Name: Isolation von Protoplasten aus Geweben von 14-Tage alte Keimlinge von Arabidopsis thaliana /em (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-08-17T00:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 16 s
Description: Lernen Sie die Isolierung intakter Protoplasten aus 14 Tage alten Arabidopsis thaliana Keimlingen. Diese Methode nutzt Enzymverdau und Dichtegradienten für zellbiologische Assays.

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Diese Arbeit wurde von der Cornell University Agricultural Experiment Station (CUAES) NYC-125433 Hatch Grant und Cornell unterstützt Start-Up zum OKV gewährten Zuschusses

Teil 1. Vorbereitung der festen Medium für den Anbau von Pflanzen. Wir typischerweise Kultur Pflanzen konzentriert Murasige und Skoog (MS)-Medium mit 1% Saccharose und 0,7% Agar. Es enthält alle notwendigen Zutaten, um die Pflanzen gesund. Für die Herstellung von 1L MS-, Medien-pH-Wert 5,7 <ol><li> Add 2,15 g MS-Pulver in 800 ml Wasser in 1,5-2.0L autoklavierbar Flasche. </li><li> Legen Sie einen Rührstab in die Flasche und lösen MS Pulver durch Rühren Medium auf eine mitreißende Platte. </li><li> Unter Rühren hinzufügen, Tropfen für Tropfen, bis 1N KOH pH-Wert von MS-Medium auf 5,7 einstellen. </li><li> Fügen Sie 10 g Saccharose, immer schön rühren. </li><li> Add 7 g Agar *. </li><li> Passen Sie das endgültige Volumen der vorbereiteten mittel-bis 1000 ml und durch Autoklavieren sterilisieren .* </li><li> Legen Sie autoklavierten Medium auf eine mitreißende Platte und cool it down Rühren, so dass Agar nicht Niederschlag am Boden der Flasche. Cool down mittel-bis ~ 60 ° C * </li><li> Gießen Sie 100 mm Petrischalen. Keep Platten bei 4 ° C. </li></ol> * Tipp 1: Versuchen Sie nicht, Agar aufzulösen. Es wird beim Autoklavieren zu lösen. * Tipp 2: Halten Sie das Rühren bar in eine Flasche beim Autoklavieren, du wirst es später brauchen. * Tipp 3: Wenn Sie Sie die Hände auf dem autoklavierten Flasche für 10 s halten kann, bedeutet dies, dass das Medium ausreichend abgekühlt hat, und Sie können beginnen Gießen Platten. Part 2. Pflanzenmaterial und Wachstumsbedingungen. <ol><li> Sterilisieren Samen von Arabidopsis thaliana <ol><li> Platz 100 mg Samen in Eppendorf Reaktionsgefäße und 1 ml 70% Ethanol. Gut mischen und inkubieren für 2 min. Spin Körnern, saugen Sie den Überstand. </li><li> 1 ml 1,8% Bleichmittel-Lösung * mit 0,1% Tween-20. Mix für 10 min. Spin down Samen und saugen Bleichlösung. </li><li> Dieser Schritt muss in einer Sterilbank durchgeführt werden. 1 ml sterilem Wasser, Samen, gut mischen. Spin down Samen, saugen Wasser. Wiederholen Sie diesen Schritt 5 mal. </li></ol></li><li> Spread-Samen auf den vorbereiteten in Schritt 1 Platten (100 Korn / Platte). </li><li> Halten gesetzten Platten für 24-48 h bei 4 ° C im Dunkeln für die Stratifizierung. </li><li> Wachsen Pflanzen für 14 Tage in der Klimakammer mit 8 h light/16 h dunkel Photoperiode (bei ​​einer photosynthetischen Photonenflussdichte von 250 mmol m -2 s -1) bei 23 / ​​19 ° C hell / dunkel Temperatur-Regime und 75% relative Feuchte. </li></ol> * Tipp 1: Bleach-Lösung wird-up durch Verdünnung eines Haushalts Clorox, mit 6% Natriumhypochlorit und Zugabe von Tween-20 bis zu einer Endkonzentration von 0,1%. Teil 3. Isolation von Protoplasten aus Arabidopsis-Keimlinge. <ol><li> Scheiben von 2 g 14-Tage alte Keimlinge mit einer frischen Rasierklinge in 15 ml Filter-sterilisiert TVL Solution. Wir hacken Pflanzenmaterial in sterile Einweg-Petrischalen. </li><li> Transfer gehackte Gewebe in 200 ml Becherglas mit 20 ml Filter-sterilisiert Enzymlösung, wirbeln den Becher zu lassen Gewebe mischen sich mit Enzymlösung, mit Parafilm und Alufolie abdecken. </li><li> Schütteln Sie Pflanzengewebe bei 35 Umdrehungen pro Minute im Dunkeln bei Raumtemperatur für 16-18 h. </li><li> Sammeln Sie die Freigabe Protoplasten in 50 ml Falcon-Röhrchen durch Sieben bis 8 Schichten der Gaze, pre-Nass-in W5-Lösung. </li><li> Sieve Protoplasten aus der Käse-Tuch noch einmal durch Waschen Sie das Tuch mit 15 ml W5-Lösung. </li><li> Sorgfältig Overlay Protoplasten mit 10 ml W5-Lösung, stören die Zucker-Gradienten; Zentrifuge für 7 min bei 100 g. </li><li> Sammeln Sie 10 ml des Protoplasten an der Schnittstelle von Enzymlösung und W5-Lösung (Abb. 1B) und an einem neuen 50 ml Falcon-Röhrchen. </li><li> 15 ml W5-Lösung, Zentrifuge für 5 min bei 60 g. Entfernen Sie den Überstand. </li><li> Wash Protoplasten frei von Enzymlösung durch Resuspendieren Protoplasten in 15 ml W5-Lösung, Zentrifuge 5 min bei 60 g </li><li> Entfernen Sie den Überstand resuspendieren pelletiert Protoplasten in 1-3ml W5-Lösung. </li><li> Bewerten Protoplasten Ausbeute durch Zellzählung mit einer Zählkammer. </li></ol> Teil 4. Reagenzien: TVL: 0,3 M Sorbit, 50 mM CaCl 2 Filter-sterilisiert und bei -20 ° C. Enzymlösung: 0,5 M Saccharose, 10 mM MES-KOH [pH 5,7], 20 mM CaCl 2, 40 mM KCl, 1% Cellulase (Onozuka R-10), 1% Macerozyme (R10). Filter-sterilisiert und frisch verwenden. W5-Lösung: 0,1% (w / v) Glucose, 0,08% (w / v) KCl, 0,9% (w / v) NaCl, 1,84% (w / v) CaCl 2, 2 mM MES-KOH pH 5,7. Filter-sterilisiert und bei Raumtemperatur lagern. Teil 5: Repräsentative Ergebnisse: Mit Arabidopsis Kulturbedingungen in den Teilen 1 und 2 beschrieben macht gesunde Setzlinge, geeignet für die Isolierung von Protoplasten (Abb. 1A). Protoplasten werden durch Saccharose Dichtegradient gereinigtHNO-Zentrifugation gesammelt und an der Schnittstelle von W5 und Enzym-Lösungen (Abb. 1B). Mit Protoplastenisolierung Verfahren in Teil 3 beschrieben wir in der Regel Ernte 05 bis 10 Oktober 6 von intakten Protoplasten (Abb. 1C) von einem Gramm frische Keimlinge. <img src="/files/ftp_upload/1149/Fig1.jpg" alt="Abbildung 1" /> Abbildung 1. Isolation von Protoplasten aus Arabidopsis-Keimlinge. A, Gewebe aus 14-Tage alte Keimlinge von Arabidopsis gesammelt wurden, und konvertierte zum Protoplasten durch ein modifiziertes Verfahren (Chen und Halkier, 2000). B, wurden Protoplasten durch Saccharose-Dichtegradientenzentrifugation gereinigt und gesammelt an der Schnittstelle von Enzymlösung und W5 Uffer (weiße Pfeile). C, Hellfeld-Mikroskopie von Protoplasten. Mikrophotographien wurden mit Hilfe einer gekühlten CCD-Kamera eine Schnittstelle mit dem Zeiss Axioskop 2 plus Mikroskop.

<ol><li>Cocking, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Method+for+the+Isolation+of+Plant+Protoplasts+and+Vacuoles%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A Method for the Isolation of Plant Protoplasts and Vacuoles.</a> Nature. 187, 962-963 (1960).</li>
<li>Chen, S., Halkier, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+glucosinolate+uptake+by+leaf+protoplasts+of+Brassica+napus%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Characterization of glucosinolate uptake by leaf protoplasts of Brassica napus.</a> J Biol Chem. 275, 22955-22960 (2000).</li>
<li>Robert, S., Zouhar, J., Carter, C., Raikhel, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+intact+vacuoles+from+Arabidopsis+rosette+leaf-derived+protoplasts%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protocols%22%5BJournal%5D)">Isolation of intact vacuoles from Arabidopsis rosette leaf-derived protoplasts.</a> Nat. Protocols. 2, 259-262 (2007).</li>
<li>Yoo, S. D., Cho, Y. H., Sheen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Arabidopsis+mesophyll+protoplasts%3A+a+versatile+cell+system+for+transient+gene+expression+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Arabidopsis mesophyll protoplasts: a versatile cell system for transient gene expression analysis.</a> Nat Protoc. 2, 1565-1572 (2007).</li>
<li>Zhai, Z., Sooksa-nguan, T., Vatamaniuk, O. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishing+RNAi+as+a+reverse+genetic+approach+for+gene+functional+analysis+in+protoplasts%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Phys%22%5BJournal%5D)">Establishing RNAi as a reverse genetic approach for gene functional analysis in protoplasts.</a> Plant Phys. 149, 642-652 (2009).</li>
</ol>

Die vorläufige Patentanmeldung beschreibt dieses Verfahren für den Einsatz in funktionellen Analysen von Pflanzen-Genen wurden mit Cornell Center For Technology Enterprise und Vermarktung (CCTEC), Juni 2008 eingereicht worden. Docket No 50341/015001: Vatamaniuk, OK, und Zhai, Z. Methode zur schnellen funktionellen Analysen von Pflanzen-Genen.

Um die hohe Ausbeute an intakten Protoplasten ist es sehr wichtig, um Start-up mit gesunden Pflanzen. Verwenden Sie Filter-sterilisiert Lösungen für die Isolierung von Protoplasten. Beachten Sie, dass Protoplasten zerbrechlich sind. Deshalb, wenn Sie Handling Protoplasten, nicht zu verwechseln, Pipette oder Wirbel zu heftig, da es bremst sie. Stattdessen mischen Protoplasten durch langsam drehende oder Abkleben der Zentrifugenröhrchen. Die beschriebene Vorgehensweise ergeben intakte Protoplasten, die lebensfähig sind fü...

<table><tbody><tr><td>Murashige-und-Skoog-Basalzuckermischung (MS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M5524</td><td></td></tr><tr><td>Agar</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A1296</td><td></td></tr><tr><td>Petri-Schalen (100x15 mm)</td><td>Krackeler Scientific, Inc.</td><td>82-4001</td><td></td></tr><tr><td>Cellulase (Onozuka R&amp;#8208;10)</td><td>Research Products International Corp.</td><td>C32200</td><td></td></tr><tr><td>Macerozyme (R10)</td><td>Research Products International Corp.</td><td>M22010</td><td></td></tr><tr><td>Käsetuch-Tücher</td><td>Fisher Scientific</td><td>06-665-29</td><td></td></tr><tr><td>LabRotator</td><td>Fisher Scientific</td><td>1167152Q</td><td></td></tr><tr><td>Allegra X&amp;#8208;15R Zentrifuge</td><td>VWR international</td><td>392932</td><td></td></tr><tr><td>Axioskop 2 Plus Mikroskop</td><td>Carl Zeiss, Inc.</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

isolation von protoplasten aus geweben von 14-tage alte keimlinge von arabidopsis thaliana</em

Isolation of Protoplasts from Tissues of 14-day-old Seedlings of Arabidopsis thaliana

Protoplasten sind Pflanzenzellen, die hatten ihre Zellwände enzymatisch entfernt haben. Isolation von Protoplasten aus verschiedenen pflanzlichen Geweben wurde erstmals berichtet, mehr als 40 Jahren<sup&gt; 1</sup&gt; Und hat sich seitdem so angepasst, dass eine Vielzahl von zellulären Prozessen, wie subzelluläre Lokalisierung von Proteinen, die Isolierung von intakten Organellen und gezielte Gen-Inaktivierung durch doppelsträngige RNA-Interferenz (RNAi)-Studie<sup&gt; 2-5</sup&gt;. Die meisten der Protoplastenisolierung Protokolle verwenden Blattgewebe von reifen Arabidopsis (zB 35-Tage alte Pflanzen)<sup&gt; 2-4</sup&gt;. Wir modifizierten bestehenden Protokollen durch den Einsatz von 14-Tage alten Arabidopsis-Keimlinge. In diesem Verfahren ergab ein Gramm 14-Tage alte Keimlinge 5 10<sup&gt; 6</sup&gt; -10<sup&gt; 7</sup&gt; Protoplasten, dass intakte mindestens 96 Stunden bleiben. Die Ausbeute an Protoplasten aus Sämlingen ist vergleichbar mit Zubereitungen aus Blättern von Arabidopsis reifen, sondern von 35-36 Tagen, Isolierung von Protoplasten wird in 15 Tagen abgeschlossen. Dies ermöglicht die Verringerung der Zeit und das Wachstum münden, die für die Isolierung von Protoplasten, wenn reifen Pflanzen verwendet werden, erforderlich sind, und beschleunigt den Downstream Studien, dass intakte Protoplasten erfordern.

Dieses Video zeigt ein Verfahren zur Isolierung von intakten Protoplasten aus Geweben des 14-Tage alte Keimlinge von Arabidopsis. Da die isolierten Protoplasten intakt bleiben für mindestens 96h und sind aus Sämlingen statt einer Monate alten reifen Pflanzen isoliert, beschleunigt dieses Verfahren Assays erfordert intakte Protoplasten.

Isolation von Protoplasten aus Geweben von 14-Tage alte Keimlinge von Arabidopsis thaliana</em

Protoplasten sind Pflanzenzellen, bei denen die Zellwände enzymatisch entfernt wurden. Die Isolation von Protoplasten aus verschiedenen Pflanzengeweben wurde erstmals ...

Dieses Verfahren beginnt am Tag 14 mit dem Ausplattieren von Arabidopsis-Samen auf MS-Agar. Nachdem die Samen gekeimt sind, werden die Sämlinge gesammelt und in Scheiben geschnitten. Das Pflanzenmaterial wird anschließend in einer Enzymlösung digeriert, die die Zellwand abbaut.Das resultierende Gemisch wird durch ein Mulltuch filtriert, um die Protoplasten von anderen Pflanzenbestandteilen zu trennen. Die gesammelten Protoplasten werden anschließend durch Schichtung mit W-five-Lösung in einem Saccharose-Dichtegradienten weitergereinigt. Die Protoplasten reichern sich an der Grenzfläche zwischen der Enzym- und der W-five-Lösung an.Sie werden gesammelt und vor dem Experimentieren gewaschen. Hallo, ich bin Jang Ja aus dem Labor von Lina Wauk am Department für Nutzpflanzen- und Bodenwissenschaften der Cornell University. Heute zeigen wir Ihnen ein Verfahren zur Isolierung intakter Photosysteme aus 14 Tage alten TH von aro Ana.Wir verwenden dieses Verfahren in unserem Labor, um die subzelluläre Lokalisation der Proteine von Interesse zu untersuchen, intakte Organellen zu isolieren und eine funktionelle Analyse des Gens mittels doppelsträngiger RNI-Interferenz durchzuführen. Beginnen wir also. Wir starten das Verfahren, indem wir 0,5-fache MS-Platten herstellen, die mit 1 % Saccharose und 0,7 % Agar für einen Liter Medium ergänzt sind.Wiegen Sie 2,15 Gramm MS-Pulver ab. Geben Sie es in 800 Milliliter Wasser in einer 1,5-Liter-sterilisierbaren Flasche mit einem Rührstab und rühren Sie das Medium auf einer Rührplatte um das Pulver unter Rühren aufzulösen. Geben Sie unter ständigem Rühren tropfenweise eine normale Kalilauge hinzu, um den pH-Wert auf 5,7 einzustellen.Setzen Sie das Rühren fort und geben Sie 10 Gramm Saccharose hinzu. Als Nächstes fügen Sie sieben Gramm Agar hinzu, der sich nicht auflöst, sich aber später während der Autoklavierung auflösen wird. Und schließlich stellen Sie das Volumen auf 1000 Milliliter ein.Die MS-Nährlösung durch Autoklavieren bei 121 Grad Celsius für 20 Minuten sterilisieren. Den Rührstab nach dem Autoklavieren in der Flasche belassen. Die Nährlösung auf einem Rührgerät umrühren, um sie auf etwa 60 Grad Celsius abzukühlen.Das Rühren während des Abkühlens verhindert, dass sich das Agar am Boden der Flasche absetzt. Wenn man seine Hände zehn Sekunden lang auf die Flasche legen kann, ist das Medium ausreichend abgekühlt und die Platten können gegossen werden. Zum Gießen des Mediums in Petrischalen mit den Maßen 150 mal 15 Millimeter in die Sicherheitswerkbank wechseln.90 Milliliter pro Platte. Lagern Sie die Platten bei vier Grad Celsius. Da die Platten nun wachsen, sind die Pflanzen bereit.Bereiten wir die Arabidopsis-Samen vor. Beginnen Sie mit dem Anzüchten der Pflanzen, indem Sie die Arabidopsis-Samen zur Aufbringung auf eine Petrischale sterilisieren. Geben Sie Samen in eine Einweg-Mikrozentrifugenrobe in einer Menge, die einem Volumen von 50 Mikrolitern entspricht.Zuerst mit Ethanol sterilisieren, indem man ein Milliliter 70 %igen Ethanol hinzugibt und mischt. Die Probe zwei Minuten lang gut mit dem Ethanol inkubieren, wobei die Samen sedimentieren. So viel Ethanol wie möglich mit einer Pipette entfernen, anschließend mit Bleiche sterilisieren, indem man ein Milliliter einer Bleiche-Tween-Lösung hinzugibt und 10 Minuten lang durch Vortexen alle zwei bis drei Minuten mischt.Um die Entfernung der Bleichlösung zu erleichtern, zentrifugieren Sie die Samen kurz und pipettieren Sie so viel wie möglich der Lösung ab. Der letzte Sterilisationsschritt erfolgt in einer laminaren Luftströmungskabine. Geben Sie ein Milliliter sterilem Wasser zu den Samen hinzu und mischen Sie gründlich.Geben Sie den Samen einen kurzen Schleudergang und aspirieren Sie das Wasser. Wiederholen Sie diese Wasserwäsche noch viermal. Nachdem die Samen sterilisiert sind, verteilen Sie sie auf der MS-Platte.Nach dem Ausbringen der Samen die beimpften Platten 24 Stunden bei vier Grad Celsius im Dunkeln zur Stratifikation aufbewahren. Nach der 24-stündigen Inkubation die Pflanzen in eine Wachstumskammer überführen und 14 Tage lang kultivieren. Bei einem Licht-Dunkel-Rhythmus von acht Stunden Licht und 16 Stunden Dunkelheit sind die 14 Tage alten Keimlinge anschließend zur Ernte bereit.Nachdem die Sämlinge zwei Wochen lang gewachsen sind, ist es Zeit, die Protoplasten im Sicherheitswerkbank vorzubereiten. Verwenden Sie eine frische Rasierklinge, um zwei Gramm Sämlinge in 15 Milliliter filtratsterilisierter TVL-Lösung in einer Petrischale zu schneiden. Überführen Sie anschließend das geschnittene Gewebe in einen 200-Milliliter-Becher, der mit Aluminiumfolie umwickelt ist.Geben Sie 20 Milliliter frisch zubereitete, filtersterilisierte Enzymlösung hinzu, um die Pflanzenzellwand abzubauen. Schwenken Sie das Becherglas, um die Lösung zu mischen, und bedecken Sie es mit Biofilm und Aluminiumfolie, um das Gewebe im Dunkeln zu halten. Schütteln Sie das Pflanzengewebe anschließend 16 Stunden bei Raumtemperatur in der Enzymlösung. Am Ende der Inkubation mit der Enzymlösung sammeln Sie die freigesetzten Protoplasten durch Filtration der Mischung durch acht Lagen vorgeweiteter Mullbinde in eine 50-Milliliter-Falcon-Röhrchen, wobei die Mullbinde zuvor mit W5-Lösung benetzt wurde. Gewinnen Sie die verbleibenden Protoplasten, indem Sie die Mullbinde langsam mit 10 Millilitern W5-Lösung nachspülen. Die Protoplasten befinden sich nun im Falcon-Röhrchen. Überlagern Sie die Protoplasten vorsichtig mit fünf Millilitern WW5-Lösung.Stellen Sie sicher, dass Sie den Zuckergradienten, der durch die Zugabe der W fünf-Lösung entstanden ist, nicht stören. Zentrifugieren Sie anschließend die Protoplasten sieben Minuten lang bei 100 G. Die Protoplasten sammeln sich an der Grenzfläche zwischen der Enzymlösung und der W fünf-Lösung. Sammeln Sie 10 Milliliter Flüssigkeit an dieser Grenzfläche.Überführen Sie die gesammelten Protoplasten in ein neues 50-Milliliter-Falcon-Röhrchen und geben Sie 15 Milliliter W5-Lösung hinzu. Zentrifugieren Sie anschließend fünf Minuten bei 60 × g. Nach der Zentrifugation entfernen Sie den Überstand und resuspendieren die Protoplasten in 15 Milliliter W5-Lösung.Zentrifugieren Sie die Protoplasten erneut fünf Minuten lang bei 60 × g. Entfernen Sie nach der Zentrifugation den Überstand und das Resuspendiermedium. Suspendieren Sie die pelletierten Protoplasten in ein bis zwei Milliliter W5-Lösung.Beurteilen Sie abschließend die Ausbeute an Protoplasten durch Zellzählung mit einem Hämozytometer unter dem Mikroskop. Das hier beschriebene Kultivierungsverfahren ergibt gesunde Arabidopsis-Keimlinge, die nach der Verdauung und Trennung über ein Dichtegradient geeignet sind, Protoplasten zu isolieren. Die Gewinnung von einem Gramm frischen Keimlingen ergibt typischerweise fünf bis zehn mal 10 hoch sechs intakte Protoplasten.Wir haben Ihnen gezeigt, wie man Protoplasten aus 14 Tage alten Decken von Aosis isoliert. Bei Durchführung dieses Verfahrens ist es sehr wichtig zu beachten, dass der Erfolg von gesunden Pflanzen abhängt. Daher ist es wichtig, ein steiles Verhältnis zwischen Stecklingen und Platten beizubehalten und die in diesem Protokoll für Netmills, ms festgelegten Vorgaben einzuhalten.Mittel pro Platte. Abschließend beachten Sie, dass die Port-plus-Seit sehr empfindlich sind. Sobald die Zelle entfernt wurde, das Probenglas vorsichtig durch Auf- und Abbewegen mischen, anstatt zu wirbeln, und sorgfältig behandeln.Das war's. Vielen Dank fürs Zuschauen. Viel Erfolg mit Ihrem Experiment.

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