Dendra2 Photoschalten durch die Mammary Imaging Fenster

Dieses Video veranschaulicht ein Protokoll, das mit der Injektion einer fluoreszierenden Proteine exprimierenden Tumorzelllinie in das Brustfettgewebe der Maus beginnt. Eine spezielle Kammer für die In-vivo-Bildgebung wird angefertigt und anschließend chirurgisch in das Tier implantiert, woraufhin Bildgebungsdaten gewonnen werden können. Hallo, ich bin Dr. Vic aus dem Labor von Dr. John Conde und Dr. Jeffrey Siegel des Biophotonics Center am Albert Einstein College of Medicine.

Heute zeigen wir Ihnen ein Verfahren zur intravitale Lichtschaltung und Bildgebung von DRA-zwei-markierten Krebszellen durch das Memory-Imaging-Fenster. Wir verwenden dieses Verfahren in unserem Labor, um den Einfluss der Tumormikroumgebung auf die Motilität von Tumorzellen zu untersuchen. Beginnen wir, unter Tragen von Latexhandschuhen.

Beginnen Sie mit der Herstellung des Brustdrüsendarstellungsfensters (MIW), indem Sie eine fünf bis zehn Zentimeter große Zellkulturschale erhitzen und durch Andrücken eines abgerundeten harten Gegenstands, beispielsweise eines ein Zoll großen Dremel-Aufsatzes, eine gewölbte Oberfläche erzeugen. Schneiden Sie die Mitte der Schale mit einer erhitzten Rasierklinge aus. Verwenden Sie nun einen kleinen kegelförmigen Dremel-Aufsatz, um in der Mitte der kuppelförmigen Kunststoffbasis ein Loch mit einem Durchmesser von sechs bis sieben Millimetern anzufertigen.

Schleifen Sie die Kanten der Kunststoffbasis mit dem Dremel und glätten Sie sie anschließend weiter mit einer Feile, um sie vollständig glatt zu machen. Feilen Sie die Oberseite der Kunststoffbasis, um eine ebene Fläche für den Glasdeckel herzustellen. Der Durchmesser der bearbeiteten flachen Fläche sollte neun bis zehn Millimeter betragen.

Als Nächstes kleben Sie die kreisförmige Glasscheibe mit acht Millimeter Durchmesser auf. Schlupfen Sie sie mit Sekundenkleber auf die flache Oberfläche und lassen Sie sie 15 Minuten trocknen. Erstellen Sie mit einer erhitzten 26-G-Nadel acht Vernähungslöcher, indem Sie von außen nach innen in den Boden stechen; die Löcher sollten gleichmäßig um die Scheibe herum verteilt sein.

Bewegen Sie die Deckglasabdeckung 0,5 bis einen Millimeter vom Rand des Deckglases weg. Waschen Sie das MIW mit entionisiertem Wasser und danach erneut mit 70 % Ethanol. Reinigen Sie das Glas mit einem Wattestäbchen, bis es vollständig transparent ist.

Verwenden Sie Aceton, um eventuelle verbliebene trübe Stellen des Kleberdampfs zu entfernen. Sterilisieren Sie die MIW abschließend, indem Sie sie auf jeder Seite drei Stunden lang UV-Licht aussetzen. Bevor die MIW eingesetzt wird, sollte sich im Bereich der vierten Brustwarze infolge der Injektion von Tumorzellen ein kleiner Tumor mit einem Durchmesser von fünf bis sieben Millimetern gebildet haben.

Im ersten Teil überprüfen Sie, ob der Tumor nicht sichtbar nekrotisch ist. Es sollte intakte Haut mit Haaren im umgebenden Bereich vorhanden sein. Bereiten Sie zunächst einen sterilen Bereich für die Operation vor, indem Sie ein Stück steriler Gaze innerhalb einer sterilen Haube auslegen.

Legen Sie ein Stück steriles Mulltuch in die Mitte und sammeln Sie die Gegenstände, die Sie für die Operation benötigen. Sie benötigen ein Paar kleine und ein Paar große Präparierscheren mit Feder, mikroskopische Präparationspinzetten und -zangen sowie eine Nadelhalterzange. Nachdem Sie die Maus mit 2,5 % Avertin anästhesiert haben, verwenden Sie einen Elektrorasierer für Kleintiere, um den Bereich über dem Tumor zu rasieren. Verwenden Sie eine Enthaarungscreme, um die restlichen Haare zu entfernen, und reinigen Sie die Haut.

Unter Verwendung von mit Ethanol getränkten Wattestäbchen. Das Tier auf die sterile Gaze überführen und einen Augensalbe auf die Augen auftragen, um Austrocknung und Infektionen zu verhindern. Die Haut mit Betadine sterilisieren und anschließend mit 70 % Ethanol reinigen.

Mit dem jährlichen und sterilen Operationsstoff ziehen Sie die Haut unmittelbar medial zur Brustwarze mit einer Pinzette und führen einen etwa zwei Millimeter langen Einschnitt. Trennen Sie das darunterliegende Brustfettgewebe von der Haut durch Dissektion mit Schere und Pinzette. Sobald es gelöst ist, dehnen sich Haut und Öffnung auf eine Größe, die das Einführen des MIW ermöglicht.

Platzieren Sie das MIW so ein, dass sich Haut über der Basis des MIW befindet, und nähen Sie es an Ort und Stelle. Verwenden Sie ein Gewebekleber oder Cyanoacrylat, um die Nahtlöcher zu verschließen und das MIW an der Haut zu befestigen. Das Tier sollte nun drei bis vier Tage lang zur Erholung bleiben, bevor die erste Bildgebungssitzung durchgeführt wird.

Zur Vorbereitung der Bildgebungssitzung kann die Bildgebungskammer beschrieben werden, um deren Nutzung zu ermöglichen. Betäuben Sie zunächst das Tier mit Isofluran und tragen Sie einen Augensalbe auf die Augen auf. Schließen Sie den Isofluran-Ablauf des Anästhesiegeräts an die Vorderseite der Bildgebungskammer an.

Außen an der Einlassöffnung. Befestigen Sie ein zweites Rohr an der Auslassöffnung der Abbildungskammer. Dieses Rohr sollte an den Gasfilter und anschließend an das Vakuum angeschlossen werden.

Als Nächstes stellen Sie das Tier so ab, dass die MIW nach unten zeigt. Halten Sie die Box fest und justieren Sie die unteren Türen so, dass die MIW-Basis zwischen ihnen gehalten und fixiert wird. Die MIW-Basis sollte sich auf derselben Höhe wie die Türen der Abbildungskammer befinden.

Während der MIW-Abdeckschieber nur wenige Millimeter unterhalb dieses Niveaus liegen sollte, stellen Sie sicher, dass die Positionierung des MIW zwischen den unteren Schiebetüren gewährleistet, dass der Abdeckschieber flach und parallel zu den unteren Türen der Box liegt. Dies ermöglicht eine korrekte Fokussierung und senkt das Mikroskopobjektiv, um Platz zu schaffen, um die Box auf den Mikroskopständer zu stellen. Justieren Sie den Ständer so, dass sich der MIW-Abdeckschieber über dem Objektiv befindet.

Wir können nun das Objektiv fokussieren und mit der Bildaufnahme beginnen. Das hier beschriebene Bildaufnahmeverfahren gilt für das konfokale Mikroskop Leica SP fünf und dient als Leitfaden, um das Experiment an einem bestimmten verwendeten Mikroskop zu optimieren. Beginnen Sie damit, den Tumor über das Okular mit einem grünen Fluoreszenzfilter zu beobachten.

Suchen Sie große Blutgefäße, die sichtbar durchströmt sind und in derselben Fokusebene flach liegen. Positionieren Sie eines der Gefäße in der Bildmitte und wechseln Sie zur PMT-Detektion. Wir werden die sequenzielle Aufnahme für zwei Kanäle einrichten.

Ein Kanal nutzt die 488-Nanometer-Laserlinie und erfasst die Streuung von der extrazellulären Matrix sowie die Emission der grünen Form von Dendra zwei. Der zweite Kanal verwendet die 543-Nanometer-Laserlinie und erfasst die Emission der roten Form von Dendra.Two. Sammeln Sie 3D-Bilder vor der photochemischen Umschaltung.

Verwenden Sie als Nächstes die Region-of-Interest-Scan-Funktion, um eine ausgewählte Zellpopulation mit der 405-Nanometer-Laserlinie photochemisch umzuschalten. Sammeln Sie die Emission der roten Form des Proteins, um den Umschaltvorgang zu überwachen. Erheben Sie nun mittels derselben Methode wie bei den präumschaltenden Bildern 3D-Bilddaten nach dem Umschalten.

In Ordnung, verwenden Sie eine Laserleistung von 20 % im UV-Bereich, um diesen Bereich in einen photochirurgischen Schalter umzuwandeln, und behandeln Sie mehr als eine Region im Tumor. Nehmen Sie anschließend Bilder durch die Okulare mit einer digitalen Kamera in beiden Kanälen, grün und rot, auf. Dies erleichtert die Orientierung während nachfolgender Bildgebungssitzungen. In diesem Bild erkennt man einen rechteckigen, photochirurgisch geschalteten Bereich, der senkrecht zum Blutgefäß ausgerichtet ist und keine Fluoreszenz aufweist.

Nicht umschaltbare Zellen erscheinen grün, während die Streuung durch die extrazelluläre Matrix violett ist. Die Aufnahme ist eine Projektion der maximalen Intensität aus vier Bildern entlang der Z-Achse. Wir haben Ihnen soeben gezeigt, wie man mittels des Gedächtnisbildfensters Zellen mit RA-Markierung umschaltet und abbildet.

Mithilfe dieses Verfahrens ist es wichtig, das Verhalten von Tumorzellen in verschiedenen Tumorarealen über mehrere Tage hinweg zu vergleichen. Das war's. Vielen Dank fürs Zuschauen und viel Erfolg bei Ihrem Experiment.