Name: Messen in der Nähe Plasmamembran und Global intrazellulären Calcium-Dynamics in Astrozyten (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-04-26T23:27:00.000+00:00
Duration: 12 min 48 s
Description: Erfahren Sie die Messung globaler und membrannaher Calciumdynamiken in Astrozyten mittels Epifluoreszenz- und Totalreflexionsmikroskopie. Diese Methode ermöglicht simultane Aufnahmen für Einblicke in zelluläre Signalwege.

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Diese Arbeit wurde von der Uehara Memorial Foundation of Japan (ES) sowie die Whitehall-Stiftung, dem National Institute of Neurological Disorders and Stroke und ein Stein-Oppenheimer Endowment Award (für BSK) unterstützt.

Experimentelle Verfahren Das experimentelle Verfahren besteht aus zwei wichtigen Teilen, die in einem Schritt weise Weise beschrieben werden. Teil 1: Vorbereiten des Hippocampus Astrozyten KULTUREN Kurz gesagt wurden gemischt Hippocampus Astrozyten-Neuron Kulturen hergestellt unter Verwendung eines etablierten Protokoll 1,2,3. Wir optimieren das Verfahren zur gesunden kultivierten Astrozyten zu erhalten. Alle unten aufgeführten Schritte sollten in einer sterilen Umgebung wie einer Sterilbank durchgeführt werden. Vorbereitung Deckgläser <ul><li> 22 mm Deckgläser (VWR, 48380-068) </li><li> Poly-D-Lysin (PDL, Sigma P0899), Aliquots (1 mg / ml) </li><li> Laminin Aliquots (20 ug / ml): add 49 ml sterilem Wasser zu 1 mg / ml Laminin-Lösung (Sigma L2020) machen 1,2 ml aliquotiert und bei -20 ° C </li></ul><ol><li> Lösen PDL in sterilem Wasser (50 ug / ml) </li><li> Autoclave die Deckgläser mit sterilem Wasser und in PDL (20 ml für 100 Deckgläser) spülen. Lassen Sie über Nacht bei Raumtemperatur. </li><li> Ersetzen PDL mit sterilem Wasser (3 umfangreiche Waschgänge). Dann trocknen die Deckgläser und lagern bei 4 ° C. </li><li> Am Tag vor dem Ausplattieren der Astrozyten, statt einzelner Deckgläser in einer sterilen auch auf einer 6-well-Platte (Multiwell Flat-Bottom Platten mit Deckel, steril aus BD Bioscience). Legen Sie 400 ul von Laminin auf jedem Deckglas beimpft und über Nacht, in den Inkubator, um Verdunstung zu vermeiden. </li></ol> Zergliederung Dissection Medien: <ul><li> 500 ml Earle Balanced Salt Solution (EBSS) (1x), flüssig (Invitrogen, 14155-063) </li><li> 5 ml HEPES-Lösung (Sigma, H0887) </li></ul> Hippocampus Medien: <ul><li> 412,5 ml Minimum Essential Medium (MEM) (1x), flüssig Enthält Earle-Salzen, aber kein L-Glutamin oder Phenolrot (Invitrogen, 51200-038) </li><li> 10 ml Glucose (Sigma, D-(+)-Glucose wasserfrei SIGMA ULTRA G7528) 1 M in MEM </li><li> 5 ml Penicillin-Streptomycin (Invitrogen, 15140-122) </li><li> 5 ml Natriumpyruvat-Lösung (Sigma, S8636) </li><li> 12,5 ml HEPES-Lösung 1 M (Sigma, H0887) </li><li> 5 ml N-2 Supplement (100x), flüssig (Invitrogen, 17502-048) </li><li> 50 ml Pferdeserum, hitzeinaktiviertem (Invitrogen, 26050-088) </li></ul> Papain-Lösung: <ul><li> 5 ml Dissektion Medien in Worthington PAPAIN-022 Fläschchen (LK003178; Endkonzentration 20 U / ml) und bei 37 ° C für 60 min. </li></ul><ol><li> Enthaupten Rattenbabys im Alter von P1 (typischerweise 2 Welpen) folgende Richtlinien überprüft und durch nationale Vorschriften und Ihrem lokalen Institutional Animal Care und Verwenden Committee genehmigt. </li><li> Entfernen Sie Haut und Schädel und Gehirn Platz in Petrischale mit kaltem Dissektion Medien gefüllt. </li><li> Entfernt Meningen, sezieren beiden Hemisphären und sezieren hippocampi. </li><li> Hacken Sie die hippocampi in ~ 1X1 mm Stücke und verdauen in Papain-Lösung bei 37 ° C für 11-13 min. </li><li> Sobald die Teile des Gewebes niedergelassen haben, zu entfernen Papain sorgfältig und mit 5 ml Medium Hippocampus, um alle Spuren des Enzyms zu entfernen. Wiederholen Sie diesen Schritt und resuspendieren in Hippocampus-Medium (2 ml). </li><li> Man reibt die Zellen ~ 5 mal, bis keine Klumpen links, mit drei Flammen-polierten Pipetten immer kleiner Bohrungen (1000 mu m, ~ 500 um und ~ 300 Fm). </li><li> Sobald verrieben, pass die Zellen durch eine Zelle Sieb (Porengröße 70 um, BD Bioscience). Zählen Sie die Zellen in 10 ul Suspension. Stellen Sie die Lautstärke des Hippocampus Medium, um bis 400000 Zellen / ml haben. </li><li> Saugen Sie das Laminin aus dem Deckgläschen, und bevor die Abdeckungen können trocken, Platte 200 ul der Zellsuspension pro Deckglas. </li><li> Lassen Sie sie für 60 min in den Inkubator legen, und dann 2 ml Hippocampus Medium pro Vertiefung. </li><li> Am nächsten Tag absaugen alten hippokampalen Medium, um tote Zellen und Ablagerungen zu entfernen und 2 ml vorgewärmten frischen Hippocampus Medium. </li></ol> Wartung Neurobasal Medien: <ul><li> 500 ml Neurobasalmedium (Invitrogen, 12348-017) </li><li> 10 ml Serum B27 kostenlose Beilage (Invitrogen, 17504-044) </li><li> 5 ml Penicillin-Streptomycin (Invitrogen, 15140-122) </li><li> 1,25 ml L-Glutamin (Invitrogen, 25030-149) </li></ul> Feed the Astrozyten-Neuron Kulturen zweimal pro Woche mit Neurobasalmedium ab 4 Tage nach dem Ausplattieren. Vorinkubieren den Medien über 30 min im Inkubator in einem belüfteten Kolben auf die Temperatur und CO 2 ausgleichen. Teil 2: Kalzium-Imaging Hippocampus Aufzeichnungspuffer: 110 mM NaCl, 5,4 mMKCl, 1,8 mM CaCl 2, 0,8 mM MgCl 2, 10 mM D-Glucose, 10 mM HEPES (Alle Chemikalien von Sigma) pH 7,4 (eingestellt mit NaOH). Loading Kalzium-Indikator-Farbstoff in Astrozyten <ol><li> Legen Sie die Kultur in einem Brunnen auf einem 6-well-Platte mit 2 ml Hippocampus Aufnahme-Puffer mit 2,5 pM Fluo-4, AM (Invitrogen, F-14217) und 0,05% Pluronic ® F-127 20% ige Lösung in DMSO gefüllt (Invitrogen, P-3000MP) und bei Raumtemperatur für 10-30 min inkubieren. </li><li> Entfernen Fluo-4-Lösung und waschen Deckgläschen 3 mal mit Hippocampus Aufzeichnungspuffer und Inkubieren bei Raumtemperatur für 30 min. </li><li> Legen Sie das Deckglas auf die Kammer, und reinigen Sie die andere Seite des Deckglases mit Objektiv Reinigungsflüssigkeit. </li><li> Setzen Sie einen kleinen Tropfen Immersionsöl (Immersionsöl TYPE DF aus Cargille) auf dem Ziel und setzte Kammer (Open Kammer für 25 mm runde Deckgläschen von Warner Instruments) auf der Bühne des Mikroskops (Olympus IX71). </li><li> Schauen Sie sich die Zellen mit Hilfe von Durchlicht zu sehen, wie die Zellen aussehen, und sie in den Fokus. Dann leuchten die Zellen mit 488 nm aus einem Monochromator (Polychrome V von TILL Vision) und festzustellen, ob das Fluoreszenzsignal von Fluo-4 ist einheitlich und nachweisbar in Astrozyten. </li><li> Verwenden Sie EPI und TIRF Beleuchtung Kalzium in Astrozyten zu messen. </li></ol> TIRF-Mikroskopie Kurz gesagt, werden wir eine Olympus IX71 Mikroskop mit einem Andor IXON DV887DCS EMCCD-Kamera ausgestattet. Die Kontrolle der Anregungs-und Bildaufnahme erfolgt über TILLVision Software. Die Strahlen 454/488/515 nm Argon (100 mW) und 442 nm Festkörper (45 mW) Laser werden kombiniert und gesteuert mit einem TILL Polyline Laser Kombinierer, TIRF Dual-Port-Kondensator und acoustoptical abstimmbaren Filter und Controller (AOTF, alle aus TILL Photonics) und in einen Kineflex breitbandigen Glasfaser für die Einreise in die TIRF Kondensator. Wir verwenden eine Olympus 60X 1,45 NA Objektiv TIRF erreichen. Die Kamera zu gewinnen ist für jeden Astrozyten angepasst werden, um das beste Signal-Rausch-Bilder liefern. Der Hintergrund und Prinzipien der TIRF-Mikroskopie wurden kürzlich bewertet 4., 5. Die meisten der optischen Komponenten verwenden wir wurden von TILL Photonics, die jetzt Teil der Agilent Technologies (http://www.till-photonics.com/) erworben. Das TIR-Eindringtiefe kann aus den folgenden Gleichungen berechnet werden. <img style="float:left;" src="/files/ftp_upload/1142/equation.png" alt="Gleichung" /> d = Eindringtiefe n1 = Brechungsindex des Glases n2 = Brechungsindex der Zelle a = Einfallswinkel NAi = numerische Apertur von Inzidenz Um sicherzustellen, dass die Laser optimal für TIRF ausgerichtet wir finden es hilfreich, 100 nm fluoreszierende Kügelchen (Invitrogen, F8803) zu beobachten. Wir präsentieren Standbilder und Videos von Perlen mit EPI und TIRF-Mikroskopie. Wenn in TIRF, beobachtet man einen dramatischen Anstieg der Signal-Rausch-und die Perlen Display Brownschen Diffusion. Wir finden es sinnvoll, das Verhalten von 100 nm Perlen mit TIRF-Mikroskopie in regelmäßigen Abständen (~ einmal pro Woche), um sicherzustellen, dass eine optimale TIRF, tritt anstelle des kompromittierten Schrägbeleuchtung dass auftreten würden beobachten, ob der kritische Winkel nicht gleich α (siehe Abb. 1). Anwendung von G-Protein-gekoppelten Rezeptor-Agonisten Astrozyten ausdrückliche einer Vielzahl von Gq-gekoppelte Rezeptoren 6, 7, einschließlich metabotropen Glutamat-Rezeptoren und P2Y-Rezeptoren (Agonist, ATP, ADP). Die Aktivierung dieser Rezeptoren führt zu einem signifikanten Anstieg der intrazellulären Calcium-Spiegel innerhalb von Astrozyten. Zum Beispiel kann man leicht beobachten intrazellulären Calcium-Erhöhungen bei der Anwendung von ATP (30 nM) auf Astrozyten 8-10. Wir verwenden eine schnelle Lösung Switcher von Warner Instruments namens VC-77SP Fast-Step Perfusion System (http://www.warneronline.com/index.cfm). Mit dieser Methode Lösungen können in weniger als ~ 10 ms angewendet werden. <img src="/files/ftp_upload/1142/Fig 1a.jpg" alt="Abbildung 1" /> <img src="/files/ftp_upload/1142/fig1c.jpg" alt="" /> ABBILDUNG 1. Cartoon und Fotografien der Bildgebung einzurichten. A. zeigt ein Foto des Mikroskops auf einem Lufttisch montiert, während (B) zeigt ein Foto des Laser-Montage, Steuerungen und Strahl-Boxen. C. zeigt ein Foto des Mikroskoptisches mit der Kammer für die Bildgebung montiert. Auf der linken Seite der schnellen Perfusion Gerät gesehen werden kann (zusammen mit dem Schrittmotor-und Theta-Rohre) werden. Auf der rechten Seite der headstage eines Axopatch 200A Verstärker zu sehen ist. Die Karikatur schematisiert den Lichtweg in die Einrichtung und wie TIRF erreicht ist. Der Laser ist auf der hinteren Brennebene des 60X 1,45 NA Objektiv und seine Position fokussiert wird aus der Mitte so eingestellt, dass es in den Immersionsöl tritt am kritischen Winkel α. An diesem Punkt des Strahls leidet Totalreflexion und zerfällt mit einer Distanz λ (siehe Gleichung in Haupttext) in das Medium mit niedrigerem Brechungsindex. In diesem Fall ist dies die Aufzeichnungspuffer um den Astrozyten und den Astrozyten sich. Das Ergebnis ist optische Anregung (und damit imaging) von Molekülen innerhalb von ~ 100 nm der Plasmamembran. In der Karikatur der Zelle das ist so grün &quot;excited&quot; Membran-Rezeptoren gezeigt, während die innerhalb der Zelle oder auf der Oberseite der Zelle nicht angeregt werden. Eine vollständige Darstellung der TIRF-Mikroskopie wurde von Steyer und Almers 4 wurde zur Verfügung gestellt. <img src="/files/ftp_upload/1142/fig2.png" alt="Abbildung 2" /> ABBILDUNG 2. Images von 100 nm fluoreszierende Kügelchen mit EPI und TIRF-Mikroskopie erworben. A. Zeigt EPI Bilder ein Sichtfeld mit mehreren Dutzend 100 nm fluoreszierende Kügelchen. Die roten Pfeile zeigen auf Perlen, die auf das Deckglas niedergelassen haben, während die blauen Pfeilspitzen zu Perlen, die Diffusion in Wasser zeigen. B. Zeigt eine TIRF-Bild der gleichen Sichtfeld wie in A. In dieser Ansicht wird nur angezeigt, die Anhänger Perlen durch rote Pfeile dargestellt sichtbar sind. Dies liegt daran, diese auf das Glas coverlsip niedergelassen hatten und waren somit in der ~ 100 nm Evaneszentfeld. Die Perlen in A durch blaue Pfeile angezeigt werden, nicht innerhalb dieser Region und sind somit unsichtbar im TIRF Bilder. Die unteren Diagramme zeigen 3D-Rendering der Bilder. Es ist klar, dass eine starke Zunahme der Signal-Rausch-für Perlen im Evaneszentfeld tritt auf, wenn durch TIRF-Mikroskopie beobachtet. In der Tat für diese Bilder das Signal-Rausch-für EPI betrug 7,1 ± 0,6, während für TIRF es 20 war ± 0,7. <img src="/files/ftp_upload/1142/fig3.png" alt="Abbildung 3" /> ABBILDUNG 3. Images von Astrozyten mit Fluo-4 Calcium-Indikator-Farbstoff mit EPI und TIRF-Mikroskopie erworben geladen. A. EPI Bilder ein Sichtfeld mit fünf Astrozyten. B. A TIRF-Bild der gleichen Sichtfeld in B. Beachten Sie, dass die Bilder in A und B signifikant unterschiedlich dargestellt. Dies liegt daran, mit TIRF Beleuchtung nur der Plasmamembran Regionen in enger Apposition an der Deckglas abgebildet werden. Die unteren Bilder zeigen ATP-evozierte intrazellulären Calcium-Transienten mit EPI und TIRF-Mikroskopie abgebildet.

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<li>Shigetomi, E., Bowser, D. N., Sofroniew, M. V., Khakh, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two+forms+of+astrocyte+calcium+excitability+have+distinct+effects+on+NMDA+receptor-mediated+slow+inward+currents+in+pyramidal+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Two forms of astrocyte calcium excitability have distinct effects on NMDA receptor-mediated slow inward currents in pyramidal neurons.</a> J Neurosci. 28, 6659-6663 (2008).</li>
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</ol>

Es ist gut etabliert, dass Astrozyten intrazellulären Calcium-Erhebungen angezeigt. Diese spontan auftreten, kann durch neuronale Aktivität oder durch die Anwendung von Agonisten an Rezeptoren auf der Oberfläche 11 Astrozyten aktivieren ausgelöst werden. Eine wichtige und umstrittene Frage ist, ob Astrozyten intrazellulären Calcium-Erhebungen können die Freisetzung von Signalmolekülen, die Rezeptoren aktivieren auf Neuronen 11, 12 auslösen. Dies ist umstritten, weil es Beweise für und gegen diese Ansicht, wie in den Be...

<table><tbody><tr><td>VWR&amp;#174; Mikro-Deckgläser, rund, No. 1</td><td>Werkzeug</td><td>VWR international</td><td>48380-068</td><td></td></tr><tr><td>Poly-D-Lysin-Hydrobromid</td><td>Reagenz</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P0899</td><td></td></tr><tr><td>Laminin aus der Basalmembran des Engelbreth-Holm-Swarm-Mäusesarkoms</td><td>Reagenz</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L2020</td><td></td></tr><tr><td>Earle&amp;rsquo;s Balanced Salt Solution (EBSS) (1X), flüssig</td><td>Reagenz</td><td>Invitrogen</td><td>14155-063</td><td></td></tr><tr><td>Minimum Essential Medium (MEM) (1X), flüssig, enthält Earle&amp;rsquo;s Salze, jedoch kein L-Glutamin oder Phenolrot</td><td>Reagenz</td><td>Invitrogen</td><td>51200-038</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin, flüssig</td><td>Reagenz</td><td>Invitrogen</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Natriumpyruvat-Lösung</td><td>Reagenz</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S8636</td><td></td></tr><tr><td>HEPES-Lösung 1 M</td><td>Reagenz</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H0887</td><td></td></tr><tr><td>N-2 Supplement (100X), flüssig</td><td>Reagenz</td><td>Invitrogen</td><td>17502-048</td><td></td></tr><tr><td>Pferdeserum, hitzeinaktiviert</td><td>Reagenz</td><td>Invitrogen</td><td>26050-088</td><td></td></tr><tr><td>PAPASE-022</td><td>Reagenz</td><td>Worthington Biochemical</td><td>LK003178</td><td></td></tr><tr><td>Neurobasal&amp;#8482; Medium (1X), flüssig, ohne Phenolrot</td><td>Reagenz</td><td>Invitrogen</td><td>12348-017</td><td></td></tr><tr><td>B-27 Ergänzung ohne Serum (50X), flüssig</td><td>Reagenz</td><td>Invitrogen</td><td>17504-044</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamin-200 mM (100X), flüssig</td><td>Reagenz</td><td>Invitrogen</td><td>25030-149</td><td></td></tr><tr><td>Zellseiger</td><td>Werkzeug</td><td>BD Biosciences</td><td>352350</td><td></td></tr><tr><td>BD Falcon Mehrloch-Platten mit flachem Boden und Deckel, steril</td><td>Werkzeug</td><td>BD Biosciences</td><td>353046</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Reagenz</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7653</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Reagenz</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P3911</td><td></td></tr><tr><td>CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; Hexahydrat</td><td>Reagenz</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>21108</td><td></td></tr><tr><td>MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; Hexahydrat</td><td>Reagenz</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M2670</td><td></td></tr><tr><td>HEPES, freie Säure</td><td>Reagenz</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3375</td><td></td></tr><tr><td>D-(+)-Glucose</td><td>Reagenz</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G7528</td><td></td></tr><tr><td>Fluo-4, AM 1 mM Lösung in DMSO</td><td>Reagenz</td><td>Invitrogen</td><td>F-14217</td><td></td></tr><tr><td>Pluronic&amp;#174; F-127 20 %ige Lösung in DMSO</td><td>Reagenz</td><td>Invitrogen</td><td>P-3000MP</td><td></td></tr><tr><td>Immersionsöl TYPE DF</td><td>Mikroskop</td><td>Cargill Labs</td><td>16242</td><td></td></tr><tr><td>Offene Kammer für 25 mm runde Deckgläser, 100 &amp;mu;l Volumen</td><td>Werkzeug</td><td>Warner Instruments</td><td>64-0362 (RC-21BDW)</td><td></td></tr><tr><td>P-2 Plattform für Serie-20-Kammern, ohne Heizung</td><td>Werkzeug</td><td>Warner Instruments</td><td>64-0278 (P-2)</td><td></td></tr><tr><td>FluoSpheres Carboxylat-modifizierte Mikrokugeln, 0,1 &amp;mu;m, gelb-grün fluoreszierend (505/515), 2 % Feststoffe</td><td>Reagenz</td><td>Invitrogen</td><td>F8803</td><td></td></tr></tbody></table>

messen in der nähe plasmamembran und global intrazellulären calcium-dynamics in astrozyten

Measuring Near Plasma Membrane and Global Intracellular Calcium Dynamics in Astrocytes

Das Gehirn enthält Gliazellen. Astrozyten, eine Art von Gliazellen, sind seit langem bekannt, eine passive unterstützende Rolle zu Neuronen liefern. Allerdings schlägt immer deutlicher, dass Astrozyten kann auch aktiv in die Gehirnfunktion zu beteiligen durch funktionelle Interaktionen mit Neuronen. Allerdings bleiben viele grundlegende Aspekte der Astrozyten Biologie umstritten, unklar und / oder experimentell erforscht. Ein wichtiges Thema ist die Dynamik der intrazellulären Calcium-Transienten in Astrozyten. Dies ist relevant, weil Kalzium ist auch eine wichtige second messenger gegründet und weil es wurde vorgeschlagen, dass Astrozyten Kalzium Erhebungen können die Freisetzung von Transmittern aus Astrozyten auslösen. Allerdings gibt es keine detaillierte oder befriedigende Beschreibung der in der Nähe Plasmamembran Calcium-Signalgebung in Astrozyten wurden. Total Internal Reflection Fluorescence (TIRF)-Mikroskopie ist ein leistungsfähiges Werkzeug, um physiologisch relevante Signalwege innerhalb von etwa 100 nm der Plasmamembran von lebenden Zellen zu analysieren. Hier verwenden wir TIRF-Mikroskopie und beschreiben, wie man in der Nähe Plasmamembran und globale intrazellulären Calcium-Dynamik fast gleichzeitig zu überwachen. Die weitere Verfeinerung und systematische Anwendung dieses Ansatzes hat das Potenzial, über die genauen Details der Astrozyten Calcium-Signalgebung zu informieren. Ein detailliertes Verständnis der Astrozyten Calcium-Dynamik kann eine Grundlage zu verstehen, wenn, wie, wann und warum Astrozyten und Neuronen durchlaufen eine Calcium-abhängigen funktionellen Interaktionen.

Wir beschreiben, wie man in der Nähe Membran und globalen intrazellulären Calcium-Dynamik in kultivierten Astrozyten mit Totalreflexion und Epifluoreszenzmikroskopie messen.

Messen in der Nähe Plasmamembran und Global intrazellulären Calcium-Dynamics in Astrozyten

Das Gehirn enthält Gliazellen. Astrozyten, eine Art von Gliazellen, sind bereits seit langem dafür bekannt, eine passive unterstützende Funktion für Neuronen zu übernehmen. Jedoch ...

Im ersten Teil dieses Videos demonstrieren wir die Herstellung der Astrozyten-Neuronen-Kokultur. Dazu werden mehrere Hippocampi von P1-Ratten in einem Reagenzglas gesammelt, mit Pankreatin verdaut, durch Trituration dissoziiert und anschließend auf Deckgläsern ausplattiert. Der zweite Abschnitt zeigt, wie man die intrazellulären Kalziumdynamiken in Astrozyten misst. Dies beinhaltet das Beladen von Astrozyten mit dem Fluoreszenzfarbstoff Fluo-4 als Kalziumindikator sowie die Messung globaler Kalziumdynamiken mittels Epifluoreszenzmikroskopie und die Erfassung kalziumnaher Membrandyamiken mittels TIRF-Mikroskopie.Indem die Beleuchtung automatisch und schnell verändert wird, können sowohl das globale Kalzium als auch das Kalzium nahe der Membran nahezu gleichzeitig beobachtet werden. Hallo, ich bin Aji omi, Postdoktorandin im Budget-COS-Labor der Abteilung für Physiologie an der University of California Los Angeles. Heute zeigen wir Ihnen ein Verfahren zur Kalzium-Bildgebung von Astozyten.Wir verwenden dieses Verfahren in unserer Laborstudie zur Untersuchung der globalen Kalziumdynamik und der Kalziumdynamik nahe der Membran in einem Osteozyten. Durch die automatische und schnelle Änderung der Eliminierung können wir die globale Kalziumkonzentration und die Kalziumkonzentration nahe der Membran auflösen. Fast gleichzeitig werde ich zeigen, wie wir einen TP anwenden, um eine Kalziumerhöhung im Astrozyten hervorzurufen.Ich werde dann abschließen, indem ich die Barrieren zusammenfasse und die Methode zur Untersuchung von Astrozyten diskutiere. Beginnen wir mit der Untersuchung. Um die Astrozyten-Kultur zu starten, entfernen Sie die Haut und den Schädel aus dem Kopf eines dekapitierten Rattenwelpen.Platzieren Sie das Gehirn in einer Petrischale, die mit kaltem Dissektionsmedium gefüllt ist, dissezieren Sie beide Hemisphären und entfernen Sie die Hirnhäute. Danach dissezieren Sie die Hippocampi. Schneiden Sie die Hippocampi in etwa ein mal ein Millimeter große Stücke.11 bis 13 Minuten bei 37 Grad Celsius in Pappa-Lösung verdauen. Entnehmen Sie das dissezierte Gewebe aus dem Inkubator. Sobald die Gewebestücke abgesetzt haben, nehmen Sie sie vorsichtig aus der Propanverdauung heraus und geben Sie fünf Milliliter Hippocampus-Medium hinzu, um die zerkleinerten Hippocampus-Stücke zu waschen.Wiederholen Sie diesen Schritt und resuspendieren Sie abschließend in hippocampalem Medium. Pipettieren Sie die Zellen etwa fünfmal mit drei flammenglatten, sukzessive kleiner werdenden Pipetten. Nachdem die Zellen einmal durch einen Zellfilter mit einer Porengröße von 70 Mikrometern geführt wurden, geben Sie vier Milliliter Medium zum Filter hinzu.Zählen Sie die Zellen in 10 Mikrolitern Suspension. Passen Sie das Volumen des Hippocampus-Mediums an, um 400.000 Zellen pro Milliliter zu erhalten. Bereiten Sie nun Deckgläser für die Aussaat der Zellsuspension vor, indem Sie das Laminin von den Deckgläsern abpipettieren, die über Nacht einer Laminin-Lösung ausgesetzt waren.Bevor die Deckgläser getrocknet werden, pipettieren Sie 200 Mikroliter der Zellsuspension pro Deckglas. Lassen Sie die Zellen 60 Minuten im Inkubator anhaften. Fügen Sie nach der Inkubation zwei Milliliter Hippocampus-Medium pro Vertiefung hinzu.Am nächsten Tag das alte hippocampale Medium abpipettieren, um tote Zellen und Zelltrümmer zu entfernen, und zwei Milliliter frisches, vorgewärmtes hippocampales Medium hinzufügen. Die Erhaltungskultur von Astrozyten-Neuronen-Ko-Kulturen sollte vier Tage nach dem Ausplattieren beginnen, wobei einmal wöchentlich ein Milliliter frisches Neurobasal-Medium zweimal pro Woche zugegeben wird. Achten Sie darauf, das Medium vor der Anwendung etwa 30 Minuten im Inkubator in einem belüfteten Kolben vorzuinkubieren, um Temperatur und Kohlendioxid zu equilibrieren.Bevor man die Astrozyten untersucht, ist es sinnvoll, nano-fluoreszierende Kügelchen zu betrachten, um den Laserwinkel für die TURF-Mikroskopie zu optimieren. Dazu 200 Mikroliter Wasser auf die Petrischale geben, ein Mikroliter 100 Nanometer großer fluoreszierender Kügelchen hinzufügen und vermischen. Die Kügelchen mittels Epifluoreszenzmikroskopie betrachten. Anschließend die Kügelchen mittels TURF-Mikroskopie untersuchen.Platzieren Sie die Kultur für die Kalzium-Bildgebung in einer Mulde einer Sechs-Mulden-Platte, die mit zwei Millilitern hippocampalem Ableitpuffer gefüllt ist, der 2,5 Mikromolar Fluoh 4:00 AM und 0,05 % F1 27, 20 % Lösung in DMSO enthält, und inkubieren Sie sie bei Raumtemperatur für 10 bis 30 Minuten. Denken Sie daran, die Platte abzudecken, um eine Ausbleichung des Fluorophors zu vermeiden. Entfernen Sie anschließend die Fluoh-4-Lösung und waschen Sie die Deckgläser dreimal mit hippocampalem Ableitpuffer. Inkubieren Sie die gewaschenen Deckgläser bei Raumtemperatur für 30 Minuten.Legen Sie die Deckglasplatte in die Kammer, reinigen Sie die andere Seite des Deckglases mit Linsenreinigungsflüssigkeit und geben Sie 200 Mikroliter Hippocampus-Puffer hinzu. Geben Sie einen kleinen Tropfen Immersionsöl auf das Objektiv und stellen Sie die Kammer auf den Mikroskoptisch. Betrachten Sie die Zellen im Durchlicht, um zu fokussieren und das Erscheinungsbild der Zellen zu beurteilen.Als Nächstes beleuchten Sie die Zellen mit 488 Nanometern aus einer Monochromquelle und prüfen, ob das fluoreszierende Signal von flu oh four gleichmäßig und nachweisbar ist. In Astrozyten verwenden Sie Epi- und Turf-Beleuchtung, um das Kalzium in den Astrozyten zu messen. Hier werden fluoreszierende Kügelchen mittels Epi-Beleuchtung beobachtet.Neben der Erzeugung von Hintergrundfluoreszenz zeigen sie auch eine signifikante brownsche Bewegung in Abhängigkeit vom Beleuchtungswinkel. Wenn sich der Laser dem kritischen Winkel nähert, wird der Laserstrahl vollständig an der Grenzfläche zwischen Glas und Wasser reflektiert. Diese totale innere Reflexion erzeugt ein elektromagnetisches Feld, das als evaneszentes Feld bezeichnet wird.Dies hat eine Tiefe in die Zelle mit niedrigerem Brechungsindex von etwa 100 Nanometern. In dieser dünnen Schicht auf der Oberfläche des Präparats können Sie Fluoreszenzfarbstoffe anregen. Hier sind fluoreszierende Kügelchen dargestellt, die bei Durchlichtbeleuchtung im Vergleich zu Epi beobachtet wurden.Das Beleuchtungssignal-zu-Rausch-Verhältnis steigt deutlich an, wenn Sie den Winkel verringern. Der Laserstrahl wird an der Oberfläche nicht reflektiert und durchdringt die Deckglasauflage, um direkt die fluoreszierenden Kügelchen zu treffen. Sie können eine starke Hintergrundfluoreszenz erkennen.Jetzt erhöhen wir den Winkel. Erneut nimmt das Hintergrundrauschen deutlich ab, und Sie können fluoreszierende Kügelchen nahe der Oberfläche des Deckgläschens erkennen. Diese Bilder zeigen mit Flu oh vier beladene Astrozyten und Neuronen.Astrozyten sind flache Zellen mit feinen Fortsätzen, während Neuronen runde Zellkörper sowie dicke und lange Dendriten aufweisen. Sowohl Astrozyten als auch Neuronen sehen gesund aus und sind gut mit Flu. Oh vier korrekt beladen.Die Betrachtung von Astrozyten mittels Epi- oder konfokaler Mikroskopie ist hilfreich, um festzustellen, ob die Astrozyten gesund sind und ob die Kalziumindikatoren korrekt in die Astrozyten eingelagert wurden. In den Regionen des Astrozyten, die den als Footprint bezeichneten Bereichen nahe der Deckglaskammer am nächsten liegen, wird beobachtet, dass ein TP eine Kalziumerhöhung in der Nähe der Plasmamembran auslöst. Bekanntermaßen exprimieren hippokampale Astrozyten reine anergische Rezeptoren, und die Applikation eines TP ins Bad kann eine globale Kalziumfreisetzung hervorrufen.Wir haben Ihnen soeben gezeigt, wie man eine knochenbildende Osteozytenkultur aus dem Hippocampus präpariert und wie man den Kalziumspiegel in einem Osteozyten sowohl global als auch nahe der Plasmamembran misst. Bei der Durchführung dieses Verfahrens ist es wichtig, den Laserwinkel zu optimieren. Die beste Methode hierfür am Mikroskop ist die Beobachtung des Verhaltens bei Strömungsgeschwindigkeiten von 100 Millimeter pro Sekunde. Die simultane Aufzeichnung des globalen Kalziums und des Kalziums nahe der Membran liefert uns nicht nur eine detaillierte Beschreibung des Kalziumsignals, sondern auch neue Erkenntnisse über den Mechanismus der Kalziumregulation im Astrozyten.Es wurde uns außerdem bewusst, dass der hier beschriebene Ansatz nützlich ist, um die nahe der Membran und die globalen intrazellulären Kalziumspiegel in anderen erregbaren, bisher unbekannten erregbaren Bereichen zu messen. Das war's. Vielen Dank fürs Zuschauen und viel Erfolg bei Ihrem Experiment.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Biology

Biologie

Die Herstellung von akuten Hirnschnitten aus isolierten hippocampi, sowie die gleichzeitige elektrophysiologischen Ableitungen von Astrozyten und Neuronen...

Dual-Elektrophysiologische Recordings synaptisch-evozierte astrogliale und neuronale Antworten in Acute Hippocampusschnitte

Quelle: Bannai, H., et. al., Dissection of Local Ca2+ Signals in Cultured Cells by Membrane-targeted Ca2+ Indicators. J. Vis. (2019)Das Video demonstriert die Fluoreszenzbildgebung zur Beobachtung der kompartimentspezifischen spontanen Kalziumdynamik in Astrozyten durch sequentielle Überwachung von Kalzium-sensitiven Proteinen, die auf der Plasmamembran und dem endoplasmatischen Retikulum lokalisiert sind.

Spontane Kalzium-Bildgebung für kompartimentspezifische Dynamik in Astrozyten

Hier beschreiben wir eine Anpassung der Protokolle verwendet, um homöostatische Plastizität in Neuronen für die Untersuchung der Plastizität von Astrozyten G-Protein-gekoppelten Rezeptoren zu induzieren. Kürzlich verwendet werden, um Veränderungen in Astrozyten Gruppe I mGluRs mit jungen Mäusen zu untersuchen, kann das Verfahren auf die Skalierung der verschiedenen Astrozyten GPCRs zu messen, in Gewebe von erwachsenen Mäusen in situ und in vivo, und ein besseres Verständnis für die...

Induktion von Plastizität Astrozytäre Rezeptoren durch Manipulation der neuronalen Feuerraten

Die Eigenschaften und Funktionen der intrazellulären Ca2+-Signale der Astrozyten im Striatum sind noch unvollständig erforscht. Wir beschreiben Methoden zur Expression genetisch kodierter Calciumindikatoren in striatalen Astrozyten unter Verwendung von Adeno-assoziierten Viren des Serotyps 2/5 (AAV2/5) sowie Verfahren zur zuverlässigen Abbildung von Ca2+-Signalen in striatalen Astrozyten in situ.

Abbildungsintrazellulären Ca 2+ Signale in Striatal Astrozyten von erwachsenen Mäusen mit gentechnisch-kodierte Kalzium Indikatoren

Die hier beschriebene AWESAM-Protokoll ist optimal für die Kultivierung von murinen Astrozyten isoliert von anderen Gehirnzellen in eine schnelle, einfache und kostengünstige Weise. AWESAM Astrozyten weisen spontane Ca2 + -Signalisierung, Morphologie und gen Expressionsprofile Astrozyten in Vivoähnlich.

In VivoKultivierung-wie Murine Astrozyten über das schnelle, einfache und kostengünstige AWESAM-Protokoll

Hier demonstriert werden Protokolle zur intakten zerebralen Endothelzellen "Röhren" und (2) die gleichzeitige Messung von endothelialen Kalzium und Membranpotential im Endothel-derived Hyperpolarisation (1) frisch zu isolieren. Des weiteren können diese Methoden für die pharmakologische Optimierung von Endothelzellen Kalzium und elektrische Signalisierung als Einzel- oder interaktive experimentellen Variablen.

Gleichzeitige Messung von intrazellulären Calcium und Membrane Potential in frisch isolierte und intakte Maus zerebralen Endothel

Hier präsentieren wir ein Protokoll für Ca2 + Bildgebung in Neuronen und Gliazellen, die das Sezieren von Ca2 + Signale in subzellulären Auflösung ermöglicht. Dieser Prozess gilt für alle Zelltypen, die die Expression von genetisch codierte Ca2 + Indikatoren zu ermöglichen.

Dissektion der lokalen Ca2 + Signale in kultivierten Zellen durch die Membran-gezielte Ca2 + Indikatoren

Hier beschreiben wir eine In-vitro-Live-Imaging-Methode zur Visualisierung des intrazellulären Transports von Organellen und des Handels mit Plasmamembranproteinen in murinen Astrozyten. Dieses Protokoll stellt auch eine Bildanalysemethodik zur Bestimmung von Frachttransportrouten und Kinetik dar.

Visualisierung und Analyse des intrazellulären Transports von Organellen und anderen Ladungen in Astrozyten

Dieses Proktokol zielt darauf ab, eine Methode für die in vitro und in vivo mitochondriale Ca2+ Bildgebung in Astrozyten und Neuronen bereitzustellen.

Bildgebung der mitochondrialen Ca2+ Aufnahme in Astrozyten und Neuronen unter Verwendung von genetisch kodierten Ca2+ Indikatoren (GECIs)

Die aktuellen Methoden beschreiben einen nicht-ratiometrischen Ansatz für die hochauflösende, subkompartimentelle Kalziumbildgebung in vivo in Caenorhabditis elegans unter Verwendung leicht verfügbarer genetisch kodierter Kalziumindikatoren.

Subzelluläre Bildgebung des neuronalen Calcium-Handlings in vivo

Dieses Protokoll bietet eine umfassende Beschreibung einer Methode zur gleichzeitigen Aufzeichnung von Kalziumsignalen von Neuronen und Astrozyten über mehrere gedächtnisbezogene Hirnregionen hinweg und demonstriert deren Anwendung während eines Lern- und Gedächtnisverhaltensparadigmas.

Eine zweifarbige Faserphotometriemethode zur Aufzeichnung der Aktivität von Astrozytenneuronen über mehrere Gehirnregionen während des Lern- und Gedächtnisverhaltens

Erfahren Sie die Messung globaler und membrannaher Calciumdynamiken in Astrozyten mittels Epifluoreszenz- und Totalreflexionsmikroskopie. Diese Methode ermöglicht simultane Aufnahmen für Einblicke in zelluläre Signalwege.

Messen in der Nähe Plasmamembran und Global intrazellulären Calcium-Dynamics in Astrozyten

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