Name: Die Quantifizierung der Hefe Chronologisches Life Span durch Auswachsen von gealterten Zellen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-05-06T00:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 24 s
Description: Lernen Sie eine Hochdurchsatz-Methode zur quantitativen Bestimmung der chronologischen Lebensdauer von Hefe durch Auswachsen gealterter Zellen. Dieses Verfahren ermöglicht die Messung der Zellviabilität im stationären Wachstum.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Diese Arbeit wurde vom NIH Grant 1R21AG031965-01A1 unterstützt. MK ist eine Ellison Medical Foundation New Scholar in Aging.

Teil 1: Vorbereitung der alternden Kulturen <ol><li> Streak-Stämmen von Interesse aus gefrorenen Beständen auf YEPD Agarplatten (1% Hefeextrakt, 2% Bacto-Pepton, 2% Agar, 2% Glucose). </li><li> Inkubieren Sie die Zellen bei 30 ˚ C für 48 Stunden oder bis einzelne Kolonien erscheinen. </li><li> Wählen Sie einzelne Kolonien und impfen in 5 ml YEPD flüssigen Medium (1% Hefeextrakt, 2% Bacto-Pepton, 2% Glucose) in Reagenzgläsern. </li><li> Wachsen Kulturen über Nacht bei 30 ˚ C unter Beibehaltung konstanter Bewegung entweder mit einem Shaker oder Bandage. </li><li> Impfen 5 ml synthetischen komplett (SC)-Medium (Tabelle 1) mit 50 ul der Übernacht-Kultur. In der Regel drei SC Kulturen sind für jeden Stamm zu dreifacher Ausfertigung biologische Replikation der Lebensdauer-Analyse für jeden Stamm untersucht bieten vorbereitet. </li><li> Pflegen Sie die Kulturen bei 30 ˚ C unter ständigem Rühren auf eine Bandage für das gesamte Experiment (in der Regel 2 Wochen oder mehr). </li></ol> Teil 2: Taking a Lebensfähigkeit Alter-Punkt Nach zwei Tagen der Kultur in SC Medien sollten die Zellen in der stationären Phase und das erste Lebensjahr-Punkt bereit ist, entnommen werden. Nachfolgende Alter-Punkte sollte jeder genommen werden 2-3 Tage bei einem Mindestaufenthalt von zwei Wochen. Für jedes Alter Punkt: <ol><li> Bereiten Sie die Bioscreen 100-und Honeycomb-Platten für die Impfung durch das Ausfüllen jedes Well mit 145 ul der YEPD. Achten Sie darauf, mindestens ein gut gefüllt mit nur YEPD und keine Zellen für die Datenanalyse später verlassen. </li><li> Entfernen Sie den alternden Kulturen aus dem Inkubator. </li><li> Kurz Wirbel die erste Kultur, in die Wabenplatte geimpft werden, während sie darauf, dass keine der Kultur zu verschütten. </li><li> Entfernen 5 ul der Mischkultur und Pipette in das erste Bohrloch des Honeycomb Platte. Flamme der Mündung jedes Reagenzglas vor und nach dem Entfernen der 5 ul-Aliquot. </li><li> Wiederholen Sie diesen Vorgang für jeden alternden Kultur sicher zu sein, die gut zu positionieren, die der jeweiligen Kultur zur Kenntnis. Identisch auch Positionen sollten für jede nachfolgende Alter-Punkt während des gesamten Experiments verwendet werden. </li><li> Ersetzen Sie die Kulturen in den 30 ˚ C Inkubator, wenn sie mit den Impfungen abgeschlossen. </li></ol> Teil 3: Laden der Bioscreen C MBR-Maschine <ol><li> Expose des Inkubators Fach durch Anheben des Deckels und entfernen Sie die Abdeckung der Probenteller. </li><li> Legen Sie die neu geimpft Honeycomb Platte in Probenteller (verwenden Sie den linken Steckplatz, wenn Sie nur zu lesen sind eine Platte). </li><li> Setzen Sie den Deckel auf die Probenteller und senken Sie den Deckel in den Inkubator Fach. </li><li> Überprüfen Sie, ob der Wärmeträgerflüssigkeit wird über der minimalen Füllstand. Wenn niedrig, fügen Sie mehr mit einem 1000 ul Pipette mit dem Wärmeträger zur Verfügung gestellt. </li><li> Mit dem Bioscreen Software &quot;EZExperiment&quot;, die folgenden Parameter, um geeignete Wachstumskurven für Saccharomyces cerevisiae erhalten: <ul><li> Anzahl der Proben: Geben Sie die Anzahl der Brunnen mit den Medien oder 200 </li><li> Filter: 420-580nm, Wideband </li><li> Temperatur: 30 ˚ C </li><li> Experiment Dauer: 1 Tag, 0 Stunden, 0 Sekunden </li><li> Messintervall: 30 Minuten </li><li> Shaking: On, kontinuierlichem Schütteln, High </li></ul></li><li> Klicken Sie auf &quot;Start&quot; zu Lesungen beginnen. </li></ol> Teil 4: Data Analysis In der Regel sind sechs alters-Punkte im Laufe von zwei Wochen aufgenommen. Das Alter-Punkte sind an den Tagen 2, 4, 6, 9, 11 und 13 übernommen. Abhängig von der Versuchsplanung und-Stämme getestet, kann es wünschenswert sein Alter-Punkte mehr oder weniger häufig oder für länger als 2 Wochen dauern. Es ist wichtig, die Wabenplatte in der gleichen Reihenfolge laden für jedes Alter-Punkt, so dass jeder alternden Kultur auf die gleiche Position auch in jedem Alter-Punkt entspricht, wie dies zu machen Datenanalyse viel einfacher. <ol><li> Besorgen Sie sich die Output-Dateien aus dem Bioscreen C MBR Maschine. Die Software &quot;EZExperiment&quot; ausgegeben der Bioscreen Daten als tab-getrennte Datei, die kompatibel mit Microsoft Excel sowie andere Software ist. Die erste Spalte zeigt an, wann der OD-Messung wurde während des Experiments genommen, mit folgenden Spalten repräsentieren jeweils auch in der Bioscreen Honeycomb-Platten (Abbildung 1). </li><li> Löschen Sie die erste OD Lesung aus jeder Spalte. Diese Lesart ist &quot;Rauschen&quot;. </li><li> Normalisieren der Daten durch Subtraktion der OD-Wert des Brunnens mit allein von allen OD-Werten in jeder Spalte YEPD. Dadurch wird der Hintergrund Absorption durch die Medien. </li><li> Plot der Auswuchs Kurven. Die Kurven werden als Funktion des Alters (Abb. 2) zu verlagern. Zum Beispiel, indem man die Folge Kurven aus Spalte 1 (gut 1 des Honeycomb-Platte) in den sechs Zeitpunkten, gibt es eine deutliche Rechtsverschiebung der Kurven über die Zeit. </li><li> Berechnen Sie die Verdoppelungszeit (δ) für jeden gut auf die Wachstumskinetik des Tages 2 Alter-Punkt-Basis. Die Gleichung zur Verdopplungszeit berechnen is: <img src="/files/ftp_upload/1156/equat.png" alt="Gleichung" /> wo OD 1 und OD 2 aufeinanderfolgenden OD-Messungen und t 1 und t 2 wird die Zeit zwischen den Messungen darstellen. Berechnen Verdoppelungszeiten nur zwischen OD-Werten von 0,2 bis 0,5. Der Durchschnitt dieser Werte ist die Verdoppelung Zeit für so gut. Berechnen Verdoppelungszeiten nur zwischen OD-Werten von 0,2 bis 0,5. Der Durchschnitt dieser Werte ist die Verdoppelung Zeit für so gut. Die meisten Wildtyp-Hefestämme sollte eine Verdoppelung der Zeit-Wert zwischen 85 bis 90 Minuten. </li><li> Für jedes Alter-Punkt, berechnen Sie die Zeitverschiebung (At) in das Auswachsen Kurven gegenüber der ursprünglichen Zeit-Punkt (Tag 2). Eine einfache Möglichkeit, dies zu tun ist, um den Unterschied in der Länge der Zeit, für jeden gut fand zu einer OD von 0,3 zwischen dem ersten Lebensjahr-Punkt und jedes weitere Lebensjahr-Punkt erreichen zu bestimmen. Die Zeit, die ein bestimmtes gut einer OD von 0,3 erreicht werden können aus der linearen Regressionsgleichung entspricht ln (OD) als Funktion der Zeit zwischen den beiden Zeitpunkten Bracketing OD = 0,3 berechnet werden. </li><li> Berechnen Sie den Bruchteil überlebt in jedem Alter-Punkt, um ein Überleben Kurve (Abbildung 3) zu generieren. Definieren Sie den ersten Jahren-Punkt (Tag 2) zu 100% Lebensfähigkeit werden. Für jeden weiteren Alters-Punkt-Berechnung der prozentualen Überlebensrate nach der Gleichung: <img src="/files/ftp_upload/1156/equat2.png" alt="Zweite Gleichung" width="245" height="115" /> wo s n das Überleben Prozentsatz ist, ist At n die Zeitverschiebung und δ n ist die Verdoppelung der Zeit. </li><li> Generieren Überlebenskurven (Abbildung 3B) als für jeden gut (oder replizieren Brunnen) gewünscht, indem die Fraktion (oder Prozent) der lebensfähigen Zellen als Funktion des Alters. </li><li> Berechnen Sie das Überleben Integral (SI) für jeden gut. SI ist als die Fläche unter der Kurve Überleben definiert und können durch die Formel abgeschätzt werden: <img src="/files/ftp_upload/1156/equat3.png" alt="Gleichung 3" width="400" height="79" /> wo Alter n ist das Alter-Punkt (zB 2, 4, 6, 9, 11 und 13) und s n ist das Überleben Wert in diesem Alter-Punkt. </li><li> Bestimmen Sie statistische Parameter replizieren Brunnen aus dem SI-und Überlebensdaten. Gemeinsamen statistischen Parameter von Interesse sind Mittelwert, Median, und die Varianz für jede Gruppe von biologischen repliziert. Ein t-Test oder ähnliche Analyse kann für paarweisen Vergleich der SI für verschiedene Versuchs-und Kontrollgruppen verwendet werden. Es kann auch wünschenswert sein, Überlebenskurven, wie in 4.8 von durchschnittlich biologischen Replikate beschrieben generieren. </li></ol> Teil 5: Repräsentative Ergebnisse Nach Beendigung des Versuchs, haben Sie geplottet das Überleben Kurve und durchgeführt Datenanalyse ausreichen, um die chronologische Hautalterung Potenzial für verschiedene Stämme oder Bedingungen zu bestimmen. Wenn korrekt durchgeführt, sollte die Wachstumskurven von der Bioscreen C MBR Maschine erhalten ähnlich aussehen wie die in Abbildung 2 dargestellt und die daraus resultierenden Überlebenskurven sollten diese in Abbildung 3 dargestellt aussehen. Im Allgemeinen wird Wildtyp-Zellen unter den hier beschriebenen Bedingungen kultiviert eine mediane chronologischen Lebensdauer in der Größenordnung von 7 Tagen. Erhebliche Unterschiede in der Überlebensrate in verschiedene Stämme und unter bestimmten Bedingungen, wie Wachstum in 0,05% Glucose Medien beobachtet wird, kann mediane Überlebenszeit 30 Tage überschreitet. <img src="/files/ftp_upload/1156/1156fig1.png" alt="" /> Abbildung 1. Datenausgabe aus dem Bioscreen Programm &quot;EZExperiment&quot;. Spalte A zeigt die Uhrzeit an, einen Absorptionswert wurde. Sukzessive Säulen stellen die Vertiefungen der Honeycomb-Platte mit Zellen altern Kulturen entnommen geimpft. <img src="/files/ftp_upload/1156/1156fig2.png" alt="" /> Abbildung 2. Outgrowth Kurven aus einer biologischen replizieren sich im Laufe eines Experiments. Es gibt eine deutliche Verschiebung in den Kurven über die Zeit als Zellen in der alternden Kultur zu verlieren Lebensfähigkeit. Die Länge der Zeit zwischen dem ersten Zeitpunkt (Tag 2) und einer sukzessiven Zeitpunkt bestimmt Lebensfähigkeit zu diesem bestimmten Alter. <img src="/files/ftp_upload/1156/1156fig3a.png" alt="" /><img src="/files/ftp_upload/1156/1156fig3b.png" alt="" /> Abbildung 3. A) Ein Überleben Kurve erzeugt mit der Folge von Daten aus Abbildung 1. Der Tag 2 Zeitpunkt wird als 100% Lebensfähigkeit Punkt zu setzen. B) Final Überlebenskurven der beiden Stämme in das gleiche Experiment getestet. Diese Überlebenskurven repräsentieren die durchschnittliche Bewohnbarkeit von drei biologischen Wiederholungen für jede Anstrengung. Fehlerbalken stellen die Standardabweichung innerhalb biologischer repliziert. Die schraffierte Fläche unter der Kurve stellt das Überleben des Überlebens Integral (SI) für DMS 1. <table border="1"><tbody><tr><td colspan="2"> Tabelle 1. Synthetische definierten Mediums für chronologischer Alterung Studien verwendet (Stamm background BY4743) </td></tr><tr><td> Komponente </td><td> Konzentration (g / L) </td></tr><tr><td> D-Glucose </td><td> 20 </td></tr><tr><td> Hefestickstoffbase (-AA/AS) </td><td> 1,7 </td></tr><tr><td> (NH 4) 2 SO 4 </td><td> 5,0 </td></tr><tr><td> Adenin </td><td> 0,04 </td></tr><tr><td> L-Arginin </td><td> 0,02 </td></tr><tr><td> L-Asparaginsäure </td><td> 0,1 </td></tr><tr><td> L-Glutaminsäure </td><td> 0,1 </td></tr><tr><td> L-Histidin </td><td> 0,1 </td></tr><tr><td> L-Leucin </td><td> 0,3 </td></tr><tr><td> L-Lysin </td><td> 0,03 </td></tr><tr><td> L-Methionin </td><td> 0,02 </td></tr><tr><td> L-Phenylalanin </td><td> 0,05 </td></tr><tr><td> L-Serin </td><td> 0,375 </td></tr><tr><td> L-Threonin </td><td> 0,2 </td></tr><tr><td> L-Tryptophan </td><td> 0,04 </td></tr><tr><td> L-Tyrosin </td><td> 0,03 </td></tr><tr><td> L-Valin </td><td> 0,15 </td></tr><tr><td> Uracil </td><td> 0,1 </td></tr></tbody></table> Hinweis: Dieses Rezept macht Auxotrophien in diploiden BY4743 Belastung. Aminosäure Auxotrophien sollte, indem ein 5fach-Endkonzentration der synthetischen Vollmedium kompensiert werden.

<ol><li>Steinkraus, K. A., Kaeberlein, M., Kennedy, B. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Replicative+aging+in+yeast%3A+the+means+to+the+end%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Cell+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Replicative aging in yeast: the means to the end.</a> Annu Rev Cell Dev Biol. 24, 29(2008).</li>
<li>Kaeberlein, M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aKaeberlein%2C+M+%22Handbook+of+models+for+human+aging%22">Handbook of models for human aging</a>. Conn, P. M. , Elsevier Press. Boston. 109(2006).</li>
<li>Fabrizio, P., Longo, V. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+chronological+life+span+of+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Aging+Cell%22%5BJournal%5D)">The chronological life span of Saccharomyces cerevisiae.</a> Aging Cell. 2 (2), 73(2003).</li>
<li>Murakami, C. J., Burtner, C. R., Kennedy, B. K., Kaeberlein, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+method+for+high-throughput+quantitative+analysis+of+yeast+chronological+life+span%5BTitle%5D)+AND+%22J+Gerontol+A+Biol+Sci+Med+Sci%22%5BJournal%5D)">A method for high-throughput quantitative analysis of yeast chronological life span.</a> J Gerontol A Biol Sci Med Sci. 63 (2), 113(2008).</li>
<li>Piper, P. W., Harris, N. L., MacLean, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preadaptation+to+efficient+respiratory+maintenance+is+essential+both+for+maximal+longevity+and+the+retention+of+replicative+potential+in+chronologically+ageing+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Mech+Ageing+Dev%22%5BJournal%5D)">Preadaptation to efficient respiratory maintenance is essential both for maximal longevity and the retention of replicative potential in chronologically ageing yeast.</a> Mech Ageing Dev. 127 (9), 733(2006).</li>
<li>Fabrizio, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Superoxide+is+a+mediator+of+an+altruistic+aging+program+in+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Superoxide is a mediator of an altruistic aging program in Saccharomyces cerevisiae.</a> J Cell Biol. 166 (7), 1055(2004).</li>
</ol>

Die High-Throughput-chronologische Lebensspanne beschriebene Assay ist hier eine effektive Methode zur Quantifizierung der Alterungspotential einer großen Zahl von Stämmen mit hoher Genauigkeit und Präzision. Der primäre Voraus dieser Methode gegenüber klassischen Methoden zur Bestimmung der Überlebenszeit durch Zählen Kolonie-bildenden Einheiten (siehe z. B. 3) ist die Verwendung eines Shakers / Inkubator / Platte Lesegerät wie dem Bioscreen C MBR-Maschine mit hoher Auflösung Wachstumskurven bei erhalten jed...

<table><tbody><tr><td>Bacto-Pepton</td><td>Reagenz</td><td>BD Biosciences</td><td>211677</td><td></td></tr><tr><td>Bacto-Hefeextrakt</td><td>Reagenz</td><td>BD Biosciences</td><td>288620</td><td></td></tr><tr><td>Difco-Agar</td><td>Reagenz</td><td>BD Biosciences</td><td>214530</td><td></td></tr><tr><td>Hefestickstoffbase ohne A.A. und A.S.</td><td>Reagenz</td><td>MidSci</td><td>J630-500G</td><td></td></tr><tr><td>Aminosäuren</td><td>Reagenz</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ammoniumsulfat</td><td>Reagenz</td><td>Spectrum</td><td>AM185</td><td></td></tr><tr><td>Dextrose</td><td>Reagenz</td><td>Fisher Scientific</td><td>D16-10</td><td></td></tr><tr><td>Bioscreen C MBR-Gerät</td><td>Werkzeug</td><td>Growth Curves USA</td><td>5101370</td><td></td></tr><tr><td>Bioscreen 100-Loch-Honeycomb-Platte</td><td>Werkzeug</td><td>Growth Curves USA</td><td>9502550</td><td></td></tr></tbody></table>

die quantifizierung der hefe chronologisches life span durch auswachsen von gealterten zellen

Quantifying Yeast Chronological Life Span by Outgrowth of Aged Cells

Die Bierhefe<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em&gt; Hat sich als wichtiger Modellorganismus auf dem Gebiet der Alternsforschung werden<sup&gt; 1</sup&gt;. Die replikativen und chronologische Lebensspanne gibt zwei etablierte Paradigmen zur Untersuchung Altern in Hefe. Replikativen Altern ist wie die Zahl der Tochterzellen einer Hefe Mutter Zelle produziert, bevor Seneszenz definiert; chronologischer Alterung wird durch die Länge der Zeit-Zellen definiert werden kann in einer nicht-teilenden, Ruhe-ähnlichen Zustand zu überleben<sup&gt; 2</sup&gt;. Wir haben einen High-Throughput-Verfahren zur quantitativen Messung des zeitlichen Lebensdauer entwickelt. Dieses Verfahren beinhaltet Alterung der Zellen in einem definierten Medium unter Rühren und bei konstanter Temperatur. An jedem Alter-Punkt, ist ein Sub-Population von Zellen aus der Alterung der Kultur entnommen und geimpft in Rich-Wachstumsmedium. Ein hochauflösendes Wachstumskurve wird dann für diese Subpopulation von gealterten Zellen mit einem Bioscreen C MBR-Maschine erhalten. Ein Algorithmus wird dann angewendet, um den relativen Anteil der lebenden Zellen in den einzelnen Sub-Population auf die Wachstumskinetik in jedem Alter-Punkt zu ermitteln. Diese Methode erfordert wesentlich weniger Zeit und Ressourcen im Vergleich zu anderen chronologischen Lebensdauer Assays unter Beibehaltung Reproduzierbarkeit und Präzision. Die High-Throughput-Natur dieses Tests sollte für eine groß angelegte genetische und chemische Bildschirme ermöglichen es, neue Langlebigkeit Modifikatoren für weitere Tests in immer komplexeren Organismen zu identifizieren.

Chronologischer Alterung in Hefe bezieht sich auf den Verlust der Lebensfähigkeit der Zellen mit der Zeit in der stationären Phase assoziiert. Hier beschreiben wir eine High-Throughput-Verfahren zur quantitativen Bestimmung Hefe chronologische Lebensspanne.

Die Quantifizierung der Hefe Chronologisches Life Span durch Auswachsen von gealterten Zellen

Die Sprosshefe Saccharomyces cerevisiae hat sich als ein wichtiger Modellorganismus auf dem Gebiet der Alternsforschung erwiesen 1. Die replikative und ...

Alternde Kulturen werden in Reagenzgläsern bei 30 Grad Celsius mit konstanter Agitation gepflegt. Bio, A Rolltrommel, ein Aliquot von Zellen aus jeder alternden Kultur wird in ein Well einer Bio-Scan-Honeycomb-Platte, die YEPD-Medium enthält, eingeseedet. Die Bio-Scan-CMBR-Maschine inkubiert und schüttelt die Honeycomb-Platte 24 Stunden lang, während sie die optische Dichte jedes Wells misst.Alle 30 Minuten können Wachstumskurven aus den Ausgabedaten des Bio-Screens erstellt werden, die zur Berechnung der Lebensfähigkeit jeder alternden Kultur verwendet werden können. Nach der 24-stündigen Inkubation können die Zelldichten in den Vertiefungen der Honigwabenplatte je nach Lebensfähigkeit der ursprünglichen alternden Kultur variieren. Hallo, ich bin Chris Murakami aus dem Labor von Dr. Matt Capline und der Abteilung für Pathologie an der University of Washington.Heute zeigen wir Ihnen das Verfahren zur Quantifizierung der chronologischen Lebensspanne von Hefezellen mithilfe des Auswachsens alter Zellen. In unserem Labor verwenden wir dieses Verfahren, um zu untersuchen, wie genetische und umweltbedingte Faktoren die Lebensdauer von Hefe beeinflussen. Beginnen wir also.Um alternde Kulturen vorzubereiten, streichen Sie zunächst Hefestämme von gefrorenen Kulturen auf YEPD-Agarplatten und inkubieren die Zellen 48 Stunden bei 30 °C, bis Einzelkolonien sichtbar werden. Sobald Einzelkolonien erschienen sind, pflücken Sie einzelne Kolonien aus und impfen sie in fünf Milliliter YEPD-Flüssigmedium an.In Reagenzgläsern kultivieren Sie die Ansätze über Nacht bei 30 Grad Celsius in einer Rollvorrichtung, um eine konstante Bewegung aufrechtzuerhalten. Nach der Übernachtkultivierung impfen Sie jeweils 50 Mikroliter jeder Kultur in fünf Milliliter synthetisches komplettes Medium. Im Allgemeinen werden drei SC-Kulturen pro Stamm angelegt, um eine dreifache biologische Wiederholung der Lebensdaueranalyse für jeden untersuchten Stamm zu gewährleisten. Führen Sie die Kulturen während des gesamten Experiments bei 30 Grad Celsius mit konstanter Bewegung in der Rollvorrichtung, was gewöhnlich zwei oder mehr Wochen nach zwei Tagen Kultivierung beträgt.In SC-Medium sollten sich die Zellen in einer stationären Phase befinden, und der erste Alterszeitpunkt ist bereit zur Entnahme. Nachfolgende Alterszeitpunkte sollten mindestens zwei Wochen lang alle zwei bis drei Tage entnommen werden. Um dieses Verfahren zu beginnen, bereiten Sie das Bio-Screen vor.100-Loch-Kammplatten für die Inokulation, wobei jedes Loch mit 145 µL YEPD gefüllt wird. Stellen Sie sicher, dass mindestens ein Loch nur mit YEPD und ohne Zellen gefüllt bleibt, um später eine Datenanalyse durchführen zu können. Entfernen Sie die alternden Kulturen aus dem Inkubator.Kurz gesagt, wirbeln Sie die erste Kultur, die in die Honigwabenplatte eingeseedet werden soll. Achten Sie darauf, dass keine Kultur verschüttet wird. Flammen Sie den Mund des Reagenzglases ab und entnehmen Sie fünf Mikroliter der Kultur. Pipettieren Sie diese in das erste Loch der Honigwabenplatte.Vergessen Sie nicht, den Rand des Reagenzglases abzuflämmen. Nachdem Sie die fünf Mikroliter-Aliquotprobe entnommen haben, wiederholen Sie diesen Inokulationsvorgang für jede alternde Kultur. Achten Sie darauf, die Vertiefungsposition jeder Kultur genau zu dokumentieren.Die Brunnenpositionen sollten für jeden nachfolgenden Alterszeitpunkt während des gesamten Experiments verwendet werden. Stellen Sie die Kulturen in den 30 Grad Celsius warmen Inkubator zurück. Sobald die Inokulationen abgeschlossen sind und die Kulturen in die Honigwabenplatte überführt wurden, wird die Platte in die Bio-Screen-CMBR-Maschine eingelegt.Öffnen Sie hierzu das Inkubatorfach, indem Sie den Deckel anheben. Entfernen Sie anschließend die Abdeckung der Probenschale. Setzen Sie die frisch beimpfte Honigwabenplatte in die Probenschale ein.Verwenden Sie den linken Schlitz. Wenn Sie nur eine Platte auslesen, setzen Sie die Abdeckung des Probentabletts wieder auf und senken Sie den Deckel des Inkubatorfachs ab. Es ist wichtig sicherzustellen, dass sich die Wärmeübertragungsflüssigkeit über dem minimalen Füllstand befindet.Falls nicht, fügen Sie mehr Wärmeträgerflüssigkeit mit einer 1000-Mikroliter-Pipette hinzu. Verwenden Sie die Bio-Screen-Software Easy Experiment. Stellen Sie die folgenden Parameter ein, um geeignete Wachstumskurven für croce visi zu erhalten. Geben Sie bei der Anzahl der Proben die Anzahl der Vertiefungen mit Medium oder 200 ein, und stellen Sie den Filter auf einen Bereich von vier 20 bis fünf 80 Nanometern Breite ein.Stellen Sie die Temperatur auf 30 Grad Celsius ein. Die Versuchsdauer sollte ein Tag, null Stunden, null Sekunden betragen. Das Messintervall sollte 30 Minuten betragen.Und schließlich sollte die Schüttelung auf kontinuierliches Schütteln eingestellt und mit „High Click Start“ begonnen werden, um die Messungen zu starten. Gewinnen Sie die Ausgabedateien aus der Bio Screen CMBR-Maschine. Die Easy Experiment-Software gibt die Bio Screen-Daten als tabulatorgetrennte Datei aus, die mit Microsoft Excel und anderer Software kompatibel ist.Die erste Spalte, Spalte A, zeigt die Zeitpunkte, zu denen die OD-Messungen während des Experiments durchgeführt wurden. Die nachfolgenden Spalten repräsentieren jeweils eine Vertiefung der BioScreen-Honeycomb-Platte, die mit Zellen aus den alternden Kulturen beimpft wurden. Löschen Sie die erste OD-Aufnahme aus jeder Spalte, da diese Messung Rauschen darstellt.Normalisieren Sie die Daten, indem Sie den optischen Dichtewert der Vertiefung mit YEPD allein von den optischen Dichtewerten jeder Spalte subtrahieren. Dadurch wird die Hintergrundabsorption des Mediums entfernt. Die Wachstumskurven.Die Kurven verschieben sich in Abhängigkeit vom Alter; beispielsweise ergibt die Darstellung der Auswachstumskurven aus Spalte eins, Reihen eins der Wabentiterplatte über die sechs Zeitpunkte eine deutliche Rechtsverschiebung der Kurven im Zeitverlauf. Die Zeitspanne zwischen dem Anfangszeitpunkt, Tag zwei, und einem nachfolgenden Zeitpunkt bestimmt die Lebensfähigkeit in diesem bestimmten Alter. Berechnen Sie die Verdopplungszeit für jede Vertiefung basierend auf der Wachstumskinetik des Zeitpunkts Tag zwei.Die zur Berechnung der Verdopplungszeit verwendete Gleichung sieht folgendermaßen aus, wobei OD eins und OD zwei aufeinanderfolgende Messungen der optischen Dichte darstellen und T eins und T zwei die Zeit zwischen den Messungen angeben. Berechnen Sie die Verdopplungszeiten nur zwischen OD-Werten von 0,2 und 0,5. Der Mittelwert dieser Werte ist die Verdopplungszeit dafür.Nun, die meisten Wildtyp-Hefe-Stämme sollten für jeden Alterszeitpunkt einen Verdopplungszeitwert zwischen 85 und 90 Minuten aufweisen. Berechnen Sie die Zeitverschiebung Delta T in den Wachstumskurven relativ zum anfänglichen Alterszeitpunkt, also Tag zwei. Eine einfache Methode hierfür besteht darin, die Differenz der Zeitspanne zu ermitteln, die jeder Kolben benötigte, um zwischen dem anfänglichen Alterszeitpunkt und jedem nachfolgenden Alterszeitpunkt eine OD von 0,3 zu erreichen.Der Zeitpunkt, zu dem ein bestimmter Well einen OD-Wert von 0,3 erreicht hat, kann anhand der linearen Regressionsgleichung berechnet werden, die dem natürlichen Logarithmus der optischen Dichte entspricht. Berechnen Sie den Anteil der Überlebenden an jedem Alterszeitpunkt, um eine Überlebenskurve zu erstellen, wobei der Ausgangszeitpunkt am zweiten Tag 100 % Überlebensfähigkeit für jeden nachfolgenden Alterszeitpunkt darstellt. Berechnen Sie die Überlebensrate in Prozent anhand der folgenden Gleichung.Dabei ist SN die Überlebensrate, Delta TN die Zeitverschiebung und Sigma N die Verdopplungszeit. Erstellen Sie entsprechend gewünscht Überlebenskurven für jede dieser Größen.Indem man den Anteil lebensfähiger Zellen in Abhängigkeit vom Alter aufträgt, berechnet man das Überlebensintegral für jedes Probenglas; das Überlebensintegral (SI) ist als die Fläche unter der Überlebenskurve definiert und kann mithilfe dieser Formel geschätzt werden, wobei Alter N den Zeitpunkt und SN den entsprechenden Überlebenswert an diesem Zeitpunkt darstellt. Es werden statistische Parameter aus den SI- und Überlebensdaten der replizierten Proben ermittelt. Zu den gängigen statistischen Parametern zählen Mittelwert, Median und Varianz für jeden Satz biologischer Replikate. Ein T-Test oder eine ähnliche Analyse kann für den paarweisen Vergleich der SI-Werte zwischen verschiedenen experimentellen und Kontrollgruppen verwendet werden.Es kann ebenfalls sinnvoll sein, Überlebenskurven aus dem Durchschnitt biologischer Replikate zu erstellen. Am Ende des Experiments haben Sie die Überlebenskurve dargestellt und eine ausreichende Datenanalyse durchgeführt, um das chronologische Alterungspotential mehrerer verschiedener Stämme oder Bedingungen zu bestimmen. Falls das Experiment korrekt durchgeführt wurde, sollten die Wachstumskurven, die aus dem BioScreen CMBR-Gerät stammen, dieser Kurve ähnlich sehen. Im Allgemeinen weisen Wildtyp-Zellen, die unter den hier beschriebenen Bedingungen kultiviert wurden, eine mediane chronologische Lebensspanne in der Größenordnung von sieben Tagen auf.Bei verschiedenen Stämmen wird eine erhebliche Variation der Überlebensdauer beobachtet, und unter bestimmten Bedingungen, wie dem Wachstum in Medium mit 0,05 % Glukose, kann die mediane Überlebensdauer mehr als 30 Tage überschreiten. Wir haben Ihnen soeben eine Hochdurchsatzmethode zur quantitativen Bestimmung der chronologischen Lebensdauer der Hefe gezeigt. Croce visier.Es ist wichtig zu beachten, dass bei Durchführung dieses Verfahrens die regelmäßige Wartung des Bio Screen CMBR-Geräts sowohl für reproduzierbare Daten als auch für die Genauigkeit entscheidend ist. Das war's. Viel Erfolg bei Ihren Experimenten.

quantifying-yeast-chronological-life-span-by-outgrowth-of-aged-cells

Research

Forschung

JoVE Journal

Biology

Biologie

In diesem Artikel präsentieren wir ein allgemeines Protokoll zur Messung der replikativen Lebensspanne von Hefe Mutter-Zellen.

Mess-replikative Lebensspanne in der Hefe

Hier beschreiben wir eine Reihe von DNA Mutationsassays, dass mit der Hefe chronologische Lebensspanne Modell, um die Gene / Wege, oder regeln dazu beitragen, genomische DNA Instabilität während des Alterns Studie kombiniert werden können.

Studieren Altersabhängige genomische Instabilität mit der S. cerevisiae Chronologisch Lebensdauer Modell

Wir beschreiben hier den Betrieb einer mikrofluidischen Vorrichtung, die eine kontinuierliche und hochauflösende mikroskopische Bildgebung einzelner knospenden Hefezellen ermöglicht während ihres kompletten replikativen und / oder chronologischer Lebensdauer.

Kontinuierliche Hochauflösende mikroskopische Beobachtung Replikative Aging in Bäckerhefe

Mutationsraten bei jungen Saccharomyces cerevisiae Zellen durch Fluktuation Tests gemessen werden zur Mutationshäufigkeiten für Mutterzellen der verschiedenen replikativen Alter vorherzusagen. Magnetische Sortierung und Durchflusszytometrie werden dann verwendet, um tatsächliche Mutationshäufigkeiten und Alter der Mutter Zellen zu messen, um Abweichungen von der erwarteten Mutationsfrequenzen zu ermitteln.

Die Kombination von Magnet Sortierung der Mutterzellen und Fluktuation Tests zu Genominstabilität Während mitotischen Zellalterung in Analysieren Saccharomyces cerevisiae

Dieser Artikel stellt ein Protokoll für die Herstellung von Mikrofluidik-Chips und der Aufbau von mikrofluidischen Experimenten optimiert, um die Lebensdauer und zellulären Phänotypen einzelner Hefezellen zu messen.

Mikrofluidik-Geräte mit Measure Lebensdauer und Cellular Phänotypen in Einzel Budding Hefezellen

Wir stellen eine Methode zur Quantifizierung von Wachstumsphänotypen einzelner Hefezellen dar, da sie in festen Medien unter Verwendung der Zeitraffer-Mikroskopie in Kolonien aufwachsen, die als eine zellige Verdopplungsbewertung von lebenden Arrays von Hefe (ODELAY) bezeichnet werden. Die Populations-Heterogenität von genetisch identischen Zellen, die zu Kolonien wachsen, kann direkt beobachtet und quantifiziert werden.

ODELAY: Eine groß angelegte Methode für die Mehrparameter-Quantifizierung des Hefewachstums

Hier präsentieren wir ein Protokoll, um die Atemwege und fermentativen Stoffwechsel durch den Einbau des exponentiellen Wachstums von Saccharomyces Cerevisiae exponentielles Wachstum Gleichung zu schätzen. Berechnung der kinetischen Parameter kann für das Screening der Einflüsse der Stoffe/Verbindungen auf Gärung oder mitochondriale Atmung.

Saccharomyces cerevisiae Exponentielles Wachstum Kinetik in Batch-Kultur, Atem- und fermentativen Stoffwechsel analysieren

Hier stellen wir eine MATLAB-Implementierung des automatisierten Nachweises und der quantitativen Beschreibung von Lipidtröpfchen in Fluoreszenzmikroskopiebildern von Spalt- und angehenden Hefezellen vor.

Analyse des Lipidtröpfchengehalts in Spalt- und Budding-Hefen mittels automatisierter Bildverarbeitung

Hier ist ein Protokoll, um genetische Wechselwirkungen durch eine erhöhte Kopierzahl Suppressor-Bildschirm in Saccharomyces cerevisiaezu identifizieren. Diese Methode ermöglicht es Forschern, Suppressoren in kurzlebigen Hefemutanten zu identifizieren, zu klonen und zu testen. Wir testen den Effekt der Erhöhung der Kopierzahl von SIR2 auf die Lebensdauer in einem autophagy null Mutant.

Ein Suppressor-Bildschirm zur Charakterisierung genetischer Links, die die chronologische Lebensdauer in Saccharomyces cerevisiae regulieren

In diesem Artikel präsentieren wir ein allgemeines Protokoll zur Messung der Lebensdauer von Nematoden auf festen Medien mit UV-getötet bakterielle Lebensmittel erhalten.

Messung Caenorhabditis elegans Life Span auf festen Medien

Lernen Sie eine Hochdurchsatz-Methode zur quantitativen Bestimmung der chronologischen Lebensdauer von Hefe durch Auswachsen gealterter Zellen. Dieses Verfahren ermöglicht die Messung der Zellviabilität im stationären Wachstum.

Die Quantifizierung der Hefe Chronologisches Life Span durch Auswachsen von gealterten Zellen

Weitere Videos entdecken