Micro-Drive-Array für chronische In vivo Recording: Tetrode Assembly

In diesem Protokoll beschreiben wir die Herstellung und Montage von Tetroden-Bündeln mit jeweils vier Elektroden für chronische In-vivo-Aufnahmen an wachen Nagetieren, um mit der Tetroden-Herstellung zu beginnen. Ein Strang aus Mikroelektroden-Draht wird zweimal umgelegt, um ein Bündel aus vier parallelen Drähten zu bilden. Diese Drähte werden anschließend miteinander verdrillt und mit einer Heißluftpistole imprägniert.

Jeder fertige Tero wird in eine Aufbewahrungsbox gelegt. Während weitere Teros hergestellt werden, wird jeder Tero durch einen dedizierten Kanal eingeführt, der über eine Öffnung in einem Linearantrieb beginnt und durch die Basis des Mikroantriebsarrays austritt. Jeder der vier Drähte des Teros ist mit separaten Stiften auf einer Ausgangs-Anschlussplatine verbunden, die an der Oberseite des Mikroantriebsarrays befestigt ist.

Die Impedanz jedes Kanals des Tero wird durch einen Galvanik-Goldbeschichtungsprozess verringert. Nachdem alle Teros installiert und galvanisch beschichtet wurden, werden zwei Masseleitungen an die entsprechenden Stifte auf der Anschlussplatine angebracht, und ein Schutzkegel wird am Rahmen des Tero-Mikroantriebsarrays befestigt, um Schutz zu gewährleisten, nachdem der Kegel geerdet wurde. Ein funktionsfähiges Tero-Mikroantriebsarray von Foley ist bereit zur Implantation. Hallo, ich bin Dave Nian aus dem Labor von Nat Wilson am Pickout-Institut für Lernen und Gedächtnis.

Heute am MIT zeigen wir Ihnen ein Verfahren zur Herstellung von Teros, zum Beladen der Teros und zur Durchführung der letzten Schritte der Mikroantriebsrekonstruktion. In unserem Labor verwenden wir dieses Verfahren, um koordinierte neuronale Aktivität zwischen großen Zellpopulationen und Neuronen in einer wachen, verhaltensfähigen Tierpräparation zu untersuchen. Beginnen wir also.

Um den Tero für unser standardmäßiges Mikroantriebs-Array herzustellen, beginnen wir mit einem 50 cm langen Stück isolierten 12-Mikron-Mikrodrahts. Falten Sie den Draht in der Mitte, führen Sie Ihre Finger entlang des Drahtpaares, um sie zusammenhalten zu lassen, und stellen Sie sicher, dass die beiden Drähte über ihre gesamte Länge hinweg guten Kontakt miteinander haben.

Falten Sie das Paar erneut, indem Sie die beiden Enden zusammenhalten. Stellen Sie sicher, dass die an einem Ende gebildete Schleife keine Knicke aufweist. Schneiden Sie die vier Drähte am nicht geschlungenen Ende so ab, dass die vier Spitzen bündig abschließen.

Für den nächsten Schritt benötigen Sie einen modifizierten Krokodilklemme, ein motorisiertes Drehgerät und eine horizontale Stange über dem Drehgerät. Die Krokodilklemme wird modifiziert, indem eine Kunststoffstange an der Basis der Klemme angeklebt wird. Wenn die Spitzen freiliegen, klemmen Sie die vier Drähte mit der modifizierten Krokodilklemme zusammen.

Hängen Sie die Drahtschleife über den horizontalen Balken. Stecken Sie die Krokodilklemme in die motorisierte Vorrichtung. Bringen Sie 80 Drehungen im Uhrzeigersinn gefolgt von 40 Drehungen gegen den Uhrzeigersinn am Drahtbündel innerhalb von etwa drei Minuten an.

Diese Parameter können je nach Bedarf angepasst werden. Nachdem das Verdrillen abgeschlossen ist, verschmelzen Sie die Drähte, indem Sie sie mit einem Heißluftgebläse aus drei verschiedenen Winkeln erhitzen, wobei für jeden Winkel ein mittlerer bis niedriger Luftstrom verwendet wird. Beginnen Sie dabei ein bis zwei Zentimeter unterhalb der Stelle, an der sich das Drahtbündel teilt. Führen Sie das Heißluftgebläse anschließend etwa fünf Sekunden lang in einem Abstand von zwei Zentimetern entlang der Drähte auf und ab.

Seien Sie vorsichtig, da hohe Temperaturen die Isolierung vollständig schmelzen lassen und zu Kurzschlüssen führen können. Nachdem die Drähte miteinander verschmolzen sind, entfernen Sie den Tero aus der Verdrehvorrichtung, indem Sie den Krokodilklemme vorsichtig anheben, um die Spannung auf den Tero zu verringern, und schneiden Sie den Tero nahe der Krokodilklemme ab. Schneiden Sie am anderen Ende die Schleife so ab, dass vier nicht markierte Drahtstränge gleicher Länge entstehen. Trennen Sie anschließend die einzelnen Stränge an der Oberseite, indem Sie die Drähte mit einer feinzahnigen Pinzette vorsichtig verbiegen.

Der Tero ist nun bereit, in das Mikroantriebs-Array geladen zu werden. Fertigen Sie 21 bis 25 weitere Tet-Roads an und lagern Sie diese in einer staubfreien Box, bis der Ladevorgang für den Tero fortgesetzt wird. Sie benötigen ein vollständiges Mikroantriebs-Array, falls Sie noch keines gebaut haben.

Beziehen Sie sich auf das Video zur Mikroelektrodenantriebsanordnung für die Herstellung einer Mikroantriebsanordnung zur chronischen in-vivo-Aufzeichnung in unserem Konstruktionsplan. Der Tero wird an einem Ende mit der Anschlusshardware verbunden und durch das Polymid-Trägerrohr im Mikroantrieb geführt, sodass die Elektrodenspitzen unterhalb der Basis der Mikroantriebsanordnung hervorstehen. Im Folgenden demonstrieren wir diesen Ladevorgang für einen einzelnen Tero.

Bevor Sie beginnen, bauen Sie den Halter für das Laufwerk, der an einem Ende an der Anschlussplatine befestigt werden kann und dessen anderes Ende mit einer Schale voll Eis fixiert werden kann. In diesem Beispiel handelt es sich bei dem Halter um einen Milax-Stecker, der an einem Ende eines X-Exacto-Messergriffs befestigt ist. Halten Sie den Tetro mit einer feinen Pinzette und schieben Sie unter Verwendung eines Stereomikroskops die Spitze des Tetros in das Poly-Mid-Trägerrohr eines der Mikrolaufwerke. Führen Sie die Tetroad in das Rohr ein, bis sich die einzelnen Elektrodenadern nahe an der Anschlussplatine am oberen Ende des Laufwerksarrays befinden. Achten Sie darauf, die Drähte nicht zu kürzen oder zu verbiegen, da dies bewirken würde, dass der Tetro schräg statt senkrecht in das Gehirn eindringt, und die Integrität des Tetros beeinträchtigen würde.

Leiten Sie nun vorsichtig das andere Ende der vier Drähte mit einer Pinzette mit weicher Spitze in die jeweiligen Löcher der Elektrodenanschlussplatine ein. Vermeiden Sie erneut, die Drähte zu knicken oder zu verbiegen. Sobald alle vier Drähte eingesetzt sind, drücken Sie die goldenen Stifte mit einer Zange, deren unterer Backenbereich verkürzt ist, in ihre Löcher.

Wenn die Stifte in die Öffnung gedrückt werden, entfernen sie die Drahtisolation und erzeugen eine elektrische Verbindung für spätere Referenzzwecke. Verfolgen Sie die Zuordnung zwischen den Mikroantrieben und der Stiftposition auf der Elektroden-Schnittstellenplatine. Fahren Sie fort, insgesamt 18 Tetroaden zu laden.

Die drei verbleibenden Mikroantriebe auf dem Array werden zur Aufnahme der Referenzelektroden verwendet. Jede Referenzelektrode besteht aus einem Tero, das nur eines der vier unbonded Yns nutzt. Um die Referenzelektroden anzubringen, befolgen Sie das Ladeverfahren, verbinden jedoch nur jeweils eine der vier Elektroden mit der entsprechenden Referenzelektroden-Pin auf der Anschlussplatine.

Wenn Sie Mehrfach-Aufzeichnungen planen, kann es sinnvoll sein, die Verbindungen vom Teros zur Anschlussplatine im Voraus zu planen. Gruppieren Sie beispielsweise Tetrodengruppen, die auf eine bestimmte anatomische Region ausgerichtet sind, gemeinsam auf der Elektrodenanschlussplatine. Dadurch sollte die Gefahr verringert werden, während der Experimente versehentlich die falsche Tetrode einzustellen.

Nachdem das Tero-Laden abgeschlossen ist, stellen Sie zwei Erdungsdrähte her, einen für das Tier und einen für den Schutzkonus. Schneiden Sie einen sechs Zoll langen isolierten Stahldraht zu und entfernen Sie mit Metallpinzetten an jedem Ende des Drahts drei Millimeter Isolierung. Schneiden Sie anschließend einen vier Zoll langen isolierten Stahldraht zu.

Entfernen Sie drei Millimeter Isolierung an einem Ende und einen Zentimeter am anderen Ende. Führen Sie den sechs Zoll langen Erdungsdraht durch das Loch an der Seite des Mikroantriebsarrays und nach oben in Richtung der Schnittstellenplatine. Verbinden Sie den freigelegten Draht mit der Elektrodenschnittstellenplatine, indem Sie einen Goldstift in das dafür vorgesehene Erdungsloch einsetzen.

Dieser Draht wird mit dem Schädel des Tieres verbunden. Führen Sie den vier Zoll langen Masse-Draht parallel zu dem zuvor installierten Masse-Draht. Verbinden Sie das drei Millimeter abisolierte Ende mit der Elektrodenanschlussplatine, indem Sie einen Goldstift in ein anderes vorgesehenes Massebohrloch einsetzen.

Dieser Draht wird später mit einem Schutzkegel verbunden, der als kleine Faraday-Kammer fungiert, um die Aufnahme von Störungen zu reduzieren. Nun sind wir mit dem Anschließen der Drähte fertig und können mit der Feinbearbeitung unseres Teros fortfahren. Unser Ziel bei diesem Vorgang besteht darin, alle Teros so zu kürzen, dass sie etwas länger sind als die Tiefe der Zielhirnstruktur und unseres Beispiels.

Die Mikroantriebe sind für eine maximale Wegstrecke von fünf bis sechs Millimetern ausgelegt, was ausreicht, um viele Neokortexareale und den dorsalen Hippocampus einer erwachsenen Ratte zu erreichen. Senken Sie zunächst alle Mikroantriebe so weit ab, dass die Tetroden gleichzeitig maximal freigelegt werden. Schneiden Sie alle Tetroden mit einer scharfen Feinschere auf eine Länge zu, die etwa fünf Millimeter länger ist als die gewünschte Endlänge, wobei der letzte Schnitt mit der Schere durchgeführt wird.

Bereiten Sie ein Paar gezahnter Scheren in einer Pfanne mit Eis vor, klemmen Sie einen Griff mit einem leichten Winkel nach unten und den Zähnen nach oben zeigend fest, während Sie den anderen Griff lose lassen. Ziehen Sie nun alle Tet-Kanülen vollständig in ihre Führungs-Kanülen zurück, indem Sie die Mikroantriebe nach oben drehen. Verlängern Sie unter Verwendung eines Stereomikroskops einen Tero vollständig aus seiner Kanüle heraus.

Positionieren Sie mit einem Lineal die gezahnten Scheren in der gewünschten Distanz von der Führungs- zur Kanüle. Schneiden Sie den Tero langsam und vorsichtig mit einer gleichmäßigen Bewegung durch. Nachdem der Tero durchtrennt wurde, ziehen Sie den Mikroantrieb um drei bis vier Millimeter zurück.

Wiederholen Sie diesen Vorgang für jedes Tero, bis alle geschnitten wurden. An diesem Punkt sind Sie bereit für die Vergoldung. Vergoldung.

Der Roteros ist entscheidend für langfristig stabile Ableitungen. Er verhindert Korrosion und verbessert die Biokompatibilität. Richten Sie das Impedanzmessgerät im externen Modus im Stromgenerator ein und verwenden Sie den DC-Prüfmodus mit Audioausgang.

Berühren Sie die beiden Leitungen des Stromgenerators mit den sechs möglichen Kanalpaaren innerhalb jedes Tero und verwenden Sie die akustische Rückmeldung, um festzustellen, ob Kurzschlüsse zwischen den Paaren bestehen. Ein Kurzschluss zwischen Kanalpaaren klingt so. Falls ein Kurzschluss vorliegt, schneiden Sie den Tero erneut mit einer Zickzack-Schere zu und testen Sie erneut.

Wenn das Problem weiterhin besteht, entsorgen Sie den Tet-Rohr und ersetzen Sie ihn. Bewegen Sie alle Mikroantriebe nach unten und verlängern Sie alle Tet-Rohre so weit wie möglich nach außen. Ändern Sie die Gerätekonfiguration zur Überprüfung der Elektrodenimpedanz.

Tauchen Sie nun die Spitzen aller Teros in ein Bad mit Standard-Goldplating-Lösung. Das Goldbad ist elektrisch mit der negativen Leitung des Impedanzmessgeräts verbunden. Prüfen Sie die Impedanz der Elektrode, indem Sie die positive Leitung des Impedanzmessgeräts mit dem entsprechenden Pin auf der Anschlussplatine berühren.

Messen und notieren Sie die Impedanz jedes Drahts im Mikroantriebs-Array. Normale Werte liegen zwischen einem und drei Megaohm am aktuellen Generator. Stellen Sie den Strom zwischen ein und drei Mikroampere ein.

Danach sicher befestigen. Verbinden Sie die positive Leitung des Impedanzmessgeräts mit dem Pin auf der Anschlussplatine. Am Impedanzmessgerät.

Wechseln Sie schnell zwischen Normalmodus und Bypass-Modus und zurück, während sich das Gerät im Bypass-Modus befindet. Der Strom fließt durch die Tet-Straße und die Goldlösung, und Gold wird auf der Elektrodenspitze abgeschieden. Die Impedanz nach jeder Abscheidungsrunde sollte niedriger sein als zuvor.

Wiederholen Sie den aktuellen Impuls. Falls die Impedanz nicht unter einen Megaohm abgesunken ist. Ein konservativer Bereich akzeptabler Impedanzen liegt zwischen 250 Kiloohm und 350 Kiloohm.

Falls der Impedanzwert unter 200 Kiloohm fällt, kann dies auf einen Kurzschluss hindeuten. Falls die Impedanz nach wiederholten Impulsen nicht ausreichend abnimmt, könnte die Elektrodenspitze verstopft sein. Schneiden Sie die Spitze erneut zu, überprüfen Sie sie auf Kurzschlüsse und wiederholen Sie den Vergoldungsprozess.

Falls erneutes Schneiden nicht hilft, ersetzen Sie das Tero und beginnen Sie erneut. Nach dem Belegen aller Teros tauchen Sie diese in Ethanol ein und lassen Sie drei bis fünf Minuten trocknen. Prüfen Sie mithilfe des Stromgenerators auf Kurzschlüsse innerhalb der Teros, wobei die Terospitzen der Luft ausgesetzt sein müssen.

Wenn eine Gleichstromverbindung zwischen zwei oder mehr Elektroden eines Tero besteht, schneiden Sie das Tero erneut zu und überziehen es erneut mit Gold. Nachdem das Vergolden aller Teros abgeschlossen ist, bringen Sie alle Teros in den Drive ein. Als letzten Schritt geben Sie an der Oberseite jedes Mikrodrives einen Tropfen zähflüssigen Cyanacrylat-Klebstoff an die Grenzfläche zwischen jedem Tero und seinem Polyethylen-Schlauch.

Dies befestigt den Tero an seiner Mikroantriebseinheit. Der Schutzmantel dient dazu, Mikroantriebe und den freiliegenden Tero-Draht vor Umwelteinflüssen zu schützen. Außerdem bietet er Halt beim Umgang während eines Experiments und verringert elektrisches Rauschen.

Wir verwenden einen 3D-gedruckten Kunststoffkegel. Es ist jedoch möglich, den Kegel aus anderen Materialien herzustellen, beispielsweise aus einem gebogenen Stück Sodametall. Man kann den Kunststoffkegel nehmen und eine Aluminiumfolien-Band an der inneren oder äußeren Oberfläche befestigen.

Setzen Sie zunächst drei 72er-Schrauben, die drei Sechzehntel Zoll lang sind, in die Seiten des Kegels ein und drehen Sie sie teilweise fest, während die Antriebsanordnung daran hängt. Setzen Sie den Kegel über den Antrieb. Achten Sie darauf, dass beide Masseleitungen unten aus der Antriebsanordnung herausgeführt sind.

Wickeln Sie den freiliegenden Teil des vier Zoll langen Erdungsdrahtes mehrmals um eine der 1-72-Schrauben und befestigen Sie die Schraube fest. Sichern Sie den Kegel an der Antriebsbasis, indem Sie die verbleibenden beiden Kegelschrauben festziehen. Die Herstellung des Mikroantriebsarrays ist nun abgeschlossen. Ihr Mikroantriebsarray ist mit 18 Teros in drei Referenzen bestückt.

Es ist zur Haltbarkeit in eine schützende Konus- und Deckelabdeckung eingefasst. Die fertige Antriebseinheit wiegt durchschnittlich 20 bis 25 Gramm.

Das fertige Treiber-Array wird mithilfe eines standardmäßigen chirurgischen Verfahrens implantiert. Wie Sie sehen können, ist der Treiber mit einem Vorverstärker-Chip und einem Bündel von Drähten verbunden, die das Signal zur Datenerfassungshardware und -software leiten. Wir haben Ihnen soeben gezeigt, wie man Teros herstellt und das Verfahren zur Konstruktion des Mikrotreiber-Arrays abschließt.

In diesem Video haben wir Ihnen gezeigt, wie man TEROs herstellt, wie man die TEROs für die Aufzeichnung in vivo belädt und konditioniert. Außerdem haben wir Ihnen gezeigt, wie man einen Kegel an das Mikrotreibersystem anbringt, um dessen Langzeitstabilität zu erhöhen. Die Herstellung des Mikrotreibersystems umfasst viele Arbeitsschritte. Seien Sie daher geduldig, gehen Sie vorsichtig mit den Elektroden um und stellen Sie sicher, dass alle Zwischenschritte ordnungsgemäß abgeschlossen werden.

Vielen Dank fürs Zuschauen und viel Erfolg bei Ihren Experimenten.