Name: Photo-induzierte Vernetzung von unmodifizierten Proteins (picup) zu amyloidogene Peptide Applied (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-01-12T00:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 40 s
Description: Lernen Sie die photoinduzierte Vernetzung unmodifizierter Proteine (PICUP) zur Analyse amyloidogener Peptide. Diese Methode ermöglicht die Untersuchung von Oligomergrößenverteilungen für neurodegenerative Forschung.

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Diese Arbeit wurde durch Zuschüsse AG027818 und AG030709 von NIH / NIA, 2005/2E aus dem Larry L. Hillblom Foundation, IIRG-07-58334 vom Alzheimer Association und 07-65798 vom California Department of Public Health unterstützt.

1. Peptide Vorbereitung <ol><li> Abwiegen ~ 100-200 pg lyophilisierten Peptids unter Verwendung einer Mikrowaage und Transfer in beschriftete, Silizium beschichtet, low-Adsorbens Mikrozentrifugenröhrchen. Hier verwenden wir die menschliche Sequenzen von Aβ40, Aß42, Calcitonin und GRF. </li><li> Hier verwenden wir Peptide mit 1,1,1,3,3,3-Hexafluor-2-propanol (HFIP) vorbehandelt, um eine homogene, Aggregat-freie Präparate zu erhalten. Dieser Schritt ist notwendig, weil vorgeformte Aggregate induzieren schnelle Aggregation von amyloidogenen Proteine, die in schlechten Reproduzierbarkeit unter Versuchen 5 führen. Andere Methoden wie Filtration und SEC können auch verwendet, um Aggregate-freie Präparate für picup 6 erhalten werden. </li><li> Zur Behandlung der Peptide mit HFIP, pre-chill die HFIP Behälter auf Eis in einem Abzug tragen angemessenen Schutz (HFIP ist flüchtig und toxisch). Kühlung von einem 250-ml-Flasche erfordert in der Regel 10-15 min. Add HFIP zu vorgekühlte Röhrchen mit Peptid Lyophilisate zu einem nominalen Peptid-Konzentration von 0,5 mM zu erhalten. </li><li> Beschallen das Peptid-Lösungen in einem Wasser-Ultraschallbad für 5 min bei Raumtemperatur. </li><li> Vortexen und die Röhrchen für 30 min bei Raumtemperatur. </li><li> Gefühlt die Röhrchen auf Eis (für 1 min), und teilen Sie die Lösungen in 10 bis 50-ul-Aliquots in beschrifteten 0,6-ml Low-Adsorbens Rohre. </li><li> Entfernen HFIP durch Verdunstung unter einem leichten Stickstoffstrom, oder lassen Sie die Rohre geöffnet im Abzug über Nacht. Für Übernachtung Verdunstung, statt die offenen Rohre in ein Rack und bedecken sie mit einem großen Blatt Kimwipes, um Staub und Partikel Kontamination zu vermeiden. </li><li> Exsiccate die restlichen HFIP im Vakuum in einem Lyophilisator oder eine Zentrifugenkonzentrator für 30 min, oder in einem Exsikkator befestigt, um ein Vakuum Einlass für 2 h. Das Endprodukt wird ein Peptid Film an der Unterseite des Mikrozentrifugenröhrchen werden. Wenn sie richtig exsiccated, können die Rohre luftdicht über einen längeren Zeitraum (Monate) gelagert werden bei -20 oder -80 ° C. </li></ol> 2. Solubilisierung der HFIP behandelten Peptide und Foto-Vernetzung <ol><li> Vor Solubilisierung der HFIP behandelten Peptide für Vernetzungsreaktionen, muss man die Vernetzung und Abschrecken Reagenzien vorzubereiten. </li><li> Abwiegen Ammoniumpersulfat (APS, Herr 228,2 g / mol) und bereiten eine 20 mM Lösung in 10 mM Natriumphosphat, pH 7,4. Mix mit einem Vortex, bis die Lösung klar ist. </li><li> Bereiten Sie 1 mM Lösung von Tris (2,2-Bipyridyl) dichlororuthenium (II)-Hexahydrat (Rubpy, Herr 748,63 g / mol) in 10 mM Natriumphosphat, pH 7,4. Mix mit einem Vortex und überprüfen vollständige Auflösung. Schützen Sie das Rohr von Licht mit Aluminiumfolie. </li><li> Für SDS-PAGE-Analyse nach Quervernetzung, ist eine bequeme Abschrecken Reagenz 5% β-Mercaptoethanol in 2 × SDS-PAGE-Probenpuffer. Alternativ 1 M Dithiothreitol (DTT, Herr 154,5 g / mol) in deionisiertem Wasser oder einem geeigneten Puffer verwendet werden kann. </li><li> HFIP behandelten Peptid Filme werden in verdünnter NaOH zuerst gelöst und dann Natriumphosphatpuffer wird hinzugefügt, um ~ 30 nM Peptid-Konzentration zu bekommen. Add 60 mM NaOH, gefolgt von VE-Wasser in das Rohr mit dem Peptid-Film, so dass NaOH und Wasser 10 und 45% des letzten Bandes bzw. darstellen. Kratzen Sie die Peptid-Film aus den Innenwänden der Mikrozentrifugenröhrchen mit der Spitze, mischen durch Auf-und Abpipettieren und beschallen für 5 min in einem Wasser-Ultraschallbad. </li><li> Fügen Sie 45% 20 mM Natriumphosphat, pH 7,4, durch Pipettieren gründlich mischen und zentrifugieren bei 16.000 g für 10 min. Beiseite Aliquots von unvernetzten Peptide mit dem Abschrecken Reagenz für negative Kontrollen gemischt. </li><li> Stellen Sie die Kamera-Auslöser-Verzögerung bis 1 s. Bei höheren Belichtungszeiten, können umfangreiche radikalen Reaktionen hervorrufen Proteinabbau. Legen Sie die Kamera-Auslöser. Bestrahlung etwas Zeit brauche, um optimierte, wenn Sie die Methode mit einem neuen Protein sein. </li><li> Ein typisches picup Reaktion wird in einem 20 ul Reaktionsvolumen durchgeführt. Transfer-18 ul der Peptid-Lösung in eine dünnwandige, klar, 0,2-ml PCR-Röhrchen. </li><li> Um die Peptid-Lösung geben, 1 ul Rubpy um 1 ul APS gefolgt und mischen Sie die Reagenzien durch Pipettieren (die Endkonzentration Rubpy und APS in der Reaktionsmischung wird 0,05 und 1 mm, bzw. werden). </li><li> Schnell Platz Reaktionsrohr in einem 1,8-ml-Glasflasche. Legen Sie die Flasche in den Balg vor dem Kameragehäuse befestigt. Befestigen Sie den Objektivschutz und drücken Sie den Auslöser, so dass die Probe für 1 s in den Balg bestrahlt wird. </li><li> Nach Probe-Bestrahlung schnell die Flasche aus dem Balg und PCR-Röhrchen aus dem Fläschchen. Schnell wird die Reaktion durch Zugabe von 1 ul DTT oder 10 ul Reduzierung PAGE Probenpuffer. Wiederholen Sie die Reaktion für jedes Peptid Aliquot. </li><li> Die Reaktionsgemische können nun bei -20 ° C für die Lagerung werden nicht länger als 7 Tage oder auf Eis gehalten vor der Analyse durch SDS-PAGE und Silberfärbung eingefroren. </li></ol> 3. SDS-PAGE und Splitter-Färbungaus vernetztem Peptid-Produkte <ol><li> Routine SDS-PAGE und Silberfärbung werden durchgeführt, um vernetzte Peptide zu visualisieren. </li><li> Legen Sie 5 ul der Reaktionsmischung pro Bahn um ~ 130 pmol Peptid pro Bahn zu erhalten. </li><li> Fügen Sie ähnliche Mengen an unvernetzten Peptide für den Vergleich. Auch eine Standard-Protein-Leiter für visuelle Annäherung mit einem Molekulargewicht von Peptid-Bands. </li><li> Führen Sie das Gel mit einem Standard-Gel-Elektrophorese-Apparatur. Wir nutzen die XCell SureLock Mini-Cell-System von Invitrogen und führen Silber-Färbung nach Invitrogen Veröffentlichung IM-1002, Novex Pre-Cast-Gel-Elektrophorese Guide. </li></ol> Teil 4: Repräsentative Ergebnisse (Abb. 1) <img src="/files/ftp_upload/old/1071_2009_1_19_13/Result no demarcation.png" alt="Abbildung 1" /> Abbildung 1: Silber-gefärbten Polyacrylamidgelen zeigt unvernetzten (-) und Foto-cross-linked (+) GRF, Calcitonin, Aβ40 und Aß42 SDS-PAGE und Silberfärbung analysiert der picup-generated Aβ40-Oligomere zeigen etwa gleiche Bandenintensität von Monomer durch Tetramer, durch einen starken Rückgang in der Fülle der höheren Oligomeren 7 an. Unvernetzte Aβ40 wandert mit einem Herrn im Einklang mit der Monomer 7. Aß42 zeigt eine deutliche Oligomer Größenverteilung. Aß42 Oligomeren umfassen 2-3 Gruppen 8. Die erste Gruppe, Monomer durch Trimer zeigt abnehmender Intensität mit zunehmender Oligomer bestellen. In der zweiten Gruppe, ist ein Gaussian-like Verteilung zwischen Tetramer und Heptamer beobachtet, mit einem Maximum bei Pentamer und Hexamer. Die dritte Gruppe, die hier nicht dargestellt ist, enthält Oligomere von Herrn ~ 30.000-60.000 Da 8. Diese höheren Herrn Oligomere typischerweise beobachtet mit SEC-isolierter LMW Aß42 aber nicht Peptid durch Filtration oder HFIP Behandlung 6 hergestellt. Unvernetzte Aß42 produziert vorwiegend zwei Bands, ein Monomer-Band und einem breiten Trimer / Tetramer Band, die ein Artefakt durch SDS 5,9 induziert wird. Calcitonin ergibt sich ein Oligomer Größenverteilung, die stark abweicht von einem monotonen exponentielle Abnahme in der Region Monomer durch Tetramer, was darauf hindeutet Präexistenz Dimeren, Trimeren und Tetrameren 7. Die Steuerung Polypeptid, GRF, produziert eine monotone Oligomerverteilung von Dimer durch Hexamer, so dass die scheinbare relative Mengen an Oligomeren exponentiell mit zunehmender Molekülmasse. In anderen Experimenten, höhere Oligomere könnten auch visualisiert 7 sein. Die genaue Anzahl und relativen Intensitäten der Oligomer Bands können etwas variieren zwischen Experimente abhängig von der tatsächlichen Protein-Konzentration, die Menge an Protein auf das Gel aufgetragen, und die Zeit für die Entwicklung Schritt in die Silber-Färbung Protokoll verwendet.

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</ol>

Picup war ursprünglich eine stabile Protein-Komplexe 2-Studie entwickelt. Die Methode wurde später auf quantitative Studie von metastabilen Amyloid-Protein-Baugruppen, darunter Aß 10, Prionen und krankheits-assoziierte PrP Sc 11 und α-Synuclein 12 aufgebracht. Die wichtigsten Faktoren, die bei der Gestaltung eines picup Experiment werden müssen, sind das Reagenz Stöchiometrie, Bestrahlungszeit und Probenvorbereitung. Die ersten beiden Probleme erfordern empirische Optimierung, während die letztgen...

<table><tbody><tr><td>Dolan-Jenner 200-W-Glühlampe</td><td>Sonstiges</td><td>Dolan-Jenner Industries</td><td>Modell 170-D</td><td>Die von der Lampe erzeugte Wärme d&amp;#8211;beeinflusst Proben bei kurzen Inkubationszeiten nicht.</td></tr><tr><td>35-mm-SLR-Kameragehäuse</td><td>Werkzeug</td><td>Pentax</td><td>SP500-Modell</td><td>In unseren Einstellungen ist ein Balgen an das Gehäuse der Kamera angebracht, um eine geeignete Kammer für die Bestrahlung der Probe bereitzustellen, die 10 cm von der Lichtquelle entfernt platziert ist.</td></tr><tr><td>Klare, dünnwandige PCR-Röhrchen</td><td>Sonstiges</td><td>Eppendorf</td><td>951010006, bezogen von Fisher L22-003-24</td><td></td></tr><tr><td>Glasvials (1,8 mL)</td><td>Sonstiges</td><td>Kimble Chase</td><td>60940A 2, geliefert von Fisher 03-340-60</td><td></td></tr><tr><td>GRF</td><td>Reagenz</td><td>Bachem</td><td>H-3695</td><td></td></tr><tr><td>HFIP</td><td>Reagenz</td><td>TCI America</td><td>H0424</td><td>Im Abzug verwenden.</td></tr><tr><td>A&amp;#946;40 und A&amp;#946;42</td><td>Reagenz</td><td>UCLA Biopolymere Laboratorium</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Calcitonin</td><td>Reagenz</td><td>American Peptide</td><td>22-1-10</td><td></td></tr><tr><td>Tris(2,2′-Bipyridyl)dichlorruthenium(II)-Hexahydrat</td><td>Reagenz</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>224758-1G</td><td>Vortexen Sie, bis die Lösung klar ist. Bedecken Sie das RuBpy-Röhrchen mit Aluminiumfolie, um das Reagenz vor Umgebungslicht zu schützen. RuBpy wird jedes Mal frisch hergestellt und sollte innerhalb von 48 h verwendet werden.</td></tr><tr><td>Ammoniumpersulfat</td><td>Reagenz</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A-7460</td><td>Vortexen Sie, bis die Lösung klar ist. APS wird jedes Mal frisch hergestellt und sollte innerhalb von 48 h verwendet werden. </td></tr><tr><td>&amp;#946;-Mercapto&amp;#8211;Ethanol</td><td>Reagenz</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M7154-25 ML</td><td>Kann verwendet werden, wenn eine SDS-PAGE-Analyse durchgeführt wird.</td></tr><tr><td>Novex Tricin SDS-Probe-Puffer (2x)</td><td>Reagenz</td><td>Invitrogen</td><td>LC1676</td><td></td></tr><tr><td>XCell &lt;i&gt;SureLock&lt;/i&gt; Mini-Zelle</td><td>Werkzeug</td><td>Invitrogen</td><td>EI0001</td><td></td></tr><tr><td>Novex Tricin-Gele (10–20 %)</td><td>Sonstiges</td><td>Invitrogen</td><td>EC6625B0X</td><td></td></tr><tr><td>Novex Tricine SDS Laufpuffer (10x)</td><td></td><td>Invitrogen</td><td>LC1675</td><td></td></tr><tr><td>Silver Express Staining Kit</td><td></td><td>Invitrogen</td><td>LC6100</td><td></td></tr></tbody></table>

photo-induzierte vernetzung von unmodifizierten proteins (picup) zu amyloidogene peptide applied

Photo-Induced Cross-Linking of Unmodified Proteins (PICUP) Applied to Amyloidogenic Peptides

Die Montage der amyloidogene Proteine ​​in toxischen Oligomere ist ein wegweisendes Ereignis in der Pathogenese der Fehlfaltung Erkrankungen, darunter Alzheimer, Parkinson und Huntington-Krankheit, erblich amyotrophe Lateralsklerose, und Typ 2 Diabetes. Aufgrund der metastabilen Charakter dieser Protein-Baugruppen, ist es schwierig, ihre Oligomer Größenverteilung quantitativ zu erfassen mit klassischen Methoden wie Elektrophorese, Chromatographie, Fluoreszenz oder dynamische Lichtstreuung. Oligomere von amyloidogene Proteine ​​existieren als metastabile Mischungen, in denen die Oligomere in Monomere dissoziieren und assoziieren zu größeren Baugruppen gleichzeitig. Picup stabilisiert Oligomer Populationen durch kovalente Vernetzung und wann mit Fraktionierung Methoden, wie Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamidgelelektrophorese (SDS-PAGE) oder Größenausschlusschromatographie (SEC) kombiniert wird, liefert picup Schnappschüsse des Oligomers Größe Distributionen, die vor dem Kreuz gab Vernetzung. Daher ermöglicht picup Visualisierung und quantitativen Analyse von metastabilen Protein Populationen und kann zur Montage und entschlüsseln Beziehungen zwischen Sequenz Modifikationen und Oligomerisierung überwachen<sup&gt; 1</sup&gt;. Mechanistisch beinhaltet picup Photo-Oxidation von Ru<sup&gt; 2 +</sup&gt; In einem Tris-(Bipyridyl) Ru (II)-Komplex (Rubpy) zu Ru<sup&gt; 3 +</sup&gt; Durch Bestrahlung mit sichtbarem Licht in Gegenwart von Elektronen-Akzeptor. Ru<sup&gt; 3 +</sup&gt; Ist eine starke Ein-Elektronen-Oxidationsmittel in der Lage zu abstrahieren ein Elektron von einem benachbarten Eiweißmolekül, erzeugt ein Protein, radikale<sup&gt; 1,2</sup&gt;. Radikale sind instabile, hochreaktive Spezies und daher rasch verschwinden durch eine Vielzahl von intra-und intermolekularen Reaktionen. Ein Rest kann nutzen die hohe Energie eines ungepaarten Elektrons mit einem anderen Protein-Monomer Bildung eines dimeren Radikal, das später verliert ein Wasserstoffatom und bildet einen stabilen, kovalent verknüpftes Dimer reagieren. Das Dimer kann dann weiter reagieren durch einen ähnlichen Mechanismus mit Monomeren oder anderen Dimere höherer Ordnung Oligomere bilden. Vorteile der picup im Vergleich zu anderen Foto-oder chemische Vernetzung Methoden<sup&gt; 3,4</sup&gt; Sind kurze (≤ 1 s) Exposition gegenüber nicht-destruktive sichtbares Licht, keine Notwendigkeit für<i&gt; Pre-facto-</i&gt; Änderung der nativen Sequenz und der Länge Null kovalente Vernetzung. Darüber hinaus ermöglicht picup Quervernetzung von Proteinen in weiten pH-und Temperaturbereichen, einschließlich physiologischer Parameter. Hier zeigen wir Anwendung von picup zur Vernetzung von drei amyloidogene Proteine ​​die 40 - und 42-Rückstände Amyloid β-Protein-Varianten (Aβ40 und Aß42) und Calcitonin, und eine Kontroll-Protein, Wachstumshormon-Releasing-Faktor (GRF).

Photo-induzierte Quervernetzung von unmodifizierten Proteine ​​(picup) ermöglicht die Charakterisierung des Oligomers Größenverteilung in metastabilen Protein-Mischungen. Wir zeigen, Anwendung picup zu drei Vertreter amyloidogene Peptide der 40 - und 42-Rückstand bildet der Amyloid-β-Protein und Calcitonin, und eine Kontrollgruppe Peptid Wachstumshormon-Releasing-Faktor.

Photo-induzierte Vernetzung von unmodifizierten Proteins (picup) zu amyloidogene Peptide Applied

Die Zusammenlagerung amyloidogener Proteine zu toxischen Oligomeren ist ein entscheidendes Ereignis in der Pathogenese von Proteinfehlfaltungskrankheiten, einschließlich Alzheimer, ...

Lösliche Oligomere amyloidbildender Proteine, die aufgrund ihrer zytotoxischen Eigenschaften vermutlich der Pathophysiologie neurodegenerativer Erkrankungen zugrunde liegen, bilden sich in Lösung ständig neu und dissociieren kontinuierlich. Diese Tatsache erschwert strukturelle Untersuchungen, die entscheidend für die Entwicklung inhibitorischer Moleküle sind, um dieses Problem zu umgehen.Die photoinduzierte Vernetzung unmodifizierter Proteine oder Pickup-Methode wird verwendet. Bei dieser Methode werden disaggregierte und solubilisierte amyloide Peptide Vernetzungsreagenzien und einem einsekündigen Puls intensiven Lichts ausgesetzt, um Dimeren und Alleren kovalent zu verbinden. Die Größenverteilung der Alleren kann anschließend mittels standardmäßiger biochemischer Techniken analysiert werden.Hallo, ich bin far Rahimi aus dem Batan-Labor der Abteilung für Neurologie an der University of California in Los Angeles. Ich bin Al Mai aus dem Bean-Labor. Heute zeigen wir Ihnen ein Verfahren zur photoinduzierten Vernetzung unmodifizierter Proteine.Wir verwenden dieses Verfahren in unserem Labor, um stabilisierte Amyloid-Beta-Protein-Oligomere herzustellen und strukturelle Modifikationen an der Oligo-Hochverteilung zu untersuchen. Dieses Verfahren wurde ursprünglich von Fancy und Coate veröffentlicht, um stabile Protein-Komplexe zu untersuchen. Später wurde die Methode von Battan und anderen zur quantitativen Untersuchung metastabiler Amyloid-Protein-Assemblierungen angewandt, einschließlich a Beta Pram und Alpha Sycle.Beginnen wir nun. Zu einem silikonbeschichteten, niedrig bindenden Gefäß, das ein bis 200 Mikrogramm lyophilisiertes Peptid enthält, wird HEXA-Fluor-Isopropanol oder HFIP hinzugefügt, das zuvor auf Eis vorgekühlt wurde, sodass die Endkonzentration etwa 0,5 beträgt.Molare Mengen an HFIP verhindern, dass amyloide Peptide aggregieren, und verbessern die Reproduzierbarkeit der Ergebnisse. Sonoziere nun das Peptidröhrchen fünf Minuten lang bei Raumtemperatur.Wenn die Beschallung abgeschlossen ist, vorsichtig die Röhrchen vortexen und 30 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren lassen. Nach 30 Minuten die Peptide eine Minute lang auf Eis abkühlen. Die gekühlten Peptide können nun in Aliquots von 10 bis 50 Mikroliter aufgeteilt und in 0,6 ml niedrig-bindende Röhrchen überführt werden.Stellen Sie die Röhrchen danach im Abzug mit geöffneten Deckeln ab. Um die Verdunstung des HFIP über Nacht zu ermöglichen, wickeln Sie das Röhrchenrack zusammen mit Kim-Tüchern ein, um zu verhindern, dass Staub in die Röhrchen gelangt. Sobald der größte Teil des HFIP verdunstet ist, muss jeglicher Spurengehalt an HFIP entfernt werden, indem die Röhrchen zwei Stunden lang im Exsikkator unter Vakuum gehalten werden.Das Endprodukt ist eine dünne Peptidfilm-Schicht in den Röhrchen. Diese Röhrchen können über Monate bei minus 20 oder minus 80 Grad Celsius gelagert werden. Um die Schritte zur Lösung und photochemischen Vernetzung zu beginnen, wird der Peptidfilm zunächst in einer verdünnten Natriumhydroxidlösung gelöst.Nach Zugabe von Natronlauge, deionisiertem Wasser und anschließend Phosphatpuffer sollte die endgültige Lösung 45 % Phosphatpuffer, 45 % Wasser und 10 % Natronlauge enthalten. Falls ein restlicher Proteinfilm an der Röhrenwand zurückbleibt, diesen in die Lösung abkratzen. Die suspendierten Peptide sollten nun mit einer Pipettenspitze mehrmals auf- und abpipettiert und anschließend ein bis zwei Minuten in einem Wasserbad mit einem Ultraschallgerät sonifiziert werden.Nach der Beschallung die Phosphatlösung hinzufügen und durch mehrmaliges Auf- und Abpipettieren mischen. Anschließend das Röhrchen 10 Minuten bei 16.000 G zentrifugieren. Während die Zentrifuge läuft, die Kamera für die Schritte der photochemischen Vernetzung vorbereiten.Die Verschlussverzögerung der Kamera sollte auf eine Sekunde eingestellt und der Verschluss entspannt werden. Sobald die Zentrifugation der Röhrchen abgeschlossen ist, werden 18 Mikroliter Aliquots der Peptidlösung in klare 0,2-ml-PCR-Röhrchen abgefüllt. Diese Aliquots werden für die photochemische Vernetzung verwendet.Stellen Sie sicher, dass Sie etwas Peptidlösung beiseitelegen, die unmittelbar vor der Vernetzung als Negativkontrolle verwendet wird. Geben Sie einen Mikroliter Ammoniumpersulfat und einen Mikroliter Ruthenium hinzu. Platzieren Sie das Röhrchen nun schnell in ein 1,8-M-Glasfläschchen und setzen Sie das Fläschchen in den Balg, der an der Vorderseite des Kameragehäuses befestigt ist.Schließen Sie die Kamera mit dem Objektivschutz und drücken Sie den Auslöser. Die Probe wird nun eine Sekunde lang bestrahlt. Bei längeren Bestrahlungszeiten führen umfangreiche Radikalreaktionen zu einer Proteindegradation.Nach der Bestrahlung schnell die 0,2-mil-PCR-R&ouml;hrchen entnehmen und 10 Mikroliter vorgef&auml;rbten PAGE-Probel&ouml;sungspuffer, der Beta-Mercaptoethanol enth&auml;lt, hinzuf&uuml;gen. Die vernetzten Peptide k&ouml;nnen bis zu sieben Tage bei minus 20 Grad Celsius gelagert werden. Vor der SDS-PAGE, Fraktionierung und Silberf&auml;rbung.Um die vernetzten Peptide zu untersuchen, können routinemäßige SDS-Gele und Silberfärbung verwendet werden. Zur Abschätzung der zu beladenden Volumina sollte man beachten, dass fünf Mikroliter der Reaktionsmischung etwa 130 Pikomol Peptid ergeben. Es wird empfohlen, das Xcel Sherlock Mini-Cell-System von in Vitrogen für die Gelelektrophorese zu verwenden und die Silberfärbung durchzuführen. Laut der in Vitrogen-Publikation IM 1 0 0 2, NOx Precast Gel Electrophoresis Guide, sollte das SDS-Gele nach der Silberfärbung analysiert werden; das nicht vernetzte Kontrollpolypeptid, GRF, wandert hauptsächlich als Monomer. Vernetztes GRF erzeugt eine kontinuierliche, alle Liganden umfassende Verteilung, die vom Dimer bis zum Hexamer reicht, wobei die scheinbare relative Bandenintensität der Oligomere exponentiell mit zunehmender molare Masse abnimmt. Nicht vernetztes Calcitonin läuft hauptsächlich als Monomer und teilweise als Dimer. Vernetztes Calcitonin ergibt eine Liganden-Größenverteilung, die im betrachteten Bereich stark von einem monotonen exponentiellen Abfall abweicht.Monomer bis Tetramer deuten auf die vorherige Existenz von Dimere, Trimere und Tetramere in nicht vernetzter Form hin. Ein Beta-40 läuft nur als Monomer; detektiert wurde ein Beta-40. Alle Ligamente zeigen ungefähr ähnliche Bandenintensitäten von Monomer bis Tetramer, gefolgt von einer Abnahme der Häufigkeit höherer Ligamente.Unvernetztes A beta 42 ergibt vorwiegend zwei Banden, eine Monomer-Bande und eine Trimer-Bande. Die Trimer-Tetramer-Bande ist ein Artefakt, das durch SDS-Vernetzung entsteht.A Beta 42 zeigt eine deutliche Verteilung der Oligomergrößen, die aus zwei Gruppen besteht. Die erste Gruppe, Monomer bis Trimer, weist eine abnehmende Intensität mit zunehmender Oligomerordnung auf. In der zweiten Gruppe wird zwischen Tetramer und Hekzamer eine glockenförmige Verteilung beobachtet, deren Maximum bei Pentamer und Hexamer liegt.Wir haben Ihnen gerade gezeigt, wie man das Protein mithilfe von Pika unter Verwendung dieses Verfahrens vernetzt. Es ist wichtig zu beachten, dass bei der Arbeit mit amyloidogenen Proteinen sichergestellt werden muss, dass die Präparationen frei von Aggregaten sind, um reproduzierbare Ergebnisse zu erhalten. Die hier gezeigten Bedingungen und diese Experimente können je nach den interessierenden Lyten experimentell angepasst werden. Das war's also.Vielen Dank fürs Zuschauen und viel Erfolg beim Durchführen des Pickup-Experiments.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Biology

Biologie

Aptamere sind kurze ribo-/deoxyribo-oligonucleotides ausgewählt...

Selektion von Aptameren für Amyloid β-Protein, dem Erreger der Alzheimer-Krankheit

Proteine können entweder eine native Struktur annehmen oder sich in unlösliches Amyloid fehlfalten. Bedingungen, die den Fehlfaltungsweg begünstigen, führen zur Bildung verschiedener Arten von Amyloidfibrillen. Die hier beschriebenen Methoden ermöglichen eine schnelle Umwandlung von nativen Proteinen in Amyloid in vitro.

Schnelle Generierung von Amyloid aus nativen Proteinen in vitro

Während der Transport von Zelloberflächenproteinen relativ leicht studiert, Visualisieren des Handels mit intrazellulären Proteinen ist viel schwieriger. Hier verwenden wir Konstrukte Einbeziehung photoaktivierbaren GFP und zeigen eine Methode, um genau zu folgen das Amyloid-Vorläuferprotein aus dem Golgi-Apparat, um Downstream-Fächer und folgen Sie den Freiraum.

Abbilden des intrazellulären Transport von APP mit Photoaktivierbare GFP

Die Amyloid-β (Aß) -injected Tiermodell die Verabreichung einer definierten Menge und Arten von Aß-Fragmente ermöglicht und reduziert individuelle Unterschiede innerhalb der einzelnen Studiengruppe. Dieses Protokoll beschreibt die intracerebroventricular (ICV) Injektion von A &amp; bgr; ohne stereotaktischen Instrumente, die Produktion von Alzheimer-ähnliche Verhaltensstörungen in normalen Mäusen ermöglichen.

Intracerebroventricular Injektion von Amyloid-β-Peptide in normalen Mäusen zu Akut Induce Alzheimer-ähnliche kognitive Defizite

Wir berichten hier über eine HPLC-Reinigung Protokoll zugeschnitten, die hochreine Beta-Amyloid-42 (Aß42) und Beta-Amyloid-40 (Aβ40) Peptide, der fähig Oligomerbildung ergibt. Amyloid beta ist ein hoch Aggregation neigen, hydrophoben Peptid in Alzheimer-Krankheit in Verbindung gebracht. Die amyloidogenen Natur des Peptids macht seine Reinigung eine Herausforderung.

Ein Tailored HPLC Reinigungsprotokoll, dass die Renditen hochreine Amyloid Beta 42 und Amyloid Beta 40 Peptides, Fähig zur Oligomerbildung

Amyloid-Ablagerungen ist ein Markenzeichen von verschiedenen Krankheiten und viele andere Organe befällt. Dieses Papier beschreibt die Anwendung der leuchtenden konjugierte Oligothiophene Fluoreszenz Färbung in Kombination mit Fluoreszenz-Mikroskopie-Techniken. Diese Färbung Methode darstellt, ein leistungsstarkes Tool für die Erkennung und Erforschung von Proteinaggregaten in klinischen und wissenschaftlichen Einrichtungen.

Imaging-Amyloid Gewebe gebeizt mit lumineszierenden konjugierte Oligothiophenes von hyperspektralen konfokalen Mikroskopie und Fluoreszenz Lifetime Imaging

Eine einfache Fluoreszenz-Assay wird präsentiert, um die Effizienz von amino-Acyl-tRNA-synthestase/tRNA-Paaren, die Einbeziehung der nicht-kanonischen Aminosäuren (NcAAs) in Proteine in Säugetierzellen zu bewerten. Die Anwendung des NcAAs auf G-Protein-gekoppelten Rezeptoren (GPCRs) studieren wird beschrieben, einschließlich Foto-Vernetzung Zuordnung Websites und Bioorthogonal GPCR Kennzeichnung auf lebende Zellen zu binden.

Optimierung der genetischen Einbeziehung der chemischen Sonden in GPCRs für Foto-Vernetzung-Mapping und Bioorthogonal Chemie in Live Säugerzellen

Dieses Protokoll beschreibt, wie Aβ Oligomere aus einem synthetischen Peptid in Vitro vorzubereiten und relative Mengen der Aβ Oligomer durch eine Dot-Blot-Analyse zu bewerten.

A11-positiver β-Amyloid Oligomer Vorbereitung und Bewertung mit Dot-Blot-Analyse

Ein Protokoll für die Synthese von 1,2-Dithiolane modifizierte Peptid und die Charakterisierung der supramolekularen Strukturen durch das Peptid Selbstmontage.

Synthese und Charakterisierung von 1,2-Dithiolane geändert selbstorganisierende Peptide

In dieser Arbeit wird beschrieben, wie polarisationsempfindliche Zwei-Photonen-Mikroskopie angewendet werden kann, um die lokale Organisation in markierungsfreien Amyloid-Superstrukturen-Sphäroliten zu charakterisieren. Außerdem wird beschrieben, wie die Probe vorbereitet und gemessen, der erforderliche Aufbau zusammengestellt und die Daten analysiert werden, um Informationen über die lokale Organisation von Amyloidfibrillen zu erhalten.

Polarisationsempfindliche Zwei-Photonen-Mikroskopie zur markierungsfreien Amyloid-Strukturcharakterisierung

In dieser Arbeit stellen wir eine systematische Methode vor, die die quasi-reversible Selbstorganisation der Amyloid beta 1-40 (Aβ 1-40)-beschichteten 20 nm Goldaggregate beschreibt. Die nanogrößenabhängige, quasi-reversible Vernetzung zwischen Peptiden wurde mit spezifischen Aminosäuren oder Abschnitten des Aβ 1-40-Monomers korreliert.

Charakterisierung der pH-abhängigen reversiblen Selbstorganisation von Amyloid-beta-1-40-beschichteten Goldkolloiden

Lernen Sie die photoinduzierte Vernetzung unmodifizierter Proteine (PICUP) zur Analyse amyloidogener Peptide. Diese Methode ermöglicht die Untersuchung von Oligomergrößenverteilungen für neurodegenerative Forschung.

Photo-induzierte Vernetzung von unmodifizierten Proteins (picup) zu amyloidogene Peptide Applied

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