Murine Renal Transplantation

Das Verfahren zur Nierentransplantation bei der Maus beginnt mit der Entnahme eines Spenderorgans, bei der die linke Niere von der Spendermaus entfernt und auf Eis gelagert wird. Die rechte Niere wird von der Empfängermaus entfernt, um Platz für die Spenderniere zu schaffen. Anschließend wird die Spenderniere vom Eis genommen und in die Empfängermaus transplantiert.

Der Maus wird eine Erholungsphase von vier Tagen gewährt, bevor die verbleibende native Niere entfernt wird. Nach sieben Tagen werden die Kreatininwerte mithilfe eines I STAT tragbaren klinischen Analysators überwacht, um die Transplantatfunktion zu beurteilen. Hallo, ich bin Sarah Heimer aus dem Labor von Dr. Greg Hadley und der Abteilung für Transplantationschirurgie der Ohio State University.

Heute werden wir Ihnen ein Verfahren zur Nierentransplantation bei der Maus zeigen. Die Nierentransplantationsoperation, die Sie heute sehen werden, wird von unserer erfahrenen Fachärztin für Neurochirurgie, Jing Wing, durchgeführt. Bitte verwenden Sie dieses Verfahren in unserem Labor, um die immunologischen Vorgänge der Transplantatabstoßung sowie Strategien zur Verhinderung einer Abstoßung zu untersuchen.

Beginnen wir also. Um die Entnahme des Spenderorgans einzuleiten, wird ein Zwickgriff durchgeführt, um sicherzustellen, dass das Tier vollständig anästhesiert ist. Innerhalb eines sterilen Feldes und unter Verwendung sterilisierter Instrumente führen Sie einen medianen Schnitt am anästhesierten Maus von Sternum bis Schambein durch und legen die linke Niere frei, indem Sie den Darm seitlich nach rechts verlagern, um die Perfusionsentnahme der Spender-Niere vorzunehmen. Legen Sie TY-4-8-0-Seidennähte um die Aorta und die untere Hohlvene unterhalb und oberhalb der Nierenarterie und -vene an.

Langsam in situ über die Aorta infrarenalis mit kalter, heparinisierten Ringer-Lactat-Lösung perfundieren. Die linke Niere isolieren, indem die Nebennieren- und Hodengefäße sowie einige Lendenäste mit einer 8-0-Seidennaht abgebunden und durchtrennt werden. Anschließend das Zusammenflussgebiet von Aorta und Vena cava inferior mit der linken Nierenarterie und -vene freilegen und vier 8-0-Seidennähte um Aorta und Vena cava inferior unterhalb und oberhalb der Nierenarterie und -vene anlegen.

Um Blutungen zu minimieren, ligieren Sie zuerst die Aorta unterhalb des Nierengefäßes. Dann dissezieren Sie den linken Harnleiter vom Nierenhilus bis zur Harnblase frei. Exponieren Sie die Harnleiter-Blasen-Schleimhautverbindung unter Verwendung einer Koda-Retraktion am Blasendom.

Unter sorgfältiger Vermeidung des rechten Ureters wird ein kleines, elliptisches Stück der Harnblase, das die linke Ureterovesikalverbindung enthält, ausgeschnitten. Dieses Stück wird für die harnableitende Rekonstruktion mittels einer Blasen-zu-Blasen-Anastomose verwendet. Anschließend wird die Aorta oberhalb der Nierenarterie und -vene ligiert.

Langsam die Rafts in situ über die infrarenale Aorta mit kalter, heparinisierten Ringer-Lactat-Lösung perfundieren. Die Aorta schräg etwa zwei Millimeter unterhalb der Nierenarterie teilen. Schließlich die Niere zusammen mit ihrem Gefäßversorgungsgebiet und dem an das Blasenpatch angehefteten Harnleiter entfernen.

Die Niere sollte bis zur Transplantation in den Wirtsempfänger in Ringer-Laktatlösung auf Eis aufbewahrt werden, und die Spendermaus sollte unter Anästhesie durch Halswirbelverrenkung euthanasiert werden. Wie zuvor gezeigt, wird die Transplantation beim Empfänger mit einem Zupinzeln begonnen, um sicherzustellen, dass das Tier vollständig anästhesiert ist. Um die Operation zu beginnen, führen Sie einen medianen Hautschnitt durch, bedecken Sie den Darm mit feuchter Gaze und ziehen Sie ihn vorsichtig nach links zurück.

Um diese Nierentransplantation erfolgreich abzuschließen, muss eine Anastomose zwischen der aortalen Manschette des Spenders und der Aorta des Empfängers durchgeführt werden. Die renale Vene des Spenders wird mit der unteren Hohlvene des Empfängers verbunden und der Blasenpatch des Spenders mit der Blase des Empfängers ligiert. Die rechte Harnleiter-Nierenarterie und -vene.

Entfernen Sie die Niere nach der Ligatur. Isolieren Sie die Lendenäste vorsichtig und klemmen Sie die infrarenale Aorta und die untere Hohlvene mit zwei mikrovaskulären Klammern mit einer Breite von vier Millimetern ab. Führen Sie einen 10-0-Nylon-Faden durch die volle Dicke der Aorta und ziehen Sie diese zur Seite, um durch einen einzigen Schnitt, der etwa ein Fünftel des Gefäßdurchmessers beträgt, eine ovale Aortotomie anzulegen.

Als Nächstes wird eine longitudinale Venotomie durchgeführt, indem die untere Hohlvene mit einer 30-Gauge-Nadel durchstochen und mithilfe einer Mikroschere entsprechend erweitert wird. Spülen Sie sowohl die Aorta als auch die untere Hohlvene mit heparinisiertem Kochsalzlösung aus, um intraluminäres Blut oder Gerinnsel zu entfernen. Entnehmen Sie die Spender-Niere aus dem Eis und platzieren Sie sie in der rechten Flanke der Maus.

Platzieren Sie zwei Halte-Nähte am proximalen und distalen Apex der Aortotomie des Empfängers mit der aortalen Manschette des Spenders. Führen Sie eine end-seitige Anastomose zwischen der aortalen Manschette des Spenders und der vorderen Wand der Aortotomie des Empfängers mit zwei bis drei kontinuierlichen 10-0-Nylon-Nähten an der Außenseite der Aorta durch. Drehen Sie danach das Nierentransplantat des Spenders zur linken Flanke des Empfängers um.

Wiederholen Sie das vorherige Vorgehen zwischen dem aortalen Cuff des Spenders und der hinteren Wand der Aorta des Empfängers. Es ist wichtig, sich daran zu erinnern, dass die Anastomosierung von Vene und Arterie innerhalb von 20 Minuten abgeschlossen sein muss. Während der Anastomosierung sollte das Transplantat außerdem mehrmals mit kalter Kochsalzlösung gespült werden.

Führen Sie eine end-seitige Anastomose zwischen der Nierengefäßvene des Spenders und der hinteren Wand der unteren Hohlvene des Empfängers mit vier bis fünf kontinuierlichen 10-0-Nylon-Nähten an der Innenseite der Vena cava inferior durch. Verschließen Sie die vordere Wand der Vena cava inferior und die Nierengefäßvene des Spenders mit vier bis fünf kontinuierlichen Nähten außerhalb der Vena cava inferior. Der nächste Schritt ist die Teilung des Blasendomes des Empfängers.

Stoppen Sie die Blutung mit der elektrischen Koagulation. Sobald die Stabilisierung abgeschlossen ist, führen Sie einen kleinen Schnitt an der Blasenkuppel durch, setzen zwei Haltefäden aus 10-0-Nylon ein, um den kleinen Spenderblasenlappen mit der Empfänger-Blasenkuppel zu anastomosieren, und vernähen Sie jede Seite der Anastomose mit acht bis zehn kontinuierlichen Nähten. Schließen Sie den Bauch abschließend in zwei Schichten mit kontinuierlichen 4-0-Nähten aus steriler, synthetischer, resorbierbarer Vicryl-Nahtmaterial.

Die postoperative Versorgung beginnt mit der Verabreichung einer einmaligen intramuskulären Injektion von Penicillin. Der Transplantatempfänger erhält außerdem am Tag null und Tag eins nach der Operation 0,05 Milligramm pro Kilogramm Buprenorphin intramuskulär zur Schmerzlinderung sowie einen kontinuierlichen Vorrat an Wasser, das Sulfa-Trim enthält. Die ersten 24 Stunden nach der Operation wird das Tier in einem temperaturgeregelten Inkubator gehalten.

Hautnähte werden zwei Wochen nach der Operation entfernt. Die Entfernung der verbleibenden nativen Niere ist entscheidend, damit der Rückgang der Transplantatfunktion mittels Messung der Serumkreatininwerte überwacht werden kann. Sie wird typischerweise vier bis sieben Tage nach der initialen Transplantation der Spenderniere durchgeführt und umfasst die wesentlichen Arbeitsschritte, die bei der Entfernung der Niere aus der Spendermaus angewandt werden.

Die Isofluran-Anästhesie wird verwendet, um das Wirtstier zu sedieren, damit Blutproben entnommen werden können. Die quantitativen Kreatininwerte im Vollblut aus der retroorbitalen Region dienen als Messgröße zur Beurteilung der Transplantatfunktion und werden mit einem tragbaren I-Stat-Klinikanalysator bestimmt. Konventionelle Einheiten werden in SI-Einheiten umgerechnet, indem die konventionellen Einheiten mit 88,4 multipliziert werden.

Die Konzentration von Kreatinin wird in Mikromol pro Liter angegeben. Die Tiere erholen sich in der Regel zwei bis drei Stunden nach der Operation und zeigen nach der Entfernung der verbleibenden nativen Niere ein normales Mausverhalten. Das Überleben des Tieres hängt von der Nierenfunktion des Transplantats ab, die durch tägliche Untersuchungen der allgemeinen Gesundheit des Tieres und des Kreatininspiegels beurteilt werden kann.

Bestimmung von Vollblut mit einem tragbaren i-STAT-Klinikanalysator als Referenz. Ein nicht-transplantiertes normales Mausmodell weist einen Kreatininspiegel nahe 20 Mikromolar auf. Eine Nierentransplantatdysfunktion wird angenommen, wenn die Maus Anzeichen einer Erkrankung zeigt und der Kreatininspiegel nahe 100 Mikromolar erhöht ist.

Wir haben Ihnen soeben die Vorgehensweise für die Nierentransplantation bei der Maus gezeigt. Obwohl dieses Verfahren technisch anspruchsvoll ist, hatte unser Labor große Erfolge bei der Durchführung. Damit ist alles gesagt.

Vielen Dank fürs Zuschauen und viel Erfolg bei Ihren Experimenten.