Reinigung und Visualisierung von Influenza A Virus Ribonukleoproteinkomplexe

Dieses Verfahren beginnt mit der Entfernung von Ablagerungen von der Grippe. Eine Viruslösung durch Zentrifugation. Die Virusmembran wird dann mit dem Detergens aufgebrochen und die Freisetzung an VR-NPS wird auf einem Glyceringradienten getrennt.

Zentrifugationsfraktionen aus dem Gradienten werden gesammelt und ein Aliquot jeder Fraktion wird durchgeführt. Auf einer SDS-Seite werden die mit Kumasiblau gefärbten Gele zur Bestimmung der Peakfraktionen, die V NPS-Fraktionen enthalten, dann durch Zentrifugation konzentriert und die gereinigten VRPs auf ein Kupfer-TEM-Probengitter aufgebracht, das dann für die Visualisierung der VRPs durch Transmissionselektronenmikroskopie negativ gefärbt wird. Hallo, ich bin WinCo Wu im Labor von Dr.Nellie Pane in der Abteilung für Zoologie an der University of British Columbia.

Ich bin Lindsay Weaver, ehemals vom Pane Lab. Heute zeigen wir Ihnen ein Verfahren zur Reinigung von Influenza, einem viralen Rippennukleoproteinkomplex. Dieses Verfahren nutzen wir in unserem Labor, um den nuklearen Import von Influenza, dem A-Virus in Gewebekulturzellen zu untersuchen.

Also lasst uns loslegen. Um das Experiment mit 750 Mikrolitern MNT-Puffer in ein 11 Millimeter x 34 Millimeter großes Beckman-Zentrifugenröhrchen aus Polycarbonat zu beginnen. Geben Sie anschließend 500 Mikroliter einer Lösung von zwei Milligramm pro Milliliter Influenza-A-Virus in das Röhrchen, pipeptieren Sie mehrmals auf und ab, um das Virus mit dem MNT-Puffer zu mischen.

Stellen Sie das Röhrchen nach dem Mischen in einen Rotor A TLA one 20.2 und zentrifugieren Sie es 10 Minuten lang in einer Beckman Optima max E Zentrifuge bei 109.000 mal G bei vier Grad Celsius. Wenn das Schleudern abgeschlossen ist, entfernen Sie den Überstand, reanimieren Sie es und suspendieren Sie das Pellet in einem 500-Mikroliter-Störungspufferwirbel. Das resuspendierte Pellet kräftig und anschließend bei 31 Grad Celsius für 20 Minuten in einem einor Thermomischer schütteln.

Wenn das Schütteln abgeschlossen ist, fahren Sie mit der Zentrifugation der Glyceringradienten-Sedimentgeschwindigkeit fort. Um den Glyceringradienten vorzubereiten, geben Sie das folgende Glycerin in ein Beckman UltraClear 13 Millimeter x 51 Millimeter Zentrifugenröhrchen, einen Milliliter 70 Vol.-% GLYCEROL 0,75 Milliliter, 50 % Glycerin 0,375 Milliliter, 40 % Glycerin und 1,8 Milliliter, 33 % Glycerin. Diese Glycerinlösungen werden durch Mischen von reinem Glycerin mit NM-Puffer hergestellt.

Bereiten Sie auch ein Ausgleichsröhrchen vor, das sowohl Glycerin als auch Puffer enthält. Werfen Sie dann die zerbrochene Virusprobe erneut vor und laden Sie sie auf den Glyceringradienten. Legen Sie das Röhrchen in einen Beckman MLS 50 Ausschwingrotor und zentrifugieren Sie den Gradienten drei Stunden und 45 Minuten lang bei 217.000 mal G bei vier Grad Celsius.

Nachdem die Zentrifugation abgeschlossen ist, werden manuell 250 Mikroliter Aliquots des Gradienten von der Oberseite des Röhrchens aus entnommen. Bewahren Sie die Fraktionen auf Eis oder bei vier Grad Celsius auf. Sobald die Fraktionen gesammelt sind, sind wir bereit, sie mit der SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese zu analysieren.

Um mit der SDS-Seitenanalyse zu beginnen, entnehmen Sie 20 Mikroliter aus jeder Fraktion in ein frisches Röhrchen. Fügen Sie dann fünf Mikroliter fünffachen SDS-Seiten-Probenpuffer hinzu und erhitzen Sie die Probe fünf Minuten lang auf 95 Grad Celsius. Nach dem Erhitzen schleudern Sie die Proben kurz herunter und laden Sie sie auf ein 10%iges Polyacrylamid-Gel mit Molekulargewichtsmarkern in einer der Vertiefungen. Führen Sie anschließend die Proben durch das Gel, bis der Bromphenolblau-Ladefarbstoff nahe am Boden des Gels angelangt ist.

Entfernen Sie das Gel aus dem SDS-Seitenapparat und färben Sie das Gel mit Kumasi-Blau. Identifizieren Sie anhand der Färbeergebnisse die Fraktionen, die hauptsächlich Influenza enthalten. Ein Nukleoprotein.

Der Influenza-A-NP ist etwa 56 Kilodalton groß und das wichtigste Protein, das in viralen Ribonukleoproteinkomplexen vorkommt. Die NP-Bande ist also im Allgemeinen die stärkste Bande in den Fraktionen, die das VRN ps enthalten. Im nächsten Teil werden wir diese VRNP-Fraktionen konzentrieren.

Kombinieren Sie die Glycerinfraktionen, die hauptsächlich NP enthalten, und verteilen Sie sie auf zwei 11 Millimeter x 34 Millimeter große Beckman-Zentrifugenröhrchen aus Polycarbonat, füllen Sie jedes Röhrchen mit Ethylpyrocarbonat oder DEPC-behandeltem Reinstwasser. Pipettieren Sie dann mehrmals auf und ab, um zu mischen. Legen Sie die Röhrchen in einen Beckman TLA one 20.2 Rotor und zentrifugieren Sie sie viereinhalb Stunden lang bei 157.000 Mal G bei vier Grad Celsius.

Wenn das Schleudern abgeschlossen ist, entfernen Sie den Überstand und suspendieren Sie das Pellet wieder. In 50 Mikrolitern aliquotiertem DEPC-behandeltem Wasser legt das gereinigte V NPS ein Aliquot beiseite und lagert die anderen bei minus 80 Grad Celsius. Jetzt sind wir bereit, mit der negativen Färbung von VRPs fortzufahren.

Verdünnen Sie einen Mikroliter gereinigtes VRNP in neun Mikroliter frisch hergestellten und zweimal gefilterten PBS-Pufferglühentladung in einem TEM-Probengitter aus Kupfer für 30 Sekunden. Dieses Gitter wurde zuvor mit einer Parlow Dion- und Carbonfolie beschichtet. Tragen Sie mit einer Pinzette das frisch glühende Probengitter auf und tragen Sie einen fünf Mikroliter verdünnten VRNP auf das Probengitter auf.

Lassen Sie den Tropfen acht Minuten lang auf dem Gitter einziehen, während Sie warten. Legen Sie einen kleinen Streifen Parfum in eine Schale und geben Sie dann zwei Tropfen mit je 10 Mikrolitern PBS-Puffer sowie einen 80-Liter-Tropfen der frisch hergestellten Färbelösung, die aus 1 % Ammonium-Meli-Dattel besteht, auf das Parfum. Waschen Sie nun das Probengitter, indem Sie es vorsichtig für eine Gesamtzeit von einer Minute in die beiden Tropfen PBS absenken.

Verwenden Sie dann ein Stück Filterpapier, um einen Teil der Probenlösung vom Probengitter abzuleiten, ohne das Probengitter trocknen zu lassen. Unmittelbar nachdem Sie den letzten Tropfen Puffer vom Probengitter abgezogen haben, tauchen Sie das Probengitter vollständig in das Fleckentröpfchen ein. Und warten Sie eine Minute.

Verwenden Sie nach einer Minute ein neues Stück Filterpapier, um die Fleckenlösung vollständig vom Probengitter abzuleiten. Lassen Sie das Probengitter vor der Betrachtung einige Minuten an der Luft trocknen. Unter einem Transmissionselektronenmikroskop sind hier repräsentative Transmissionselektronenmikroskopie-Aufnahmen von negativ gefärbten V nps.

Wie Sie hier sehen können, ähneln die V NPS stäbchenförmigen Partikeln mit variabler Länge, die etwa 30 Nanometer bis 120 Nanometer lang sind. Das oligomere NP ist als eine Kette von NP-Molekülen organisiert, die weiter zu einer doppelhelikalen Wiederholungsstruktur gefaltet ist. So sind manchmal Schleifen an beiden Enden dieser stäbchenförmigen Partikel zu sehen.

Wir haben Ihnen gerade gezeigt, wie Sie die Grippe reinigen und sichtbar machen können. Eine virale Rippe Nukleoprotein-Komplexe Bei diesem Verfahren. Es ist wichtig, bei der Verdünnung des VR-MPS kein PBS zu verwenden, wenn Sie Urinalacetat für die negative Färbung verwenden.

Das war's also. Vielen Dank fürs Zuschauen und viel Erfolg bei Ihren Experimenten.