Isolation von Protoplasten aus Geweben von 14-Tage alte Keimlinge von Arabidopsis thaliana

Dieses Verfahren beginnt mit dem Plattieren der Arabidopsis-Samen auf Ms.Agar am 14. Tag. Nachdem die Samen gekeimt sind, werden die Sämlinge gesammelt und in Scheiben geschnitten. Das Pflanzenmaterial wird dann in einer Enzymlösung verdaut, die die Zellwand aufbricht.

Die resultierende Mischung wird durch ein Käsetuch gesiebt, um die Protoplasten von anderem Pflanzenmaterial zu trennen. Die gesammelten Protoplasten werden auf einem Saccharose-Dichtegradienten weiter gereinigt, indem sie mit W fünf Lösung überlagert werden. Die Protoplasten konzentrieren sich an der Grenzfläche zwischen dem Enzym und der W-Fünf-Lösung.

Sie werden gesammelt und gewaschen, bevor experimentiert wird. Hallo, ich bin Jang Ja aus dem Labor von Lina Wauk am Department of Crop and Soil Sciences an der Cornell University. Heute zeigen wir Ihnen ein Verfahren zur Isolierung von intakten Fotos von 14 Tage alten TH von aro Ana.

Wir verwenden dieses Verfahren in unserem Labor, um die subzelluläre Lokalisation der Proteine zu untersuchen, die für die Isolierung intakter Organellen und für die funktionelle Analyse von Genen mittels doppelsträngiger RNI-Interferenz von Interesse sind. Also lasst uns loslegen. Wir beginnen das Verfahren mit der Vorbereitung von 0,5-fachen MS-Platten, die mit 1% Saccharose und 0,7% Agar auf einen Liter Medium ergänzt werden.

Wiegen Sie 2,15 Gramm MS-Pulver ab. Geben Sie 800 Milliliter Wasser in eine autoklavierbare 1,5-Liter-Flasche mit einem Rührstab darin und rühren Sie das Medium auf einer Rührplatte um, um das Pulver unter Rühren aufzulösen. Geben Sie tropfenweise ein normales Kaliumhydroxid hinzu, um den pH-Wert auf 5,7 einzustellen.

Fahren Sie mit dem Rühren fort und fügen Sie 10 Gramm Saccharose hinzu. Als nächstes fügen Sie sieben Gramm Agar hinzu, das sich nicht auflöst, sondern sich später beim Autoklavieren auflöst. Und zum Schluss stellen Sie das Volumen auf 1000 Milliliter ein.

Sterilisieren Sie das MS-Medium, indem Sie es 20 Minuten lang bei 121 Grad Celsius autoklavieren. Halten Sie den Rührstab nach dem Autoklavieren in der Flasche. Rühren Sie das Medium auf einer Rührplatte um, um es auf ca. 60 Grad Celsius abzukühlen.

Durch das Rühren während des Kühlens wird verhindert, dass sich das Agar am Boden der Flasche ausfällt. Wenn man in der Lage ist, die Hände 10 Sekunden lang auf der Flasche zu halten, dann ist das Medium ausreichend abgekühlt und die Platten können eingegossen werden. Gehen Sie zur Haube, um das Medium in 150 x 15 Millimeter große Petrischalen zu gießen.

90 Milliliter pro Platte. Lagern Sie die Platten bei vier Grad Celsius. Jetzt, da die Platten gewachsen sind, sind die Pflanzen fertig.

Bereiten wir die Arabidopsis-Samen vor. Beginnen Sie mit dem Anbau der Pflanzen, indem Sie die Arabidopsis-Samen sterilisieren, um sie auf einer Petrischale zu beschichten. Geben Sie die Samen in ein einor Mikrozentrifugenröhrchen in einer Menge, die 50 Mikrolitern Volumen entspricht.

Zuerst mit Ethanol sterilisieren, indem ein Milliliter 70%iges Ethanol hinzugefügt und gemischt wird. Inkubieren Sie zwei Minuten lang gut mit dem Ethanol, während dieser Zeit sedimentieren die Samen. Nehmen Sie mit einer Pipette so viel Ethanol wie möglich heraus, sterilisieren Sie dann mit Bleichmittel, indem Sie einen Milliliter einer Bleichmittellösung hinzufügen und 10 Minuten lang mischen, indem Sie alle zwei bis drei Minuten vortexen.

Um das Entfernen der Bleichlösung zu erleichtern, schleudern Sie die Samen kurz herunter und spritzen Sie so viel wie möglich aus der Lösung. Der letzte Sterilisationsschritt wird in einer Laminar-Flow-Haube durchgeführt. Gib einen Milliliter steriles Wasser zu den Samen und verrühre sie.

Schleudern Sie die Samen kurz herunter und saugen Sie das Wasser ab. Wiederholen Sie diese Wasserwäsche noch viermal. Jetzt, da die Samen sterilisiert sind, verteilen Sie sie auf der MS-Platte.

Bewahren Sie die gesäten Platten nach dem Ausbringen der Samen 24 Stunden lang bei vier Grad Celsius im Dunkeln auf, um sie zu schichten. Nach der 24-stündigen Inkubation überführen Sie die Pflanzen in ein Wachstum und lassen Sie sie 14 Tage lang wachsen. Bei acht Stunden Licht und 16 Stunden Dunkelheit sind die 14 Tage alten Setzlinge dann bereit für die Ernte.

Nachdem die Sämlinge nun zwei Wochen lang gewachsen sind, ist es an der Zeit, die Protoplasten in der Haube vorzubereiten. Schneiden Sie mit einer frischen Rasierklinge zwei Gramm Sämlinge in 15 Milliliter filtersterilisierter TVL-Lösung in einer Petrischale. Übertragen Sie anschließend die gehackten Taschentücher in ein 200-Milliliter-Becherglas, das in Alufolie eingewickelt ist.

Fügen Sie 20 Milliliter frisch zubereitete filtersterilisierte Enzymlösung hinzu, um die pflanzliche Zellwand aufzubrechen. Schwenken Sie das Becherglas, um es zu mischen, und bedecken Sie es mit Biofilm und Aluminiumfolie, um das Taschentuch im Dunkeln zu halten. Schütteln Sie das Pflanzengewebe in der Enzymlösung 16 Stunden lang bei Raumtemperatur.

Am Ende der Inkubation mit der Enzymlösung sammeln Sie die freigesetzten Protoplasten in ein 50-Milliliter-Falkenröhrchen, indem Sie die Mischung durch acht Schichten Käsetuch in W 5 Lösung vortränken und die restlichen Protoplasten durch langsames Waschen des Käsetuchs mit 10 Millilitern W fünf Lösung waschen. Die Protoplasten werden nun in der Falkenröhre gesammelt. Überlagern Sie die Protoplasten vorsichtig mit fünf Millilitern WW-Fünf-Lösung.

Achten Sie darauf, den durch die Zugabe der Lösung W fünf gebildeten Zuckergradienten nicht zu stören. Anschließend werden die Protoplasten sieben Minuten lang bei 100 G zentrifugiert. Die Protoplasten sammeln sich an der Grenzfläche zwischen der Enzymlösung und der W 5-Lösung. Sammeln Sie 10 Milliliter Flüssigkeit an der Grenzfläche.

Die gesammelten Protoplasten werden in ein neues 50-Milliliter-Falkenröhrchen umgefüllt und 15 Milliliter W fünf Lösung hinzugefügt. Dann fünf Minuten lang bei 60 g zentrifugieren. Nach der Zentrifugation wird der Überstand entfernt und die Protoplasten in 15 Millilitern W fünf Lösung resuspendiert.

Auch hier zentrifugieren Sie die Protoplasten fünf Minuten lang bei 60 g. Entfernen Sie nach der Zentrifugation die Schlinge und die Reanimation. Die pelletierten Protoplasten werden in ein bis zwei Millilitern W fünf Lösung suspendiert.

Bewerten Sie schließlich die Protoplastenausbeute durch Zellzählung mit einem Hämozytometer unter dem Mikroskop. Das hier beschriebene Kultivierungsverfahren liefert gesunde Arabidopsis-Keimlinge, die sich für die Isolierung von Protoplasten nach der Verdauung und Trennung auf einem Dichtegradienten eignen. Die Ernte von einem Gramm frischer Sämlinge ergibt in der Regel fünf- bis zehnmal 10 bis sechs intakte Protoplasten.

Wir haben Ihnen gezeigt, wie Sie Protoplasten von der 14 Tage alten Obergrenze der Aisis isolieren können. Wenn Sie dieses Verfahren durchführen, ist es sehr wichtig, sich daran zu erinnern, dass der Erfolg von gesunden Pflanzen abhängt. Daher ist es wichtig, ein Steil-Platten-Verhältnis einzuhalten und legt in diesem Protokoll für Nettofräsen ms.

Medium pro Platte. Denken Sie schließlich daran, dass die Port Plus sehr zerbrechlich sind. Sobald die Zelle entfernt ist, den Handle-Put-Bus vorsichtig mischen, indem Sie tippen, anstatt zu wirbeln und auf und ab vorzubereiten.

Das wars. Danke für das Aufpassen. Viel Glück bei Ihrem Experiment.