Live-Imaging von Gliazellen Migration in der Drosophila Eye Imaginalscheibe

Wir sezieren die Larven, indem wir das hintere und vordere Ende greifen und die Pinzette in entgegengesetzte Richtungen ziehen. Überschüssiges Gewebe wird mit einer feinen Schere abgetrennt. Dadurch werden die beiden Hälften der larvalen Gehirnaugen-Imaginalanlagen sichtbar.

Das ventrale Nervenband und die Mundhaken. Der larvale Augen-Gehirn-Komplex wird in eine Kulturschale überführt. Wir trennen das Gehirnläppchen vom optischen Stiel, um die Migration von Gliazellen innerhalb einer Wildtyp-Augen-Imaginalanlage sichtbar zu machen.

Um gestoppte Gliazellen im Optikstiel eines Mutanten zu beobachten, lassen wir den Gehirnlappen am Optikstiel angeheftet. Ich bin Patrick Cafferty aus dem Labor von Vanessa Als am Fachbereich Zoologie der University of British Columbia. Hallo, ich bin Rin.

Sie auch. Heute zeigen wir Ihnen ein Verfahren zur Visualisierung wandernder Gliazellen im sich entwickelnden Drosophila-Auge. Wir verwenden dieses Verfahren in unserem Labor, um die Entwicklung von Gliazellen zu untersuchen. Beginnen wir also.

Eine Woche vor Beginn des Experiments werden Fliegen gekreuzt, um Larven zu erzeugen, die GFP unter Kontrolle eines glialen spezifischen Promotors exprimieren. Dieses Experiment beinhaltet die Visualisierung von GFP, das mit einer nukleären Lokalisierungssequenz markiert ist und in Gliazellen exprimiert wird. Unter Verwendung des umgekehrten Polaritäts-Promotors bereiten Sie 18 Millimeter runde Deckgläser mindestens einen Tag im Voraus vor, indem Sie sie 10 Minuten lang in einer 1 %igen Poly-L-Lysin-Lösung einweichen und anschließend am Vortag des Experiments über Nacht lufttrocknen lassen.

Reinigen Sie eine magnetische Kulturkammer mit Kette, indem Sie ihre Bestandteile am Tag des Experiments über Nacht in 70 % Ethanol einweichen. Bereiten Sie das Kulturmedium unter aseptischen Bedingungen vor. Geben Sie fetalen Kälberserum, Penicillin-Streptomycin-Lösung und Insulin zu 10 Milliliter Schneiders Insektenmedium hinzu.

Lassen Sie die saubere, magnetische Kulturschale in einer Zellkulturschutzschleuse an der Luft trocknen, bevor Sie restliches Ethanol durch Spülen mit vorbereitetem Kulturmedium abwaschen. Sobald diese Vorbereitungen abgeschlossen sind, kann die Dissektion des Drosophila-Augen-Gehirn-Komplexes beginnen. Wählen Sie zu Beginn dieses Verfahrens eine Larve im dritten Larvenstadium von der Seite eines Fläschchens und legen Sie sie für mehrere Minuten zur Abkühlung in einen Tropfen gekühltes Kulturmedium auf eine Petrischale auf Eis.

Es wird empfohlen, die Larven abzukühlen, um die peristaltischen Körperkontraktionen zu verlangsamen und die Dissektion zu erleichtern. Anschließend wird die gekühlte Larve in einen Tropfen Kulturmedium auf einer Sard-beschichteten Schale unter dem Dissektionsmikroskop gegeben. Mit einem Paar feiner Dumont-Forceps wird die Larve festgehalten. Ungefähr ein Drittel vom hinteren Ende entfernt wartet man, bis die Larve ihre Mundhaken am vorderen Ende hervorstülpt; sobald die Mundhaken vollständig ausgefahren sind, werden sie mit einem zweiten Paar Forceps ergriffen.

Um die Larven zu sezieren, ziehen Sie langsam die beiden Pinzettenpaare in entgegengesetzte Richtungen. Der Augen-Gehirn-Komplex zusammen mit Speicheldrüsen, Fettkörpern und imaginärem Gewebe löst sich vom Larvenkörper. Ziehen Sie nicht zu schnell an den Mundhaken, da sie sonst vom iBrain-Komplex abreißen können.

Entfernen Sie Speicheldrüsen, Fettkörper und Imaginalanlagen. Mit feinsten Scheren bleiben die beiden Gehirnhälften sowie die Augenanlagen am ventralen Nervenstrang und den Mundhaken befestigt. Legen Sie danach ein 18 Millimeter großes Deckglas auf einen Objektträger, wobei eine Kante des Deckglases über die Kante des Objektträgers hinausragen soll. Um das Deckglas später leicht aufnehmen zu können, geben Sie einen Tropfen Kulturmedium auf das Deckglas.

Greifen Sie mit einer Pinzette die Mundhaken und übertragen Sie den iBrain-Komplex in das Kulturmedium auf dem Deckglas. Sobald der Augen-Gehirn-Komplex auf das Deckglas übertragen wurde, verwenden Sie eine feine Präzisionsschere, um die Mundhaken vom Augen-Gehirn-Komplex abzuschneiden.

Die Entfernung der Mundhaken ist für die Live-Bildgebung wichtig, da die Mundhaken in dem Kulturmedium weiterhin kontrahieren und dadurch das Gewebe während der Mikroskopie bewegen würden. Um die GL im Optikstiel sichtbar zu machen, lassen Sie den Gehirn-Optikstiel und die Augen-Imaginalscheibe intakt. Um die gliale Migration innerhalb der Augen-Imaginalscheibe zu visualisieren, schneiden Sie vorsichtig den Optikstiel, das dünne Gewebe, das das Gehirn und die Augenscheibe verbindet, durch und schieben Sie das Gehirn beiseite oder entsorgen Sie es.

Heben Sie schließlich den Deckglaser mit einer Pinzette auf und zeichnen Sie mit einem Permanentstift einen Kreis unterhalb des gewünschten Gewebes. Dieser Kreis erleichtert später die Lokalisierung des Gewebes für die Mikroskopie. Nun ist die Augen-Imaginalplatte bereit, in einer magnetischen Kulturkammer montiert zu werden.

Um die Augen-Imaginalanlage in einer magnetischen Kulturkammer zu montieren, greifen Sie mit einer Pinzette die hängende Kante der Deckglasplatte und übertragen diese vorsichtig auf die Bodenplatte der magnetischen Kammern der Chain-Line-Reihe, ohne das im Kulturmedium befindliche Gewebe zu stören. Danach setzen Sie den Silikon-O-Ring auf den Hauptkörper der Chain-Line-Kammer. Bringen Sie den Hauptkörper langsam auf der Bodenplatte an.

Geben Sie Kulturmedium in die Kammer. Fügen Sie das Kulturmedium nicht zu schnell hinzu, da das Gewebe sonst gestört wird, um den Gasaustausch unter der Abdeckung zu ermöglichen. Füllen Sie die Kammer nicht vollständig, sondern legen Sie vorsichtig die unsichtbare Abdeckung auf die Kammer mit der gestrichelten Linie.

Um wandernde Gliazellen zu visualisieren, stellen Sie die Kulturkammer auf den Objekttisch eines konfokalen oder Fluoreszenzmikroskops. Suchen Sie die Probe unter niedriger Vergrößerung mithilfe des Kreises auf dem Deckglas als Referenz. Fokussieren Sie die Probe mit einem 40-fachen Objektiv.

Lassen Sie das Gewebe absetzen und nehmen Sie alle 10 bis 15 Minuten über einen Zeitraum von drei bis vier Stunden hinweg Bilder der Augenscheibe oder der Optikasehne auf, sofern das Verfahren korrekt durchgeführt wurde. Dieses Protokoll führt zu einer Bildserie, auf der GFP-markierte Gliazellen zu sehen sind, die aus der Optikasehne in die imaginale Augenscheibe wandern. Während eine Live-Bildgebung über einen Zeitraum von 60 Minuten ausreichte, um Positionsveränderungen der Gliazellkerne bei einer wildtypischen imaginale Augenscheibe zu beobachten, verließen die Gliazellkerne bei einem Mutanten für ein für die Gliazellmigration notwendiges Gen die Optikasehne vollständig nicht.

Wir haben Augen-Gehirn-Komplexe bis zu 240 Minuten lang kultiviert, bevor wir eine Schädigung des kultivierten Gewebes beobachteten. Ab dem Zeitpunkt von 240 Minuten beginnen wir, GFP-positive Zellen im Kulturmedium um die kultivierten Augen-Gehirn-Komplexe herum zu beobachten. Zudem sammelt sich GFP in diffusen Flecken im gesamten Gewebe an, was auf eine Beeinträchtigung der Gewebeintegrität hindeutet.

Wir haben Ihnen gerade gezeigt, wie man Imaginalanlagen kultiviert, um die Migration von Gliazellen zu untersuchen. Vielen Dank fürs Zuschauen und viel Erfolg bei Ihren Experimenten.