. Falls die Anordnung nicht korrekt ist, kann es sein, dass die Fliege überhaupt nicht rotiert.

Kann einen eingeschränkten Bewegungsumfang aufweisen oder mit inkonsistenten Geschwindigkeiten rotieren. Dies könnte auf ein Problem mit der Verklebung hindeuten, das getestet werden kann, indem ein gestreiftes Raster vor der Fliege rotiert wird, um eine Omo-Reaktion auszulösen. Wenn die Fliege nicht rotiert oder inkonsistent rotiert, sollte sie durch eine andere Fliege ersetzt werden.

Wenn sich diese Fliege nicht korrekt dreht und diese Probleme bei jeder Fliege auftreten, liegt das Problem wahrscheinlich an der Ausrichtung der Magnete, und es sind weitere Justierungen erforderlich, um eine stabile Duftfreisetzung zu erreichen. Für den ersten Aufbau des Duftsystems muss eine dünne Teflon-Schlauchleitung vom Gas-Multiplexer zu den speziell angefertigten Wasser-Duft-Fläschchen verlegt werden. Der Auslass dieser Fläschchen sollte direkt mit den Kanülen-Anschlussrohren über denselben Teflonschlauch verbunden werden.

Danach wird eine durchsichtige Acryl-Vakuumkammer unter der Arena platziert, um die Magnete zu stützen. Verwenden Sie ein vier Millimeter durchmessendes Glasrohr, das unterhalb der Fliege montiert und mit der Vakuumkammer verbunden ist, um die Vakuumöffnung näher an die Fliege heranzuführen und den Durchmesser der Öffnung zu verringern. Setzen Sie nun mithilfe einer Pinzette eine fixierte Fliege in die Arena ein.

Sobald sich die Fliege an ihrer Position befindet, schalten Sie einen attraktiven Duft ein. Sie können visuell überprüfen, ob die Fliege auf die Position der Duftöffnung zusteuert, wenn der Duft aktiviert wird. Falls die Fliege keine Präferenz für den Duft zu zeigen scheint, optimieren Sie die OMT durch Probieren.

Führen Sie dies zunächst durch, indem Sie die Position der Duftöffnung so anpassen, bis die Fliege den Duft zu verfolgen scheint. Hier sind die Duftöffnungen auf Mikromanipulatoren montiert und vier Millimeter dorsal und drei Millimeter anterior zum Kopf der Fliege positioniert. Falls das Verändern der Position der Duftöffnung die Duftverfolgung nicht verbessert, stellen Sie die Massendurchflussrate so lange ein, bis die Fliege den Duft zu verfolgen scheint.

Wir verwenden eine Einstellung von sieben Milliliter pro Minute. Falls das Anpassen der Massenstromrate die Geruchswahrnehmung nicht verbessert, stellen Sie die Vakuumströmungsrate so lange ein, bis die Fliege den Geruch zu verfolgen scheint. Wir stellen die Vakuumströmungsrate mit einem Durchflussregler auf 13 Liter pro Minute ein.

Sobald die Position des Ports und die Durchflussraten eingestellt sind, schalten Sie periodisch zwischen der Zufuhr von Wasserdampf und Geruchsdampf unter Verwendung eines schaltbaren Gas-Multiplexers. Wenn Sie Ihre Apparatur korrekt eingerichtet haben, sollten Sie zwei Dinge beobachten. Erstens sollte sich eine fixierte Fliege, die im OMT platziert ist, unter konstanten rotierenden visuellen Reizen gleichmäßig um 360 Grad entlang der vertikalen oder ya-Achse drehen; ruckartige Bewegungen, sogenannte kos, sind charakteristisch für spontanes Drehverhalten in Abwesenheit konstanter visueller Reize.

Wenn die Fliegen sich nicht gleichmäßig drehen können, könnten unsachgemäßes Ankleben und falsch ausgerichtete Magnete die Ursache sein. Zweitens sollte man außerdem beobachten, dass die Fliege, sobald der Geruch eingeschaltet wird, in Richtung der Geruchsdüse steuert. Wenn der Geruch ausgeschaltet ist, sollte die Fliege spontan sekundenlang ziellos laufen, ohne eine Vorliebe für eine bestimmte Position in der Versuchsarena zu zeigen.

Wenn die Fliegen die Duftfahne nicht aktiv verfolgen, kann dies bedeuten, dass Sie die Position der Duftöffnung, die Luftstromrate und/oder die Vakuumströmungsrate anpassen müssen. Wir haben Ihnen soeben gezeigt, wie man eine Fliege für die Verwendung in einer olfaktorischen magnetischen Haltevorrichtung fixiert. Außerdem haben wir Ihnen gezeigt, wie man die Magnete und Duftöffnungen korrekt ausrichtet und wie man die Massendurchflussraten für das Duftstoffzufuhrsystem einstellt.

Das war's. Vielen Dank fürs Zuschauen und viel Erfolg bei Ihren Experimenten.